Denna metod använder fluorescens för att avgöra om ett protein överförs till biologiskt viktiga liqider mellan syntetiskt membran och därmed bidra till fördelningen av dessa lipider inuti eukaryota celler. Denna teknik gör det möjligt att extrahera och transportera en naturlig lipid av ett protein, det kräver och fluorescensceller och liposomer som är lätta att göra. Denna metod kan användas och modifieras för att få insikt i cellbiologi genom proteiner bakom fördelningen av några viktiga lipider mellan organ och membran.
Visuell demonstration är avgörande för att förklara hur man utför realtidsmätningar av lipidöverföring genom fluorescens. Så att demonstrera proceduren kommer också att vara Maud Magdeleine, en ingenjör för mitt laboratorium. Börja med att förbereda färsk filtrerad och avgasad HEPES kaliumacetatbuffert, kompletterad med en millimolär magnesiumklorid för att bilda HKM-buffert.
Förbered sedan liposomer endast gjorda av PC eller dessutom dopade med två molar procent PS eller PI(4)P. Placera kolven på en roterande förångare för att torka lipiden under vakuum. Blanda liposomer som innehåller två molar procent PS med lipidsensor, NBD-C2 Lact, i en brunn till en slutlig koncentration på 250 nanomolar och en volym på 100 mikroliter.
Fyll en andra brunn med samma mängd liposom och NBD-C2-lakt blandat med tre mikromolar lipidöverföringsprotein eller LTP. Fyll en tredje brunn med 250 nanomolar NBD-C2 lakt blandat med rena 80 mikromolar PC liposomer och en fjärde brunn med rena 80 mikromolar PC liposomer. Upprepa dessa steg för att förbereda ytterligare tre serier med fyra brunnar.
Placera sedan multibrunnsplattan i fluorescensläsaren. För varje brunn registrera ett NBD-spektrum från 505 till 650 nanometer med en bandbredd på fem nanometer vid excitation vid 490 nanometer vid 25 grader Celsius. För varje serie subtrat spektrumet registreras med endast liposomer från andra spektra.
För PI(4)P extraktionsanalysen bereda liposomer dopade med två molar procent fosfatidylinositol-4-fosfat och utför mätningar med NBD-PH FAPP sonden. Utför kontroll experiment och bestäm utsugs procentsatsen. Efter avslutad extruderande liposomer fyll ett rör med dessa extruderade liposomer.
Förbered nyförgasad och filtrerad HKM-buffert och håll rören som innehåller extruderade liposomer vid rumstemperatur. Linda rör som innehåller liposomer med rhodaminmärkt fosfatidyletanolamin i aluminiumfolie och förvara dem i en ogenomskinlig låda för att förhindra fotoblekning. Ställ in temperaturen mellan 25 och 37 grader Celsius och justera excitationsmonkrommetrarna till 460 nanometer med en kort bandbredd på en till tre nanometer och utsläpp till 530 nanometer med en stor bandbredd på mer än 10 nanometer.
Ställ in förvärvstiden på tjugofem minuter med tidsupplösningen högst en sekund. I kvarts cuvette späd 30 mikroliter av LA liposom suspension och NBD-C2 lakt lagerlösning och prewarm HKM buffert för att förbereda ett 570 mikroliter prov som innehåller 200 mikromolar totala lipider och 250 nanomolar eller NBD-C2 lakt. Tillsätt en liten magnetisk omrörningsstång och placera cuvetten i fluorometerhållaren.
När provet är termiskt jämvikt utlöser mätningen. Efter en minut, tillsätt 30 mikroliter av LB-liposomupphängningen i provet. Efter tre minuter injicera LTP i provet så att den slutliga koncentrationen av LTP är 200 nanomolar och sedan förvärva signalen under de återstående 21 minuterna.
Utför ett parallellt experiment för att normalisera NBD-signalen. Blanda 30 mikroliter LA jämviktsliposomupphängning med 250 nanomolar NBD-C2-lakt i HKM-buffert med en slutlig volym på 570 mikroliter. Efter en minut, injicera 30 mikroliter LB jämvikt liposom suspension.
Konvertera de kinetiska kurvorna mätta med en LTP av intresse för att bestämma mängden PS som överförs från LA till LB-liposomer över tid. Normalisera sedan varje datapunkt i kurvan. Utför PI(4)P-experimentet med samma inställningar och villkor för golvemitteraren som för PS-överföringsanalysen.
Blanda 30 mikroliter lb liposomfjädring och NBD-PH FAPP-sond med förvärmd HKM-buffert i cuvetten för att få en slutlig volym på 570 mikroliter. När provet har uppnåtts börjar du mäta. Efter en minut, injicera 30 mikroliter LA liposom suspension.
Efter tre minuter injicerar du LTP av intresse och spelar in signalen. Utför ett andra experiment för att normalisera NBD-signalen. Blanda 30 mikroliter lb equilibrium liposomupphängning med 250 nanomolar NBD-PH FAPP och 570 mikroliter HKM-buffert.
Efter en minut, injicera 30 mikroliter LA jämvikt liposom suspension. Konvertera de kinetiska kurvorna för att bestämma mängden PI(4)P som överförs från LB till LA-liposomer över tid och normalisera sedan varje datapunkt. För att kvantifiera i vilken utsträckning en LTP är effektiv.
Utför en linjär regression av de första datapunkterna i överföringskinetiken för att få en lutning. Dividera lutningsvärdet med LTP-koncentrationen i reaktionsblandningen för att bestämma antalet lipidmolekyler som överförs per protein och tidsenhet. Effektiv återvinning av C2 lakt från pärlor verifierades med SDS sida analys.
Ultraviolett synliga absorberande spektrum av C2 lakt märkt med NBD bekräftade att alla C2 lakt molekyler var märkta med en NBD grupp. Renheten hos NBD-C2 lakt och dess fluorescens fastställdes av SDS sida analys. Fluorescensen av NBD-C2 lakt eller NBD-PH FAPP var maximal när endast liposomer som innehåller PS eller PI(4)P användes för inkubation, vilket indikerar att sensorn var membranbunden.
En låg fluorescens sågs när Osh6p också var närvarande som indikerar att detta protein effektivt extraheras PS eller PI(4)P från liposomer. Resultaten från en PS-överföringsanalys med Osh6p som LTP visas. De genomsnittliga kinetiska kurvorna för PS överföring från LA liposomer till LB liposomer, dopade eller inte dopade med fosfatidylinositol-4-fosfat beräknades.
Den genomsnittliga initiala PS-transporthastigheten fastställdes från tre olika experiment. På samma sätt visas resultat från en PI(4)P överföringsanalys med Osh6p som LTP här. Tillsammans med de genomsnittliga kinetiska kurvor som erhålls efter signalnormalisering.
Genomsnittliga överföringshastigheter mättes med LA-liposomer som var dopade eller inte dopade med PS. När du utför det här protokollet använder du ny buffert och förbereder samma dagar. Minimera ljusutläggning av florescenta liposomer och proteiner, använd väl renat NBD-märkt protein och håll dem på is. kan bekräftas genom att ps- och PI(4)P-överföring mäts mellan organell inuti prokaryota celler med hjälp av genetiskt kodade fluorescerande lipidsensorer.
Denna teknik banar väg för en bättre förståelse av PS och PI(4)fördelas inom cellen, och deras aktivitet genomgår specificitet av flera LTPS.