Name: fluorescence-based measurements of phosphatidylserine/phosphatidylinositol 4-phosphate exchange between membranes
Uploaded: 2021-03-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes at JoVE.com

Мы благодарны доктору А. Каттрисс за тщательную корректуру рукописи. Эта работа финансируется грантом Французского национального исследовательского агентства ExCHANGE (ANR-16-CE13-0006) и CNRS.

1. Очисткалакта NBD-C2
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя этот протокол подробно описывает использование разрушителя клеток для разрушения бактерий, он может быть модифицирован для использования других стратегий лизиса(например, французская пресса). В начале очистки в обязательно...

Результаты этих анализов напрямую зависят от сигналов флуоресцентных липидных датчиков. Таким образом, очистка этих зондов, помеченных в соотношении 1:1 с NBD и без свободного загрязнения флуорофором NBD, является критическим шагом в этом протоколе. Также в обязательном порядке проверяет?...

Точное распределение липидов между различными мембранами и внутри мембран эукариотических клеток1,2 имеет глубокие биологические последствия. Расшифровка того, как функционируют LFP, является важным вопросом в клеточной биологии3,4,5,6,и подходы in vitro имеют большое значение для решения этой проблемы7,8,9,10,11. Здесь представлена стратегия in vitro,основанная на флуоресценции, которая сыграла важную роль в установлении того, что несколько белков ОВП/Ош влияют на обмен PS/PI(4)P между клеточными мембранами12 и тем самым составляют новый класс ЛТП. PS представляет собой анионный глицерофосфолипид, который составляет 2-10% от общего количества мембранных липидов в эукариотических клетках13,14,16. Он распределяется по градиенту между ER и PM, где составляет 5-7% и до 30% глицерофосфолипидов соответственно17,18,19. Кроме того, PS по существу концентрируется в цитозольном листке ТЧ. Это накопление и неравномерное разделение PS в PM имеют решающее значение для клеточных сигнальных процессов19. Благодаря отрицательному заряду молекул PS, цитозольный листок PM гораздо более анионный, чем цитозольный листок других органелл1,2,19,20. Это позволяет рекрутировать с помощью электростатических сил сигнальные белки, такие как миритоилированный богатый аланином субстрат С-киназы (MARCKS)21,саркома (Src)22,вирусный онкоген саркомы Кирстен-крысы (K-Ras)23и связанный с Ras субстрат ботулинического токсина C3 1 (Rac1)24, которые содержат участок положительно заряженных аминокислот и липидный хвост.
PS также распознается обычной протеинкиназой C стереоселективным образом через домен C225. Однако PS синтезируется в ER26,что указывает на то, что он должен быть экспортирован в PM, прежде чем он сможет играть свою роль. Не было известно, как это было достигнуто19, пока не было обнаружено, что в дрожжах Osh6p и Osh7p переносят PS из ER в PM27. Эти LFP принадлежат к эволюционно сохраненной семье у эукариот, членом-основателем которых является OSBP и который содержит белки (ОВП у человека, Ошские белки в дрожжах), интегрируя связанный с OSBP домен (ORD) с карманом для размещения липидной молекулы. Osh6p и Osh7p состоят только из ОРД, структурные особенности которого адаптированы для специфическиго связывания ПС и переноса его между мембранами. Тем не менее, как эти белки направленно передавали PS из ER в PM, было неясно. Osh6p и Osh7p могут захватывать PI(4)P в качестве альтернативного липидного лиганда12. В дрожжах PI(4)P синтезируется из фосфатидилинозитала (PI) в Гольджи и PM с помощью PI 4-киназ, Pik1p и Stt4p соответственно. Напротив, в мембране ER нет PI(4)P, так как этот липид гидролизуется в PI фосфатазой Sac1p. Следовательно, градиент PI(4)P существует как на интерфейсах ER/Golgi, так и на интерфейсах ER/PM. Osh6p и Osh7p передают PS из ER в PM через обменные циклы PS/PI(4)P с использованием градиента PI(4)P, который существует между этими двумя мембранами12.
В течение одного цикла Osh6p извлекает PS из ER, обменивает PS на PI(4)P в PM и передает PI(4)P обратно в ER для извлечения другой молекулы PS. Osh6p / Osh7p взаимодействуют с Ist2p28, одним из немногих белков, которые соединяют и приводят мембрану ER и PM в непосредственное соседство друг с другом для создания контактных сайтов ER-PM в дрожжах29,30,31. Кроме того, ассоциация Osh6p с отрицательно заряженными мембранами становится слабой, как только белок извлекает один из своих липидных лигандов из-за конформационного изменения, которое изменяет его электростатические особенности32. Это помогает Osh6p, сокращая время пребывания мембраны, тем самым поддерживая эффективность его активности переноса липидов. В сочетании с привязкой к Ist2p этот механизм может позволить Osh6p/7p быстро и точно выполнять липидный обмен на интерфейсе ER/PM. В клетках человека белки ORP5 и ORP8 осуществляют обмен PS/PI(4)P в контактных местах ER-PM с помощью различных механизмов33. Они имеют центральный ORD, похожий на Osh6p, но непосредственно привязаны к ER через C-концевой трансмембранный сегмент33 и стыкуются с PM через N-концевую область гомологии Плекстрина (PH), которая распознает PI(4)P и PI(4,5)P233,34,35. ORP5/8 используют PI(4)P для передачи PS, и было показано, что ORP5/8 дополнительно регулируют уровни PI(4,5)P2 и, предположительно, модулируют сигнальные пути. В свою очередь, снижение уровней PI(4)P и PI(4,5)P2 снижает активность ORP5/ORP8, поскольку эти белки связываются с PM в зависимости от PIP. Аномально высокий синтез PS, который приводит к синдрому Ленца-Маевского, влияет на уровни PI(4)P через ORP5/836. Когда активность обоих белков блокируется, PS становится менее обильным в PM, снижая онкогенную способность сигнальных белков37.
И наоборот, сверхэкспрессия ОВП5, по-видимому, способствует инвазии раковых клеток и метастатическим процессам38. Таким образом, изменения активности ORP5/8 могут серьезно модифицировать клеточное поведение через изменения липидного гомеостаза. Кроме того, ORP5 и ORP8 занимают контактные участки ER-митохондрий и сохраняют некоторые митохондриальные функции, возможно, путем поставки PS39. Кроме того, ORP5 локализуется в местах контакта ER-липидных капель для доставки PS к липидным каплям путем обмена PS/PI(4)P40. Описанная в настоящем документе стратегия измерения (i) экстракции PS и PI(4)P из липосом и (ii) переноса PS и PI(4)P между липосомами была разработана для установления и анализа обменной активности PS/PI(4)P Osh6p/Osh7p12,32 и используется другими группами для анализа активности ORP5/ORP835 и других ЛТП10, 41г. Он основан на использовании флуоресцентного пластинчатого считывателя, стандартного спектрофлуфультометра L-формата и двух флуоресцентных датчиков, NBD-C2Lact и NBD-PHFAPP,которые могут обнаруживать PS и PI(4)P соответственно.
NBD-C2Lact соответствует домену C2 гликопротеина, лактадхерина, который был реконтруирован, чтобы включить уникальный цистеин, подвергающийся воздействию растворителя, вблизи предполагаемого места связывания PS; чувствительный к полярности ФБД (7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол) флуорофор ковалентно связан с этимостатком (рисунок 1А)12. Чтобы быть более точным, домен C2 лактадерина (Bos taurus, UniProt: Q95114, остатки 270-427) был клонирован в вектор pGEX-4T3 для экспрессии в слиянии с глутатион S-трансферазой (GST) в Escherichia coli. Затем последовательность C2Lact мутировали, чтобы заменить два доступных растворителями остатка цистеина (C270, C427) остатками аланина и ввести остаток цистеина в область вблизи предполагаемого ps-сайта связывания (мутация H352C), которая впоследствии может быть помечена N,N'-диметил-N-(йодоацетил)-N'-(7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4-ил)этилендиамином (IANBD) 12. Участок расщепления тромбина присутствует между белком GST и N-концем домена C2. Основным преимуществом является то, что этот домен выборочно распознает PS в Ca2+-независимом порядке, в отличие от других известных доменов C2 или Annexin A542. NBD-PHFAPP получен из домена PH человеческого четырехфосфат-адапторного белка 1 (FAPP1), который был реинжининерирован для включения одного цистеина, подвергающегося воздействию растворителя, который может быть помечен группой NBD вблизи сайта связывания PI(4)P(рисунок 1A)43. Нуклеотидная последовательность домена PH человеческого белка FAPP (UniProt: Q9HB20, сегмент [1-100]) была клонирована в вектор pGEX-4T3 для экспрессии в тандеме с меткой GST. Последовательность PHFAPP была модифицирована для вставки уникального остатка цистеина в мембраносвязывающий интерфейс белка43. Кроме того, между участком расщепления тромбина и N-конечной стороной домена PH был введен линкер с девятью остатками для обеспечения доступности протеазы.
Для измерения экстракции PS из липосом NBD-C2Lact смешивают с липосомами, состоящими из фосфатидилхолина (PC), содержащими следовые количества PS. Благодаря своему сродству к PS, эта конструкция связывается с липосомами, и флуорофор NBD испытывает изменение полярности при контакте с гидрофобной средой мембраны, что вызывает синий сдвиг и увеличение флуоресценции. Если PS извлекается почти полностью стехиометрическим количеством LTP, зонд не связывается с липосомами, а сигнал NBD ниже(Рисунок 1B)32. Эта разница в сигнале используется для определения того, извлекает ли LTP(например, Osh6p) PS. Аналогичная стратегия используется с NBD-PHFAPP для измерения извлечения PI(4)P(рисунок 1B),как описаноранее 12,32. Два анализа на основе ФРЕТ были разработаны для (i) измерения переноса PS от LA до LB липосом, которые имитируют мембрану ER и PM, соответственно, и (ii) перенос PI(4)P в обратном направлении. Эти анализы выполняются в одинаковых условиях(т.е. одинаковый буфер, температура и концентрация липидов) для измерения обмена PS/PI(4)P. Для измерения транспорта PS NBD-C2Lact смешивают с липосомами LA, состоящими из PC, и легируют 5 моль% PS и 2 моль% флуоресцентного фосфатидилэтаноламина(Rhod-PE)-и LB липосом, включающих 5 моль% PI(4)P.
В нулевое время FRET с Rhod-PE гасят флуоресценцию NBD. Если PS транспортируется из липосом LA в LB (например, при инъекции Osh6p), происходит быстрое закапливание за счет транслокации молекуллакта NBD-C2 из липосом LA в LB (рисунок 1C). Учитывая количество доступного PS, NBD-C2Lact остается по существу в мембранно-связанном состоянии в течение эксперимента12. Таким образом, интенсивность сигнала NBD напрямую коррелирует с распределением NBD-C2Lact между липосомами LA и LB и может быть легко нормализована для определения того, сколько PS передается. Для измерения переноса PI(4)P в противоположном направлении NBD-PHFAPP смешивают с липосомами LA и LB; учитывая, что он связывается только с липосомами LB, которые содержат PI(4)P, но не Rhod-PE, его флуоресценция высока. Если PI(4)P переносится в липосомы LA, он переносится на эти липосомы, и сигнал уменьшается из-за FRET с Rhod-PE(рисунок 1C). Сигнал нормализуется, чтобы определить, сколько PI(4)P передается43.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;L-cysteine &#8805;97 % (FG)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W326305-100G</td>
			<td>Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W224681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm-diameter glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z265934-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA purifier</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC900324, UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC800324, UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8385-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Gold Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0 Liss&#160; (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0/C16:0-PI(4)P&#160;&#160;</td>
			<td>Echelon Lipids</td>
			<td>P-4016-3</td>
			<td>Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 &#181;L of MeOH and 250 &#181;L of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C-500mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Disruptor</td>
			<td>Constant Dynamics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (CHCl3) RPE-ISO</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>438601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized (Milli-Q) water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide (DMF), anhydrous, &#62;99% pure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td>Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.&#160; Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac chromatography columns (1.5 &#215; 12 cm).</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette 2 mm</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td>EP102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator Eppendorf 2510</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Spinning the batcerial lysates</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-syringes (10, 25, and 50 &#181;L) for fluorescence experiment</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 &#181;L) to handle lipid stock solutions</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (99% pure)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemolysis tubes with a cap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES , &#62;99 % pure</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustra NAP 10 desalting column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>GE17-0854-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0008-B</td>
			<td>Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Acetate</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>26664.293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox LB Broth medium without glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared with milli-Q water and autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH) &#8805;99.8%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20847.24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator-based fluorescence plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>M1000 Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N&#39;-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 &#181;L in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 &#176;C in the dark.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass)</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p5318-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-C2LACT&#160; plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available on request from our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-PHFAPP plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available on request from our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) &#8805;98.5% (GC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626-25g</td>
			<td>Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoramidon</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7385-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 &#181;m</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7311550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prefilters (10 mm in diameter).</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>http://pymol.org/</td>
			<td></td>
			<td>Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 &#181;L)</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge&#160; Eppendorf 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>B-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small magnetic PFTE stirring bar (5 &#215; 2 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO orange</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10602400001</td>
			<td>Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 &#181;L aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, ultra pure</td>
			<td>MP</td>
			<td>819623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge L90K</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible absorbance spectrophotometer</td>
			<td>SAFAS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device</td>
			<td>Jasco or Shimadzu</td>
			<td>Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based measurements of phosphatidylserine/phosphatidylinositol 4-phosphate exchange between membranes

Недавно было обнаружено, что несколько членов семейства гомологов (Ош), связанных с оксистерол-связывающим белком (OSBP) / OSBP (Osh), представляют собой новую группу липидных трансферных белков (LTP) в дрожжах и клетках человека. Они переносят фосфатидилсерин (PS) из эндоплазматического ретикулума (ER) в плазматическую мембрану (PM) через циклы обмена PS/фосфатидилинозитол 4-фосфат (PI(4)P). Это открытие позволяет лучше понять, как PS, который имеет решающее значение для сигнальных процессов, распределяется по всей клетке, и исследование связи между этим процессом и метаболизмом фосфоинозитида (PIP). Разработка новых протоколов на основе флуоресценции сыграла важную роль в открытии и характеристике этого нового клеточного механизма in vitro на молекулярном уровне. В данной работе описывается производство и использование двух флуоресцентно меченых липидных датчиков, NBD-C2Lact и NBD-PHFAPP,для измерения способности белка извлекать PS или PI(4)P и переносить эти липиды между искусственными мембранами. Во-первых, протокол описывает, как производить, маркировать и получать образцы высокой чистоты этих двух конструкций. Во-вторых, в этой статье объясняется, как использовать эти датчики с флуоресцентным считывателем микропластин, чтобы определить, может ли белок извлекать PS или PI(4)P из липосом, используя Osh6p в качестве тематического исследования. Наконец, этот протокол показывает, как точно измерить кинетику обмена PS/PI(4)P между липосомами определенного липидного состава и определить скорость переноса липидов путем флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) с использованием стандартного флуорометра.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg"> Рисунок 1:Описание флуоресцентных липидных датчиков и анализов in vitro. (A) Трехмерные модели NBD-C2Lact и NBD-PHFAPP на основе кристаллической структуры домена C2 бычих лактадерина (PDB...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes at JoVE.com

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Здесь мы описываем протоколы с использованием флуоресцентных липидных датчиков и липосом, чтобы определить, извлекает ли белок и транспортирует ли он фосфатидилсерин или фосфатидилинозитол 4-фосфат in vitro.

Флуоресцентные измерения обмена фосфатидилсерина/фосфатидилинозитола 4-фосфата между мембранами

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Этот метод используют флуоресценцию, чтобы определить, переносится ли белок на биологически важные ликиды между синтетическими мембранами и, таким образом, способствует распределению этих липидов внутри эукариотических клеток. Этот метод позволяет экстракцию и транспортировать природный липид с помощью белка, для этого требуется и флуоресценция клеток, и липосом, которые легко сделать. Этот метод может быть использован и модифицирован, чтобы получить представление о клеточной биологии белками, стоящими за распределением некоторых важных липидов между органом и мембранами.Визуальная демонстрация имеет решающее значение для объяснения того, как выполнять измерения переноса липидов в режиме реального времени флуоресценцией. Таким образом, продемонстрировать процедуру также будет Мод Магделейн, инженер моей лаборатории. Начните с приготовления свежего фильтрованного и дегазированного буфера ацетата калия HEPES, дополненного одним миллимолярным хлоридом магния с образованием буфера HKM.Затем готовят липосомы, изготовленные только из ПК или дополнительно легированные двумя молярными процентами PS или PI(4)P. Теперь поместите колбу на вращающийся испаритель, чтобы высушить липиды под вакуумом. В одной лунке смешайте липосомы, содержащие два молярных процента PS, с липидным датчиком NBD-C2 Lact до конечной концентрации 250 наномолярных и объемом 100 микролитров.Заполните вторую скважину таким же количеством липосом и лакта NBD-C2, смешанного с тремя микромолярными белками переноса липидов или LTP. Заполните третью скважину 250 наномолярными лактами NBD-C2, смешанными с чистыми 80 микромоллярными липосомами PC, а четвертую скважину чистыми 80 микромолярными ЛИПОСОМАМИ PC. Повторите эти шаги, чтобы подготовить три дополнительные серии из четырех скважин.Затем поместите многоязыковую пластину в флуоресцентный считыватель. Для каждой скважины регистрируют спектр NBD от 505 до 650 нанометров с пятинанометровой полосой пропускания при возбуждении при 490 нанометрах при 25 градусах Цельсия. Для каждого ряда вычтите спектр, записанный только с липосомами из других спектров.Для экстракции PI(4)P готовят липосомы, легированные двумя молярными процентами фосфатидилинозитол-4-фосфата, и проводят измерения с помощью зонда NBD-PH FAPP. Выполните контрольные эксперименты и определите процент извлечения. После окончания экструдирования липосомы заполняют тюбик этими экструдированными липосомами.Приготовьте свежеотмазывённый и отфильтрованный буфер HKM и держите трубки, содержащие экструдированные липосомы, при комнатной температуре. Оберните трубки, содержащие липосомы, с родамином, меченым фосфатидилэтаноламином, в алюминиевую фольгу и храните их в непрозрачной коробке, чтобы предотвратить любое фотоотбеливание. Установите температуру между 25 и 37 градусами Цельсия и отрегулируйте монохромметры возбуждения до 460 нанометров с короткой полосой пропускания от одного до трех нанометров и излучением до 530 нанометров с большой пропускной способностью более 10 нанометров.Установите время сбора на двадцать пять минут с разрешением по времени не более одной секунды. В кварцевой кювете разводят 30 микролитров суспензии липосом LA и раствора лакта NBD-C2 и предварного буфера HKM для приготовления образца объемом 570 микролитров, который содержит 200 микромолярных общих липидов и 250 наномолярных или NBD-C2 лакт. Добавьте небольшую магнитную мешалку и поместите кювету в держатель флуорометра.Как только образец будет термически уравновешиваться, запустите измерение. Через одну минуту добавьте в образец 30 микролитров суспензии липосом LB. Через три минуты вводят LTP в образец так, чтобы конечная концентрация LTP была 200 наномоляров, затем получают сигнал в течение оставшихся 21 минуты.Провести параллельный эксперимент по нормализации сигнала NBD. Смешайте 30 микролитров равновесной липосомной суспензии LA с 250 наномолярными лактами NBD-C2 в буфере HKM при конечном объеме 570 микролитров. Через одну минуту вводят 30 микролитров равновесной липосомной суспензии LB.Преобразуйте кинетические кривые, измеренные с интересующим LTP, чтобы определить количество PS, переданных из LA в ЛИПОСОМы LB с течением времени. Затем нормализуйте каждую точку данных кривой. Выполните эксперимент PI(4)P, используя те же настройки и условия излучателя пола, что и для анализа передачи PS.В кювете смешайте 30 микролитров суспензии липосом lb и зонд NBD-PH FAPP с предварительно нагретым буфером HKM для получения конечного объема 570 микролитров. Как только тепловое равновесие образца достигнуто, начните измерение. Через одну минуту вводят 30 микролитров суспензии липосом LA.Через три минуты ввести интересующих LTP и записать сигнал. Выполните второй эксперимент для нормализации сигнала NBD. Смешайте 30 микролитров равновесной липосомной суспензии lb с 250 наномолярами NBD-PH FAPP и 570 микролитрами буфера HKM.Через одну минуту вводят 30 микролитров равновесной липосомной суспензии LA. Преобразуйте кинетические кривые для определения количества PI(4)P, передаваемых от LB к LA липосомам с течением времени, затем нормализуйте каждую точку данных. Для количественной оценки того, в какой степени LTP является эффективным.Выполните линейную регрессию первых точек данных кинетики переноса для получения наклона. Разделите значение наклона на концентрацию LTP в реакционной смеси, чтобы определить количество молекул липидов, переносимых на белок за единицу времени. Эффективное восстановление лакта C2 из бусин было проверено с помощью анализа страниц SDS.Ультрафиолетовый видимый абсорбирующий спектр C2 лакта, меченый NBD, подтвердил, что все молекулы лакта C2 были помечены группой NBD. Чистоту лакта NBD-C2 и его флуоресценцию определяли методом анализа страниц SDS. Флуоресценция лакта NBD-C2 или NBD-PH FAPP была максимальной, когда для инкубации использовались только липосомы, содержащие PS или PI(4)P, что указывает на то, что датчик был связан мембраной.Низкая флуоресценция наблюдалась, когда присутствовал Osh6p, что указывает на то, что этот белок эффективно извлекал PS или PI(4)P из липосом. Показаны результаты анализа передачи PS с использованием Osh6p в качестве LTP. Рассчитаны средние кинетические кривые переноса PS от липосом LA к липосомам LB, легированные или не легированные фосфатидилинозитол-4-фосфатом.Средняя начальная скорость переноса PS была определена из трех различных экспериментов. Аналогично, здесь показаны результаты анализа передачи PI(4)P с использованием Osh6p в качестве LTP. Наряду со средними кинетическими кривыми, полученными после нормализации сигнала.Средние скорости передачи измеряли с помощью липосом LA, которые были легированы или не легированы PS. При выполнении этого протокола используйте свежий буфер и готовьте те же дни. Сведите к минимуму легкую экспозицию флуоресцентных липосом и белков, используйте хорошо очищенный белок, меченый NBD, и держите их на льду. может быть подтверждено путем измерения переноса PS и PI(4)P между органеллами внутри прокариотической клетки с использованием генетически закодированных флуоресцентных липидных датчиков.Этот метод прокладывает путь к лучшему пониманию PS и PI(4), распределенных внутри клетки, и их активность подвергается специфичности нескольких LTPS.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Флуоресцентным на основе анализа фосфолипида Scramblase деятельности

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Интернет эксклюзионной и ионообменной хроматографии на МУРР пучкового

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Структурные исследования атомной шкале макромолекулярных сборок, твердотельного ЯМР спектроскопии

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Изоляция и дыхательных измерения митохондрий от Резуховидка Таля

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Обнаружение моющих средств чувствительных взаимодействия между мембранные белки

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Быстрое на основе флуоресценции характеристика одной внеклеточного везикулы в крови человека с анализом наночастиц отслеживание

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

В реальном времени наблюдения опосредовано Rad51 реакции обмена Strand ДНК

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ионообменной хроматографии (IEX) в сочетании с мульти-угол рассеяния света (MALS) для разделения белков и характеристика

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl Обмен Гель Сдвиг Анализ для количественного определения Palmitoylation мозга Membrane белков

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...