Name: fluorescence-based measurements of phosphatidylserine/phosphatidylinositol 4-phosphate exchange between membranes
Uploaded: 2021-03-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes at JoVE.com

Dr. A. Cuttriss'e el yazmasını dikkatli bir şekilde düzelttikleri için minnettarız. Bu çalışma Fransız Ulusal Araştırma Ajansı hibe ExCHANGE (ANR-16-CE13-0006) ve CNRS tarafından finanse edilmektedir.

1. NBD-C2Laktının Saflaştırılması
NOT: Bu protokol bakterileri kırmak için bir hücre bozucunun kullanımını detaylandırsa da, diğer liziz stratejilerini(örneğin, bir Fransız basını) kullanmak için değiştirilebilir. Saflaştırmanın başlangıcında, sistein oksidasyonunu önlemek için taze gazdan arındırılmış, filtrelenmiş ve 2 mM dithiothreitol (DTT) ile desteklenmiş tampon kullanılması zorunludur. Bununla birlikte, protein etiketleme adımı ...

Bu tahlillerin sonuçları doğrudan floresan lipid sensörlerinin sinyallerine dayanır. Bu nedenle, NBD ile 1:1 oranında etiketlenen ve serbest NBD florofor kontaminasyonu olmadan etiketlenen bu probların saflaştırılması bu protokolde kritik bir adımdır. Muayene edilen LTP'nin düzgün bir şekilde katlanıp katlanmadığını ve toplanmadığını kontrol etmek de zorunludur. Bu LTP'nin bu lipitleri verimli bir şekilde çıkarıp çıkarmadığını düzgün bir şekilde ölçmek için ekstraksiyon testlerind...

Lipitlerin farklı membranlar arasında ve ökaryotik hücrelerin zarları içinde kesin dağılımı1,2 derin biyolojik etkilere sahiptir. LTP'lerin nasıl çalıştığının şifresini çözmek hücre biyolojisinde önemli bir konudur3,4,5,6ve in vitro yaklaşımlar bu sorunu ele almada büyük değere sahiptir 7 ,8,9,10,11. Burada, birkaç ORP/Osh proteininin PS/PI(4)P hücre zarları12 arasındaki değişimi etkilediğini ve böylece yeni bir LTP sınıfı oluşturduğunu belirlemede etkili olan in vitro,floresan tabanlı bir strateji sunulmuştur. PS, ökaryotik hücrelerde toplam membran lipitlerinin% 2-10'unu temsil eden aniyonik bir gliserofsfolipiddir13,14,16. Sırasıyla17, 18,19 gliserofosfolipidlerin% 5-7'sini ve% 30'unu temsil ettiği ER ve PM arasında birgradyanboyuncadağıtılır. Ayrıca, PS esasen PM'nin sitosolik broşüründe yoğunlaşmıştır. Bu birikme ve PM'deki PS'nin düzensiz bölümü hücresel sinyal işlemleri için kritiktir19. PS moleküllerinin negatif yükü nedeniyle, PM'nin sitosolik broşürü, diğer organellerin sitozolitik broşürü 1,2,19,20'dençok daha anioniktir. Bu, elektrostatik kuvvetler aracılığıyla işe alıma olanak sağlar, miristosilat alanin bakımından zengin C-kinaz substratı (MARCKS)21, sarkom (Src)22, Kirsten-rat sarkom viral onkogen (K-Ras)23ve Ras ile ilgili C3 botulinum toksin substratı 1 (Rac1)24 gibi pozitif yüklü amino asitler ve lipidik kuyruk içeren sinyal proteinleri.
PS ayrıca geleneksel protein kinaz C tarafından stereoselektif bir şekilde C2 etki alanı25 aracılığıyla tanınır. Ancak, PS sentezlendi ER26, rolünü oynayabilmesi için PM'ye dışa aktarılması gerektiğini gösterir. Mayada, Osh6p ve Osh7p'nin PS'yi ACIL'den PM27'yeaktardığı bulguya kadar bunun nasıl19'a başarıldığı bilinmiyordu. Bu LTP'ler, kurucu üyesi OSBP olan ve bir lipid molekülü barındırmak için OSBP ile ilgili bir etki alanını (ORD) bir ceple entegre eden proteinler (insanda ORP'ler, mayadaki Oş proteinleri) içeren ökaryotlarda evrimsel olarak korunmuş bir aileye aittir. Osh6p ve Osh7p, yalnızca yapısal özellikleri PS'yi özellikle bağlamak ve membranlar arasında aktarmak için uyarlanmış bir ORD'den oluşur. Bununla birlikte, bu proteinlerin PS'yi acil servisten PM'ye nasıl aktardığı belirsizdi. Osh6p ve Osh7p, PI(4)P'yi alternatif bir lipid ligand12olarak hapsedebilir. Mayada PI(4)P, Golgi ve PM'deki fosfatidylinositol'den (PI) sırasıyla PI 4-kinaz, Pik1p ve Stt4p ile sentezlenmiştir. Buna karşılık, ER membranında PI(4)P yoktur, çünkü bu lipit Sac1p fosfataz tarafından PI'ye hidrolize edilir. Bu nedenle, hem ER/Golgi hem de ER/PM arabirimlerinde bir PI(4)P gradyanı bulunur. Osh6p ve Osh7p, bu iki membran arasında bulunan PI(4)P gradyanını kullanarak PS/PI(4)P değişim döngüleri aracılığıyla PS'den PM'ye TRANSFER12.
Bir döngü içinde, Osh6p ACIL'den PS çıkarır, PM'de PI(4)P için PS değiştirir ve başka bir PS molekülü çıkarmak için PI(4)P'yi ER'ye geri aktarır. Osh6p / Osh7p ist2pile etkileşime girer 28, ER membranını ve PM'yi birbirine bağlayan ve yakın bir hale getiren birkaç proteinden biri maya29,30,31'deER-PM temas siteleri oluşturmak için. Ek olarak, Osh6p'nin negatif yüklü membranlarla ilişkisi, protein lipid ligandlarından birini elektrostatik özelliklerini değiştiren konformasyonsal bir değişiklik nedeniyle çıkarır çıkarmaz zayıflar32. Bu, membran tutma süresini kısaltarak Osh6p'ye yardımcı olur, böylece lipid transfer aktivitesinin verimliliğini korur. Ist2p'ye bağlama ile birlikte, bu mekanizma Osh6p/7p'nin ER/PM arabiriminde lipid değişimini hem hızlı hem de doğru bir şekilde yürütmesine izin verebilir. İnsan hücrelerinde, ORP5 ve ORP8 proteinleri ER-PM temas bölgelerinde PS/PI(4)P değişimini farklı mekanizmalar aracılığıyla yürütür33. Osh6p'ye benzeyen merkezi bir ORD'ye sahiptirler, ancak doğrudan bir C terminali transmembransegmenti 33 aracılığıyla ACIL'ye bağlanırlar ve PI(4)P ve PI(4,5)P233 , 34,35'i tanıyan bir N terminali Pleckstrin homolojisi (PH) etki alanı aracılığıyla PM'ye yanaşırlar. ORP5/8, PS'yi aktarmak için PI(4)P kullanır ve ORP5/8'in PM PI(4,5)P2 seviyelerini ayrıca düzenlediği ve muhtemelen sinyal yollarını modüle ettiği gösterilmiştir. Buna karşılık, PI(4)P ve PI(4,5)P2 seviyelerindeki bir düşüş, bu proteinler PIP'e bağlı bir şekilde PM ile ilişkili olduğu için ORP5 / ORP8 aktivitesini düşürür. Lenz-Majewski sendromuna yol açan anormal derecede yüksek PS sentezi, ORP5/836aracılığıyla PI(4)P seviyelerini etkiler. Her iki proteinin aktivitesi engellendiğinde, PS PM'de daha az bol hale gelir ve proteinlerin onkojenik yeteneğini düşürür37.
Tersine, ORP5 aşırı ifade kanser hücre invazyonunu ve metastatik süreçleri teşvik ediyor gibi görünüyor38. Bu nedenle, ORP5/8 aktivitesindeki değişiklikler lipid homeostazındaki değişikliklerle hücresel davranışı ciddi şekilde değiştirebilir. Ayrıca, ORP5 ve ORP8 ER-mitokondri temas alanlarını işgal ediyor ve muhtemelen PS39sağlayarak bazı mitokondriyal işlevleri koruyor. Ayrıca ORP5, PS/PI(4)P exchange40ile LIPID damlacıklarına PS teslim etmek için ER-lipid damlacık iletişim sitelerine yerelleştirir. Burada açıklanan strateji, (i) PS ve PI(4)Lipozomlardan P ekstraksiyonunu ve (ii) LIPOMLAR ARASıNDAKI PS ve PI(4)P naklini ölçmek için Osh6p/Osh7p12,32'nin PS/PI(4)P değişim aktivitesini kurmak ve analiz etmek için tasarlanmıştır ve diğer gruplar tarafından ORP5/ORP835 ve diğer LTP10'larınaktivitesini analiz etmek için kullanılmıştır. 41. Bir floresan plaka okuyucu, standart bir L-format spektrofluorometre ve sırasıyla PS ve PI(4)P'yi algılayabilen iki floresan sensör, NBD-C2Lact ve NBD-PHFAPPkullanımına dayanmaktadır.
NBD-C2Lact, glikoprotein, lactadherin'in C2 etki alanına karşılık gelir, bu da varsayılan PS bağlama bölgesinin yakınında benzersiz bir çözücüye maruz kalan sistein içerecek şekilde yeniden tasarlanmıştır; polariteye duyarlı bir NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) floroforu bu kalıntıya yaygın olarak bağlıdır (Şekil 1A)12. Daha kesin olmak gerekirse, lactadherin C2 etki alanı (Bos taurus, UniProt: Q95114, kalıntılar 270-427) Escherichia coliglutatyon S-transferaz (GST) ile füzyon ifade etmek üzere bir pGEX-4T3 vektör içine klonlanmıştır. C2Lact dizisi daha sonra iki solventle erişilebilir sistein kalıntısını (C270, C427) alanin kalıntıları ile ve daha sonra N,N'-dimetil-ile etiketlenebilen putatif PS-bağlama bölgesinin (H352C mutasyonu) yakınındaki bir bölgeye sistein kalıntısı sokmak için N-(iodoacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) etilen diamin (IANBD) 12. GST proteini ile C2 alanının N-terminusu arasında trombin için bir bölünme bölgesi bulunur. Önemli bir avantaj, bu etki alanının PS'yi bilinen diğerC2alan adlarına veya Annexin A542'yeaykırı olarak Ca 2+ bağımsız bir şekilde seçici olarak tanımasıdır. NBD-PHFAPP, PI(4)P bağlama bölgesinin yakınındaki bir NBD grubu ile etiketlenebilen tek bir solvent maruziyeti sistein içerecek şekilde yeniden tasarlanmış insan dört fosfat adaptör proteini1'in (FAPP1)PH etki alanından türetilmiştir ( Şekil 1A )43. İnsan FAPP proteininin PH etki alanının nükleotid dizisi (UniProt: Q9HB20, segment [1-100]), bir GST etiketiyle birlikte ifade edilecek bir pGEX-4T3 vektörüne klonlanmıştır. PHFAPP dizisi, protein43'ünmembran bağlayıcı arayüzüne benzersiz bir sistein kalıntısı eklemek için değiştirilmiştir. Ayrıca, proteazlara erişilebilirliği sağlamak için trombin bölünme bölgesi ile PH alanının N-terminus'u arasında dokuz kalıntılı bir bağlayıcı getirilmiştir.
Lipozomlardan PS ekstraksiyonunu ölçmek için NBD-C2Lact, eser miktarda PS içeren fosfatidiylcholine (PC) yapılmış lipozomlarla karıştırılır. PS'ye olan yakınlığı nedeniyle, bu yapı lipozomlara bağlanır ve NBD floroforu, zarın hidrofobik ortamıyla temas ettikçe polaritede bir değişiklik yaşar ve bu da mavi kayma ve floresan artışı sağlar. PS neredeyse tamamen bir stoichiometric LTP miktarı ile ayıklanırsa, prob lipozomlarla ilişkilendirmez ve NBD sinyali daha düşüktür (Şekil 1B)32. Bu sinyal farkı, bir LTP'nin(örneğin, Osh6p) PS'yi ayıklayıp ayıklamadığını belirlemek için kullanılır. Benzer bir strateji, daha önce açıklandığı gibi PI(4)P ekstraksiyonunu (Şekil 1B) ölçmek için NBD-PHFAPP ile kullanılır12,32. (i) SıRASıYLA ER membranını ve PM'yi taklit eden LA'dan LB lipozomlarına PS taşımacılığını ve (ii) PI(4)P taşımasını ters yönde ölçmek için iki FRET tabanlı test tasarlanmıştır. Bu tahliller PS/PI(4)P değişimini ölçmek için aynı koşullar(yani aynı tampon, sıcaklık ve lipid konsantrasyonu) altındagerçekleştirilir. PS taşımacılığını ölçmek için, NBD-C2Lact PC'den oluşan L A lipozomları ile karıştırılır ve 5 mol% PS ve 2 mol% 5 mol PI (4) P içeren floresan rhodamin etiketli fosfatidylethanolamine (Rhod-PE) ve LB lipozomları ile karıştırılır.
Sıfır noktasında, Rhod-PE'li FRET, NBD floresanını bastırır. PS LA'dan LB lipozomlarına taşınırsa(örneğin, Osh6p enjekte edildikten sonra), NBD-C2Lakt moleküllerinin LA'dan LB lipozomlarına translokasyonu nedeniyle hızlı bir söndürme meydana gelir (Şekil 1C). Erişilebilir PS miktarı göz önüne alındığında, NBD-C2Lact esasen deney boyunca zara bağlı bir durumda kalır12. Bu nedenle, NBD sinyalinin yoğunluğu, NBD-C2Lakt'in LA ve LB lipozomları arasındaki dağılımıyla doğrudan ilişkilidir ve ne kadar PS aktarıldığını belirlemek için kolayca normalleştirilebilir. PI(4)P'nin ters yönde transferini ölçmek için, NBD-PHFAPP LA ve LB lipozomları ile karıştırılır; Sadece PI(4)P içeren LB lipozomlarına bağlandığı, ancak Rhod-PE'ye bağlanmadığı göz önüne alındığında, floresan yüksektir. PI(4)P LA lipozomlarına transfer edilirse, bu lipozomlara doğru hareket eder ve Rhod-PE ile FRET nedeniyle sinyal azalır (Şekil 1C). Sinyal, ne kadar PI(4)P aktarıldığını belirlemek için normalleştirilir43.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;L-cysteine &#8805;97 % (FG)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W326305-100G</td>
			<td>Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W224681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm-diameter glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z265934-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA purifier</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC900324, UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC800324, UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8385-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Gold Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0 Liss&#160; (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0/C16:0-PI(4)P&#160;&#160;</td>
			<td>Echelon Lipids</td>
			<td>P-4016-3</td>
			<td>Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 &#181;L of MeOH and 250 &#181;L of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C-500mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Disruptor</td>
			<td>Constant Dynamics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (CHCl3) RPE-ISO</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>438601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized (Milli-Q) water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide (DMF), anhydrous, &#62;99% pure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td>Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.&#160; Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac chromatography columns (1.5 &#215; 12 cm).</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette 2 mm</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td>EP102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator Eppendorf 2510</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Spinning the batcerial lysates</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-syringes (10, 25, and 50 &#181;L) for fluorescence experiment</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 &#181;L) to handle lipid stock solutions</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (99% pure)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemolysis tubes with a cap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES , &#62;99 % pure</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustra NAP 10 desalting column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>GE17-0854-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0008-B</td>
			<td>Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Acetate</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>26664.293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox LB Broth medium without glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared with milli-Q water and autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH) &#8805;99.8%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20847.24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator-based fluorescence plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>M1000 Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N&#39;-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 &#181;L in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 &#176;C in the dark.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass)</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p5318-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-C2LACT&#160; plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available on request from our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-PHFAPP plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available on request from our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) &#8805;98.5% (GC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626-25g</td>
			<td>Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoramidon</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7385-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 &#181;m</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7311550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prefilters (10 mm in diameter).</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>http://pymol.org/</td>
			<td></td>
			<td>Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 &#181;L)</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge&#160; Eppendorf 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>B-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small magnetic PFTE stirring bar (5 &#215; 2 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO orange</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10602400001</td>
			<td>Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 &#181;L aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, ultra pure</td>
			<td>MP</td>
			<td>819623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge L90K</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible absorbance spectrophotometer</td>
			<td>SAFAS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device</td>
			<td>Jasco or Shimadzu</td>
			<td>Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based measurements of phosphatidylserine/phosphatidylinositol 4-phosphate exchange between membranes

Evrimsel olarak korunmuş oksisterol bağlayıcı protein (OSBP) ile ilişkili proteinler (ORP)/OSBP homologları (Oş) ailesinin birkaç üyesinin son zamanlarda maya ve insan hücrelerinde yeni bir lipit transfer proteini (LTP) grubunu temsil ettiği bulunmuştur. Fosfatidiylinositol 4-fosfat (PI(4)P) değişim döngüleri ile endoplazmik reticulumdan (ER) plazma membranlarına (PM) fosfatidiylserine (PS) aktarırlar. Bu bulgu, sinyalizasyon işlemleri için kritik olan PS'nin hücre boyunca nasıl dağıtıldığının ve bu işlem ile fosfoinositid (PIP) metabolizması arasındaki bağlantının araştırılmasının daha iyi anlaşılmasını sağlar. Yeni floresan bazlı protokollerin geliştirilmesi, bu yeni hücresel mekanizma in vitro'nun moleküler düzeyde keşfedilmesinde ve karakterizasyonunda etkili olmuştur. Bu makale, bir proteinin PS veya PI(4)P çıkarma yeteneğini ölçmek ve bu lipitleri yapay zarlar arasında aktarmak için floresan etiketli iki lipit sensörünün, NBD-C2Lact ve NBD-PHFAPP'ınüretimini ve kullanımını açıklamaktadır. İlk olarak, protokol bu iki yapının yüksek saflıkta örneklerinin nasıl üretılacağını, etiketlenerek ve elde edilir. İkinci olarak, bu makale, bir proteinin Osh6p'yi vaka çalışması olarak kullanarak lipozomlardan PS veya PI(4)P çıkarıp çıkarabileceğini belirlemek için bu sensörlerin floresan mikro plaka okuyucu ile nasıl kullanılacağını açıklar. Son olarak, bu protokol, tanımlanmış lipid bileşiminin lipozomları arasındaki PS/PI(4)P değişiminin kinetiğinin nasıl doğru bir şekilde ölçüleceğini ve standart bir florometre kullanılarak floresan rezonans enerji transferi (FRET) ile lipid transfer oranlarının nasıl belirleneceğini göstermektedir.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg"> Şekil 1: Floresan lipit sensörlerinin ve in vitro tahlillerin açıklaması. (A) Sığır laktadherin C2 etki alanının kristal yapısına (PDB ID: 3BN648)ve insanFAPP1 proteininin PH alanının NMR yapısına dayanan NBD-C2Lact ve NBD-PH FAPP'ın üç boyutlu modelleri (PDB ID: 2KCJ<s...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes at JoVE.com

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Burada, bir proteinin fosfatidiylserine veya fosfatidiliinositol 4-fosfat in vitro'yuayıklayıp taşımadığını belirlemek için floresan lipid sensörleri ve lipozomlar kullanarak protokolleri açıklıyoruz.

Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Bu yöntem, biyolojik olarak önemli bir liqid'e bir protein transferinin sentetik membran arasında olup olmadığını belirlemek ve böylece bu lipitlerin ökaryotik hücreler içinde dağılımına katkıda bulunmak için floresan kullanır. Bu teknik, doğal bir lipitin bir protein tarafından çıkarılmasını ve taşınmasını mümkün kılar, yapılması kolay hücreler ve lipozomlar gerektirir ve gerektirir. Bu yöntem, bazı temel lipitlerin organ ve zarlar arasında dağılımının arkasındaki proteinler tarafından hücresel biyoloji hakkında fikir almak için kullanılabilir ve değiştirilebilir.Görsel gösterim, floresan ile lipit transferinin gerçek zamanlı ölçümlerinin nasıl gerçekleştirildiğini açıklamak için kritik öneme sahiptir. Prosedürü gösteren aynı zamanda Maud Magdeleine olacak, laboratuvarımın mühendisi. HKM tamponu oluşturmak için bir milimoler magnezyum klorür ile desteklenmiş taze filtrelenmiş ve gazsız HEPES potasyum asetat tamponu hazırlayarak başlayın.Ardından, sadece PC'den yapılmış veya ek olarak yüzde iki azı dişi PS veya PI(4)P ile doped lipozomlar hazırlayın. Şimdi, lipid'i vakum altında kurutmak için şişeyi bir döner evaporatöre yerleştirin. Bir kuyuda, lipid sensörü NBD-C2 Lact ile iki azı dişi PS içeren lipozomları 250 nanomoler ve 100 mikrolitrelik bir hacimde son konsantrasyonda karıştırın.İkinci bir kuyuyu üç mikromoler lipid transfer proteini veya LTP ile karıştırılmış aynı miktarda lipozom ve NBD-C2 lakt ile doldurun. Üçüncü bir kuyuyu saf 80 mikromolar PC lipozomları ile karıştırılan 250 nanomolar NBD-C2 lakt ve saf 80 mikromolar PC lipozomları ile dördüncü bir kuyu ile doldurun. Dört kuyudan oluşan üç ek seri hazırlamak için bu adımları tekrarlayın.Daha sonra çok kuyulu plakayı floresan okuyucuya yerleştirin. Her kuyu için 25 santigrat derecede 490 nanometrede heyecanlanma üzerine beş nanometre bant genişliğine sahip 505 ila 650 nanometre arasında bir NBD spektrumu kaydedin. Her seri için, diğer spektrumdan sadece lipozomlarla kaydedilen spektrumu çıkarın.PI(4)P ekstraksiyon tahlil için iki azı dişi yüzde fosfatilinositol-4-fosfat ile dopd lipozomlar hazırlamak ve NBD-PH FAPP prob ile ölçümler yapmak. Kontrol deneyleri gerçekleştirin ve ayıklama yüzdesini belirleyin. Ekstrüde lipozomları bitirdikten sonra bir tüpü bu ekstrüde lipozomlarla doldurun.Yeni gazdan arındırılmış ve filtrelenmiş HKM tamponu hazırlayın ve ekstrüde lipozom içeren tüpleri oda sıcaklığında tutun. Lipozom içeren tüpleri alüminyum folyoya rhodamin etiketli fosfatidylethanolamine ile sarın ve herhangi bir fotoğraf ağartmasını önlemek için opak bir kutuda saklayın. Sıcaklığı 25 ila 37 santigrat derece arasında ayarlayın ve heyecan monokrommetrelerini bir ila üç nanometrelik kısa bant genişliğine sahip 460 nanometreye ve emisyonu 10 nanometreden büyük büyük bant genişliğine sahip 530 nanometreye ayarlayın.En fazla bir saniyelik zaman çözünürlüğüyle edinme süresini yirmi beş dakika olarak ayarlayın. Kuvars cuvette LA lipozom süspansiyon ve NBD-C2 lakt stok çözeltisinin 30 mikrolitresini seyreltin ve 200 mikromoler toplam lipit ve 250 nanomoler veya NBD-C2 lakt içeren 570 mikrolitrelik bir örnek hazırlamak için ısıtma öncesi HKM tamponu. Küçük bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin ve cuvette'i florometre tutucusuna yerleştirin.Numune termal olarak dengelendikten sonra ölçümü tetikleyin. Bir dakika sonra, numuneye 30 mikrolitre LB lipozom süspansiyonu ekleyin. Üç dakika sonra LTP'yi numuneye enjekte edin, böylece LTP'nin son konsantrasyonu 200 nanomolardır, ardından kalan 21 dakika boyunca sinyali alın.NBD sinyalini normalleştirmek için paralel bir deney gerçekleştirin. 30 mikrolitre LA denge lipozom süspansiyonu, 570 mikrolitrelik son hacimde HKM tamponunda 250 nanomolar NBD-C2 lakt ile karıştırın. Bir dakika sonra, 30 mikrolitre LB denge lipozom süspansiyonu enjekte edin.Zaman içinde LA'den LB lipozomlarına aktarılan PS miktarını belirlemek için ilgi çekici bir LTP ile ölçülen kinetik eğrileri dönüştürün. Ardından eğrinin her veri noktasını normalleştirin. PI(4)P denemesini, PS aktarım tahlili ile aynı zemin yayıcı ayarlarını ve koşullarını kullanarak gerçekleştirin.Cuvette, 30 mikrolitre lb lipozom süspansiyonu ve NBD-PH FAPP probunu önceden ısıtılmış HKM tamponu ile karıştırarak 570 mikrolitrelik son bir hacim elde edin. Numunenin termal dengeye ulaşıldıktan sonra ölçüme başlayın. Bir dakika sonra, 30 mikrolitre LA lipozom süspansiyonu enjekte edin.Üç dakika sonra, LTP'ye ilgiyi enjekte edin ve sinyali kaydedin. NBD sinyalini normalleştirmek için ikinci bir deneme gerçekleştirin. 30 mikrolitre lb denge lipozom süspansiyonunu 250 nanomoler NBD-PH FAPP ve 570 mikrolitre HKM tampon ile karıştırın.Bir dakika sonra, 30 mikrolitre LA denge lipozom süspansiyonu enjekte edin. Zaman içinde LB'den LA lipozomlarına aktarılan PI(4)P miktarını belirlemek için kinetik eğrileri dönüştürün, ardından her veri noktasını normalleştirin. LTP'nin ne ölçüde verimli olduğunu ölçmek için.Eğim elde etmek için aktarım kinetiğinin ilk veri noktalarının doğrusal bir gerilemesini gerçekleştirin. Zaman birimi başına protein başına aktarılan lipit moleküllerinin sayısını belirlemek için eğim değerini reaksiyon karışımındaki LTP konsantrasyonuna bölün. C2 laktının boncuklardan verimli bir şekilde kurtarılması SDS sayfa analizi ile doğrulandı.NBD ile etiketlenmiş C2 laktının ultraviyole görünür emici spektrumu, tüm C2 lakt moleküllerinin bir NBD grubu ile etiketlendiğini doğruladı. NBD-C2 laktının saflığı ve floresanları SDS sayfa analizi ile belirlendi. NBD-C2 lakt veya NBD-PH FAPP'ın floresanları, inkübasyon için sadece PS veya PI(4)P içeren lipozomlar kullanıldığında maksimaldi, bu da sensörün zara bağlı olduğunu gösteriyordu.Osh6p de mevcut olduğunda, bu proteinin lipozomlardan PS veya PI(4)P'yi verimli bir şekilde çıkardığını gösteren düşük bir floresan görüldü. LTP olarak Osh6p kullanan bir PS aktarım tahlilinin sonuçları gösterilir. PS'nin LA lipozomlarından LB lipozomlara, doped veya fosfatidylinositol-4-fosfat ile doped olmayan ortalama kinetik eğrileri hesaplandı.Ortalama ilk PS aktarım hızı üç farklı deneyden belirlendi. Benzer şekilde, LTP olarak Osh6p kullanan bir PI(4)P aktarım tahlilinin sonuçları burada gösterilmiştir. Sinyal normalleştirmeden sonra elde edilen ortalama kinetik eğrilerle birlikte.Ortalama transfer oranları, PS ile doped veya doped olmayan LA lipozomları ile ölçüldü. Bu protokolü gerçekleştirirken taze arabellek kullanın ve aynı günleri hazırlayın. Floresan lipozomların ve proteinlerin hafif sergisini en aza indirin, iyi saflaştırılmış NBD etiketli protein kullanın ve onları buzda tutun. genetik olarak kodlanmış floresan lipit sensörleri kullanılarak prokaryotik hücre içindeki organel arasında PS ve PI(4)P transferi ölçülerek doğrulanabilir.Bu teknik, PS ve PI(4)'ün hücre içinde dağıtıldığını ve etkinliklerinin birkaç LTPS özgüllüğünden geçtiğini daha iyi anlamanın bir yolunu sağlar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Biyokimya

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Bir SAXS beamline Online Boyut dışlama ve İyon değişim Kromatografi

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Membran proteinlerinin Hofstede deterjan duyarlı tespiti

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

İnsan kanı nanopartikül izleme analizi ile tek hücre dışı veziküller floresans tabanlı hızlı karakterizasyonu

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Rad51 tarafından aracılı DNA Strand Exchange tepki gerçek zamanlı gözlem

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Protein ayrımı ve karakterizasyonu için birden fazla açıyla ışık saçılma (MALS) birleştiğinde iyon Kromatografi (IEX)

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Beyin Zarı Proteinlerinin Palmitoylarasyonunun Kantitatif Tayini için Acyl-PEGyl Exchange Jel Shift Tayini

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...