Denne metoden bruker fluorescens for å avgjøre om et proteinoverføring til biologisk viktige liqider mellom syntetisk membran og dermed bidrar til fordelingen av disse lipidene inne i eukaryote celler. Denne teknikken gjør det mulig å ekstraksjon og transport av en naturlig lipid av et protein, det krever og fluorescensceller og liposomer som er enkle å lage. Denne metoden kan brukes og modifiseres for å få innsikt i cellulær biologi av proteiner bak distribusjonen av noen essensielle lipider mellom organ og membraner.
Visuell demonstrasjon er avgjørende for å forklare hvordan man utfører sanntidsmålinger av lipidoverføring ved fluorescens. Så å demonstrere prosedyren vil også være Maud Magdeleine, en ingeniør for laboratoriet mitt. Begynn med å forberede fersk filtrert og avgasset HEPES kaliumacetatbuffer, supplert med en millimolar magnesiumklorid for å danne HKM-buffer.
Deretter forbereder du liposomer som bare er laget av PC eller i tillegg dopet med to molar prosent PS eller PI(4)P. Plasser nå kolben på en roterende fordamper for å tørke lipiden under vakuum. I en brønn blander du liposomer som inneholder to molar prosent PS med lipidsensor, NBD-C2 Lact, til en endelig konsentrasjon på 250 nanomolar og et volum på 100 mikroliter.
Fyll en annen brønn med samme mengde liposom og NBD-C2 lakt blandet med tre mikromolar lipidoverføringsprotein eller LTP. Fyll en tredje brønn med 250 nanomolar NBD-C2 lakt blandet med rene 80 mikromolar PC liposomer og en fjerde brønn med rene 80 mikromolar PC liposomer. Gjenta disse trinnene for å forberede ytterligere tre serier med fire brønner.
Plasser deretter multi-brønnplaten i fluorescensleseren. For hver brønn registrerer et NBD-spektrum fra 505 til 650 nanometer med fem nanometerbåndbredde ved eksitasjon ved 490 nanometer ved 25 grader Celsius. For hver serie trekker spekteret som er registrert med bare liposomer fra det andre spektraet.
For PI(4)P ekstraksjonsanalyse forbereder liposomer dopet med to molar prosent fosfatidylinositol-4-fosfat og utføre målinger med NBD-PH FAPP-sonden. Utfør kontrolleksperimenter og bestem utvinningsprosenten. Etter å ha fullført ekstruderende liposomer fylle et rør Med disse ekstruderte liposomer.
Forbered nygasset og filtrert HKM-buffer og hold rørene som inneholder ekstruderte liposomer ved romtemperatur. Vikle rør som inneholder liposomer med rhodamin merket fosfatidyletanolamin i aluminiumsfolie og oppbevar dem i en ugjennomsiktig boks for å forhindre fotobleking. Sett temperaturen mellom 25 og 37 grader Celsius og juster eksitasjonskromometerne til 460 nanometer med en kort båndbredde på ett til tre nanometer og utslipp til 530 nanometer med en stor båndbredde på mer enn 10 nanometer.
Sett anskaffelsestiden til tjuefem minutter med tidsoppløsningen på maksimalt ett sekund. I kvarts cuvette fortynne 30 mikroliter av LA liposome suspensjon og NBD-C2 lakt lagerløsning og prewarm HKM buffer for å forberede en 570 mikroliter prøve som inneholder 200 mikromolar totalt lipider og 250 nanomolar eller NBD-C2 lakt. Tilsett en liten magnetisk rørestang og plasser cuvette i fluorometerholderen.
Når prøven er termisk likevektet, utløser du målingen. Etter ett minutt, tilsett 30 mikroliter av LB liposomet suspensjon til prøven. Etter tre minutter injisere LTP i prøven slik at den endelige konsentrasjonen av LTP er 200 nanomolar, deretter skaffe signalet for de resterende 21 minuttene.
Utfør et parallelt eksperiment for å normalisere NBD-signalet. Bland 30 mikroliter LA likevekt liposome suspensjon med 250 nanomolar NBD-C2 lakt i HKM buffer på et endelig volum på 570 mikroliter. Etter ett minutt, injiser 30 mikroliter LB likevekt liposom suspensjon.
Konverter de kinetiske kurvene målt med en LTP av interesse for å bestemme mengden PS som overføres fra LA til LB liposomer over tid. Normaliser deretter hvert datapunkt i kurven. Utfør PI(4)P-eksperimentet med samme gulvemitterinnstillinger og -betingelser som for PS-overføringsanalysen.
I cuvette blander du 30 mikroliter lb liposomfjæring og NBD-PH FAPP-sonde med forvarmet HKM-buffer for å oppnå et endelig volum på 570 mikroliter. Når den termiske likevekten av prøven er nådd, start målingen. Etter ett minutt, injiser 30 mikroliter LA liposome suspensjon.
Etter tre minutter injiserer du LTP av interesse og registrerer signalet. Utfør et nytt eksperiment for å normalisere NBD-signalet. Bland 30 mikroliter lb likevekt liposome suspensjon med 250 nanomolar NBD-PH FAPP og 570 mikroliter HKM buffer.
Etter ett minutt, injiser 30 mikroliter LA likevekt liposole suspensjon. Konverter de kinetiske kurvene for å bestemme mengden PI(4)P som overføres fra LB til LA-liposomer over tid, og normaliser deretter hvert datapunkt. For å kvantifisere omfanget av hvilken ltp er effektiv.
Utfør en lineær regresjon av de første datapunktene i overføringskinetikken for å få en skråning. Del hellingsverdien ved LTP-konsentrasjonen i reaksjonsblandingen for å bestemme antall lipidmolekyler overført per protein per tidsenhet. Effektiv utvinning av C2 lakt fra perlene ble verifisert med SDS sideanalyse.
Det ultrafiolette synlige absorberende spekteret av C2 lakt merket med NBD bekreftet at alle C2 laktmolekyler ble merket med en NBD-gruppe. Renheten til NBD-C2 lakt og fluorescens ble bestemt av SDS sideanalyse. Fluorescensen til NBD-C2 lakt eller NBD-PH FAPP var maksimal når bare liposomer som inneholder PS eller PI(4)P ble brukt til inkubasjon, noe som indikerer at sensoren var membranbundet.
En lav fluorescens ble sett da Osh6p også var til stede, noe som indikerer at dette proteinet effektivt ekstrahert PS eller PI (4)P fra liposomer. Resultatene fra en PS-overføringsanalyse som bruker Osh6p som LTP, vises. De gjennomsnittlige kinetiske kurvene for PS-overføring fra LA-liposomer til LB-liposomer, doped eller ikke dopet med fosfatidylinositol-4-fosfat ble beregnet.
Den gjennomsnittlige innledende PS-transportraten ble bestemt fra tre forskjellige eksperimenter. På samme måte vises resultater fra en PI(4)P-overføringsanalyse ved hjelp av Osh6p som LTP her. Sammen med de gjennomsnittlige kinetiske kurvene oppnådd etter signal normalisering.
Gjennomsnittlige overføringshastigheter ble målt med LA-liposomer som ble dopet eller ikke dopet med PS. Når du utfører denne protokollen, bruk fersk buffer og forbered de samme dagene. Minimer lyseksponering av florescerende liposomer og proteiner, bruk godt renset NBD-merket protein og hold dem på is. bekreftes ved å måle PS- og PI(4)P-overføring mellom organelle inne i den prokaryote cellen ved hjelp av genetisk kodede fluorescerende lipidsensorer.
Denne teknikken baner en vei til en bedre forståelse av PS og PI(4) er fordelt i cellen, og deres aktivitet gjennomgår spesifisitet av flere LTPS.