Name: myosin-specific adaptations of in vitro fluorescence microscopy-based motility assays
Uploaded: 2021-02-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays at JoVE.com

Vi takker Dr. Fang Zhang for teknisk bistand med forberedelsen af de reagenser, der anvendes til indsamling af disse data. Dette arbejde blev støttet af NHLBI / NIH Intramural Research Program midler HL001786 til JRS

1. Rensning af proteiner
<ol><li>Celle lysis og proteinudvinding<ol>
<li>Forbered en 1,5x udpakningsbuffer baseret på tabel 1. Filtreres og opbevares ved 4 °C.</li>
		<li>Begynd at optø cellepillerne på is. Pellets optøning, supplerer 100 mL ekstraktionsbuffer med 1,2 mM dithiothreitol (DTT), 5 μg/mL leupeptin, 0,5 μM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) og to proteasehæmmertabletter. Bliv ved med at være på is.</li>
		<li>Når pellet er optøet, tilsættes 1 mL af den supplerede ekstraktionsbu...

Præsenteret her er en arbejdsgang for rensning og in vitro karakterisering af myosin 5a og nonmuscle myosin 2b. Dette sæt eksperimenter er nyttigt til at kvantificere de mekanokemiske egenskaber af rensede myosinkonstruktioner på en hurtig og reproducerbar måde. Selvom de to myosiner, der vises her, kun er to specifikke eksempler ud af de mange muligheder, kan betingelserne og teknikkerne anvendes med nogle skræddersyning til de fleste myosiner og til mange andre motorproteiner.
De protok...

Myosiner er motoriske proteiner, der udøver kraft på actin filamenter ved hjælp af energi stammer fra adenosin triphosphat (ATP) hydrolyse1. Myosiner indeholder et hoved-, hals- og haledomæne. Hoveddomænet indeholder det handlingsbindende område samt STEDET for ATP-binding og hydrolyse. Halsdomænerne består af IQ-motiver, der binder sig til lyskæder, calmodulin eller calmodulinlignende proteiner2,3. Halen regionen har flere funktioner, der er specifikke for hver klasse af myosiner, herunder men ikke begrænset til dimerisering af to tunge kæder, binding af lastmolekyler og regulering af myosin via autoinhibitory interaktioner med hoveddomænerne1.
Myosins bevægelige egenskaber varierer meget mellem klasserne. Nogle af disse egenskaber omfatter toldforhold (den brøkdel af myosins mekaniske cyklus, hvor myosinen er bundet til at virke) og processivitet (en motors evne til at foretage flere trin på sit spor før løsrivelse)4. De over 40 klasser af myosiner blev bestemt på grundlag af sekvensanalyser5,6,7,8. Klasse 2 myosiner er klassificeret som "konventionelle", da de var de første til at blive undersøgt; alle andre klasser af myosiner er derfor klassificeret som "ukonventionelle.".
Myosin 5a (M5a) er en klasse 5 myosin og er en procesiv motor, hvilket betyder, at den kan tage flere skridt langs actin før dissociating. Det har et højt toldforhold, hvilket indikerer, at det bruger en stor del af sin mekaniske cyklus bundet til at actin9,10,11,12,13,14. I lighed med andre myosiner indeholder den tunge kæde et N-terminalmotordomæne, der omfatter både et actin-bindings- og et ATP-hydrolysested efterfulgt af en halsregion, der fungerer som løftestangsarm, med seks IQ-motiver, der binder sig til essentielle lyskæder (ELC) og calmodulin (CaM)15. Haleregionen indeholder α-spiralformede oprullede spoler, som dæmper molekylet, efterfulgt af en kugleformet haleregion til binding af last. Dens kinetik afspejler dens involvering i transport af melanosomer i melanocytter og af det endoplasmiske reticulum i Purkinje neuroner16,17. M5a betragtes som den prototypiske lasttransportmotor18.
Klasse 2 myosiner, eller de konventionelle myosiner, omfatter myosiner, at magt sammentrækning af skelet, hjerte, og glat muskel ud over nonmuscle myosin 2 (NM2) isoformer, NM2a, 2b, og 2c19. NM2 isoformer findes i cytoplasma af alle celler og har fælles roller i cytokinesis, vedhæftning, væv morfogenese, og celle migration19,20,21,22. Dette papir diskuterer konventionelle myosin protokoller i forbindelse med nonmuscle myosin 2b (NM2b)23. NM2b, i forhold til M5a, har en lav told ratio og er enzymatisk langsommere med en Vmax på 0,2 s-123 i forhold til M5a's Vmax på ≈18 s-124. Især afkortede NM2b-konstruktioner med to hoveder bevæger sig ikke let processivt på actin; snarere, hvert møde med actin resulterer i en magt slagtilfælde efterfulgt af dissociation afmolekylet 25.
NM2b indeholder to myosin tunge kæder, hver med en kugleformet hoved domæne, en løftestang-arm (med en ELC og en regulerende lyskæde (RLC)), og en α-spiralformede coiled-coil stang / hale domæne, ca 1.100 aminosyrer lang, at dæmper disse to tunge kæder. NM2b's enzymatiske aktivitet og strukturelle tilstand reguleres af fosforylering af RLC23. Unphosphorylated NM2b, i nærværelse af ATP og fysiologiske ioniske styrker (ca. 150 mM salt), vedtager en kompakt kropsbygning, hvori de to hoveder gør deltage i en asymmetrisk interaktion og halen folder tilbage over hovedet to steder23. I denne tilstand interagerer myosin ikke stærkt med actin og har meget lav enzymatisk aktivitet. Ved RLC fosforylering ved calmodulin-afhængige myosin lyskæde kinase (MLCK) eller Rho-associeret protein kinase, molekylet udvider og forbinder med andre myosiner gennem halen regionen til at danne bipolar filamenter af ca 30 myosin molekyler23. Ovennævnte fosforylering af RLC fører også til øget actin-aktiveret ATPase aktivitet NM2b med ca . Denne bipolar glødetråd arrangement, byder på mange myosin motorer i hver ende, er optimeret til roller i sammentrækning og spænding vedligeholdelse, hvor actin filamenter med modsatrettede polariteter kan flyttes i forhold til hinanden23,29. Derfor har NM2b vist sig at fungere som et ensemble af motorer, når de interagerer med actin. Det store antal motorer i denne glødetråd gør det muligt for NM2b filamenter at bevæge sig forarbejdet på actin filamenter, hvilket gør in vitro filament processivitet muligt at karakterisere29.
Mens der er gjort fremskridt med at forstå myosins rolle i cellen, er der behov for at forstå deres individuelle egenskaber på proteinniveau. For at forstå actomyosin interaktioner på et simpelt protein-protein interaktionsniveau, snarere end inde i en celle, kan vi udtrykke og rense rekombinante myosiner til brug i in vitro undersøgelser. Resultaterne af sådanne undersøgelser informerer derefter mekanobiologer om de biofysiske egenskaber ved specifikke myosiner, der i sidste ende driver komplekse cellulære processer12,13,14,25,29. Typisk opnås dette ved at tilføje en affinitet tag til en fuld længde eller afkortet myosin konstruere og rense via affinitet kromatografi29,30,31. Derudover kan konstruktionen konstrueres til at omfatte en genetisk kodbar fluorophore eller et tag til proteinmærkning med en syntetisk fluorophore. Ved at tilføje en sådan fluorescerende etiket, enkelt molekyle billeddannelse undersøgelser kan udføres for at observere myosin mekanik og kinetik.
Efter rensning kan myosinen karakteriseres på flere måder. ATPase aktivitet kan måles ved hjælp af kolorimetriske metoder, der giver indsigt i motorens samlede energiforbrug og handle i affinitet under forskellige forhold32. For at lære om mekanokemien af dens motilitet kræves yderligere eksperimenter. Dette papir beskriver to in vitro fluorescensmikroskopibaserede metoder, der kan bruges til at karakterisere de bevægelige egenskaber ved et renset myosinprotein.
Den første af disse metoder er den glidende actin filament assay, som kan bruges til kvantitativt at studere myosinmotorernes ensembleegenskaber samt kvalitativt studere kvaliteten af et parti renset protein33. Selv om dette papir diskuterer brugen af total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi til denne analyse, kan disse eksperimenter effektivt udføres ved hjælp af en wide-field fluorescens mikroskop udstyret med et digitalt kamera, almindeligvis findes i mangelaboratorier 34. I denne analyse er et mætningslag af myosinmotorer fastgjort til en coverlip. Dette kan opnås ved hjælp af nitrocellulose, antistoffer, membraner, SiO2-derivatiserede overflader (såsom trimethylchlorosilane), blandt andet29,33,35,36,37,38. Fluorescerende mærket actin filamenter er passeret gennem coverslip kammer, hvorpå actin binder sig til myosin fastgjort til overfladen. Ved tilsætning af ATP (og kinaser i studiet af NM2) afbildes kammeret for at observere translokationen af actin filamenter ved de overfladebundne myosiner. Sporingssoftware kan bruges til at korrelere hastigheden og længden af hver glidende actin filament. Analysesoftware kan også give et mål for antallet af både bevægelige og stationære aktinfilamenter, hvilket kan være nyttigt at bestemme kvaliteten af en given myosinforberedelse. Andelen af gået i stå filamenter kan også bevidst moduleres ved overflade tøjring af actin til andre proteiner og måles for at bestemme belastningen afhængighed af myosin39. Da hver actin filament kan fremdrives af et stort antal tilgængelige motorer, er denne analyse meget reproducerbar, idet den endelige målte hastighed er robust til forstyrrer såsom ændringer i start myosinkoncentrationen eller tilstedeværelsen af yderligere faktorer i opløsningen. Det betyder, at det let kan ændres for at studere myosinaktivitet under forskellige forhold, såsom ændret fosforylering, temperatur, ionstyrke, opløsningsviskositet og virkningerne af belastning induceret af overfladeliner. Selv om faktorer som stærkt bindende myosin "døde hoveder" ude af stand til ATP hydrolyse kan forårsage gået i stå actin filamenter, flere metoder findes for at afbøde sådanne problemer og give mulighed for nøjagtige målinger. Myosins kinetiske egenskaber varierer meget på tværs af klasser, og afhængigt af den specifikke myosin, der anvendes, kan hastigheden af actin filament glide i denne analyse variere fra under 20 nm / s (myosin 9)40,41og op til 60.000 nm / s(Characean myosin 11)42.
Den anden analyse inverterer geometrien af den glidende actin filament assay12. Her er actin filamenter fastgjort til coverslip overfladen og bevægelsen af enkelte molekyler af M5a eller af individuelle bipolære filamenter af NM2b visualiseres. Denne analyse kan bruges til at kvantificere løbelængder og hastigheder af enkelt myosin molekyler eller filamenter på actin. En coverlip er belagt med en kemisk forbindelse, der blokerer ikke-specifik binding og samtidig funktionaliserer overfladen, såsom biotin-polyethylen glycol (biotin-PEG). Tilsætningen af modificerede avidinderivater derefter primtal overfladen og biotinylerede actin er passeret gennem kammeret, hvilket resulterer i et lag af F-actin stabilt bundet til bunden af kammeret. Endelig er aktiveret og fluorescerende mærket myosin (typisk 1-100 nM) flød gennem kammeret, som derefter afbildes for at observere myosin bevægelse over den stationære actin filamenter.
Disse modaliteter repræsenterer hurtige og reproducerbare metoder, der kan anvendes til at undersøge dynamikken i både nonmuscle og muskel myosiner. Denne rapport skitserer procedurerne for rensning og præget af både M5a og NM2b, der repræsenterer henholdsvis ukonventionelle og konventionelle myosiner. Dette efterfølges af en diskussion af nogle af de myosin-specifikke tilpasninger, som kan udføres for at opnå en vellykket indfangning af bevægelse i de to typer af analysen.
Udtryk og molekylærbiologi CDNA for myosin af interesse skal klones på en modificeret pFastBac1 vektor, der koder for enten en C-terminal FLAG-tag (DYKDDDDK), hvis der udtrykkes M5a-HMM, eller en N-terminal FLAG-tag, hvis der udtrykkes fuld længde molekyle af NM2b23,43,44,45,46. C-terminal FLAG-tags på NM2b resulterer i en svækket affinitet af proteinet for FLAG-affinitet kolonne. I modsætning hertil binder N-terminalt FLAG-mærket protein normalt godt til FLAG-affinitetskolonnen23. Det N-terminalt mærkede protein bevarer enzymatisk aktivitet, mekanisk aktivitet og fosforyleringsafhængig regel23.
I dette papir, en afkortet mus M5a tunge meromyosin (HMM)-lignende konstruere med en GFP mellem FLAG-tag og C-endestation af myosin tung kæde blev brugt. Bemærk, at I modsætning til NM2b kan M5a-HMM mærkes og renses med enten N- eller C-terminal FLAG-tags, og i begge tilfælde vil den resulterende konstruktion være aktiv. Den tunge M5a-kæde blev afkortet ved aminosyre 1090 og indeholder en tre aminosyreforbindelse (GCG) mellem GFP og spole-spoleregionen I M5a47. Der blev ikke tilføjet yderligere linker mellem GFP- og FLAG-koden. M5a-HMM blev co-udtrykt med calmodulin. Den menneskelige NM2b-konstruktion i fuld længde blev udtrykt i samarbejde med ELC og RLC. N-termini af RLC blev fusioneret med en GFP via en linker af fem aminosyrer (SGLRS). Direkte knyttet til FLAG-tag var en HaloTag. Mellem HaloTag og N-endestation af myosin tunge kæde var en linker lavet af to aminosyrer (AS).
Begge myosinpræparater blev renset fra en liter Sf9 cellekultur inficeret med baculovirus ved en tæthed på ca. 2 x 106 celler / mL. Mængderne af baculovirus for hver underenhed afhang af virusets mangfoldighed af infektion som bestemt af producentens instruktioner. I tilfælde af M5a, celler blev co-inficeret med to forskellige baculovirus-en for calmodulin, og en for M5a tung kæde. I tilfælde af NM2b, celler blev co-inficeret med tre forskellige vira-en for ELC, en for RLC, og en for NM2b tung kæde. For laboratorier, der arbejder med en mangfoldighed af myosiner (eller andre multikomplekse proteiner), er denne tilgang effektiv, da den giver mulighed for mange kombinationer af tunge og lette kæder og almindeligt anvendte lyskæder som calmodulin kan co-transfected med mange forskellige myosin tunge kæder. Alt cellearbejde blev afsluttet i et biosikkerhedsskab med korrekt steril teknik for at undgå forurening.
Til udtryk for både M5a og NM2b blev Sf9-cellerne, der producerer rekombinant myosiner, indsamlet 2-3 dage efter infektion via centrifugering og opbevaret ved -80 °C. Cellepiller blev fremkomet ved at centrifugere de co-inficerede Sf9-celler ved 4 °C i 30 minutter ved 2.800 x g. Proteinrensningsprocessen er beskrevet nedenfor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M CaCl2 Solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M MgCl2 Solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl Solution</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGE-3270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>984303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amyl Acetate</td>
			<td>Ladd Research Industries</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated G-Actin</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>AB07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bPEG-silane</td>
			<td>Laysan Bio, Inc</td>
			<td>Biotin-PEG-SIL-3400-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin</td>
			<td></td>
			<td>PMID: 2985564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11496015</td>
			<td>http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular Filter Paper - Gliding Assay</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WHA1001125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular Filter Paper - Inverted Assay</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5056489001</td>
			<td>This should be stored at 4 &#176;C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 &#176;C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrating Tubes (100,000 MWCO)</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>The MWCO of the tube is not necessarily &#34;one size fits all,&#34; as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Rack</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z688568-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips: Gliding Acting Filament Assay</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48366-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips: Inverted Motility Assay</td>
			<td>Azer Scientific</td>
			<td>ES0107052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>08-670-5A</td>
			<td>The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Sided Tape</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>909955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYKDDDDK Peptide</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>RP10586</td>
			<td>This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 &#176;C as 300 &#181;L aliquots.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>761-1550</td>
			<td>These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4&#176; C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-actin</td>
			<td></td>
			<td>PMID: 4254541</td>
			<td>G-actin stock can be stored at 200 &#956;M in liquid N2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-295018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Orifice Pipet Tips</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>02-707-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin Protease Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark12 Unstained Standard Ladder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MX0482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>12-553-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP308-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-silane</td>
			<td>Laysan Bio, Inc</td>
			<td>MPEG-SIL-2000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain Kinase</td>
			<td></td>
			<td>PMID: 23148220</td>
			<td>FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Ladd Research Industries</td>
			<td>10800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>78830</td>
			<td>PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 &#176;C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>397492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R415</td>
			<td>Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 &#956;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12658-027</td>
			<td>This should be stored at 4&#176; C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish - Gliding Assay</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td>Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish - Inverted Assay</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth-sided 200 &#181;L Pipette Tips</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158U38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75006590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Environmental Control Box</td>
			<td>Tokai HIT</td>
			<td>Custom Thermobox</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Laser Unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mid Bench Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Model: CR3i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Misonix Sonicator</td>
			<td>Misonix</td>
			<td>XL2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Cleaner</td>
			<td>Diener electronic GmbH + Co. KG</td>
			<td>System Type: Zepto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Probe (3.2 mm)</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>Model: 56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waverly Tube Mixer</td>
			<td>Waverly</td>
			<td>TR6E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ FIJI</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji/Downloads</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAST (Version 1.01)</td>
			<td>http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements</td>
			<td>FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Stabilizer Plugin</td>
			<td>https://imagej.net/Image_Stabilizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ TrackMate</td>
			<td>https://imagej.net/TrackMate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Software</td>
			<td>NIS Elements (AR package)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>File:TrackMate-manual.pdf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>https://github.com/turalaksel/FASTrack</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

myosin-specific adaptations of in vitro fluorescence microscopy-based motility assays

Myosinproteiner binder og interagerer med filamentøs actin (F-actin) og findes i organismer på tværs af det fylogenetiske træ. Deres struktur og enzymatiske egenskaber er tilpasset den særlige funktion, de udfører i celler. Myosin 5a forarbejder går på F-actin at transportere melanosomer og vesikler i celler. Omvendt fungerer nonmuscle myosin 2b som en bipolar filament, der indeholder ca. 30 molekyler. Det bevæger F-actin af modsatte polaritet mod midten af glødetråden, hvor myosin molekyler arbejde asynkront at binde actin, give en magt slagtilfælde, og dissociate før du gentager cyklus. Nonmuscle myosin 2b, sammen med sin anden nonmuscle myosin 2 isoformer, har roller, der omfatter celle vedhæftning, cytokinesis, og spænding vedligeholdelse. Mekanokemi af myosiner kan studeres ved at udføre in vitro motilitetsanalyser ved hjælp af rensede proteiner. I gliding actin filament assay, myosiner er bundet til et mikroskop coverlip overflade og translokere fluorescerende mærket F-actin, som kan spores. I enkelt molekyle / ensemble motilitet assay, dog F-actin er bundet til en coverlip og flytning af fluorescerende mærket myosin molekyler på F-actin observeres. I denne rapport er rensningen af rekombinant myosin 5a fra Sf9-celler ved hjælp af affinitetskromatografi skitseret. Efter dette skitserer vi to fluorescensmikroskopibaserede assays: den glidende actin filament assay og den omvendte motilitetsanalyse. Fra disse analyser kan parametre som actin translokation hastigheder og enkelt molekyle løbelængder og hastigheder udvindes ved hjælp af billedanalyse software. Disse teknikker kan også anvendes til at studere bevægelsen af enkelt filamenter af nonmuscle myosin 2 isoformer, diskuteret heri i forbindelse med nonmuscle myosin 2b. Denne arbejdsgang repræsenterer en protokol og et sæt kvantitative værktøjer, der kan bruges til at studere enkeltmolekyle- og ensembledynamikken i nonmuscle myosiner.

Rensningen af myosin kan evalueres ved at udføre reducere natrium dodecyl sulfat-polyacrylamid (SDS-PAGE) gel-elektrophoresis som vist i figur 2. Mens dette tal repræsenterer den endelige, post-dialyzed myosin, SDS-PAGE kan udføres på aliquots fra de forskellige stadier af rensningsproceduren for at identificere eventuelle produkter tabt til supernatant. Myosin 5a HMM har et band i 120-130 kDa rækkevidde og fuld længde nonmuscle myosin 2b har et band i 200-230 kDa rækkevidde, svarende...

Watch this Scientific Journal Video about Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays at JoVE.com

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Præsenteret her er en procedure for at udtrykke og rense myosin 5a efterfulgt af en diskussion af dens karakterisering, ved hjælp af både ensemble og enkelt molekyle in vitro fluorescens mikroskopi-baserede assays, og hvordan disse metoder kan ændres til karakterisering af nonmuscle myosin 2b.

Myosin-specifikke tilpasninger af In vitro Fluorescens Mikroskopi-Baserede Motilitet Assays

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Denne protokol kan bruges til at karakterisere ikke-muskel myosindynamik på proteinniveau, som kan informere de bevægelige egenskaber, der bidrager til deres roller i celler. Dette er en hurtig, reproducerbar og meget kontrolleret metode, der kan bruges til at studere virkningerne af forskellige lovgivningsmæssige forhold på myosinmotilitet og informere deres cellulære adfærd. Disse teknikker kan bruges til at undersøge, hvordan sygdomsfremkaldende mutationer i ikke-muskel myosiner påvirker deres adfærd på enkelt molekyle og ensemble niveau.Den generelle tilgang til dens metode kan anvendes på forskellige andre cytoskeletale systemer, såsom karakterisering af rensede kinesiner og dyneiner med mikrotubuli. Denne protokols alsidighed kan rejse spørgsmål om, hvilke fluorophorer og kemiske forhold der er mest hensigtsmæssige, men metoden kan optimeres relativt hurtigt. At forstå, hvordan man opsætter og belægger flowkamrene, giver et stærkt fundament, som man kan tilpasse sig forskellige forhold for disse eksperimenter på.Til at begynde med skal du forberede en en procent nitrocelluloseopløsning i amylacetat og placere et cirkulært filterpapir med en diameter på 125 millimeter på bunden af en vævskulturplade. Læg otte firkantede dæksedler på et stativ, og vask dem grundigt med ca. to til fem milliliter 200-bevis ethanol efterfulgt af to til fem milliliter destilleret vand. Kør derefter dækslet helt ved hjælp af en filtreret luftledning eller nitrogenledning.Langsomt pipette 10 mikroliter af en procent nitrocellulose løsning langs den ene kant af en dækning slip. Smør det over resten af dækslet slip ved hjælp af siden af en 200 mikroliter pipette spids i en glat bevægelse. Placer derefter dette dækslet slip på vævskulturen parabol med nitrocellulose side op.Gentag dette for de resterende dæksedler og lad dem tørre. Tør et mikroskop dias med en optisk linse papir til at rense store vragrester. Skær to stykker dobbeltsidet tape, cirka to centimeter i længden, og læg et stykke langs midten af mikroskopets lange kant.Placer det andet stykke tape ca. to millimeter under det første stykke tape, så de to er parallelle og skaber et flowkammer, der kan rumme ca. 10 mikroliter opløsning. Sæt forsigtigt et af nitrocellulosedækslet på båndet, så den side, der er belagt med nitrocellulose, kommer i direkte kontakt med båndet. Ved hjælp af en pipettespids skal du forsigtigt trykke ned på slidebåndsgrænsefladen for at sikre, at dækslet klæbes korrekt på diaset.Skær derefter det overskydende tape hængende over kanten af rutsjebanen med et barberblad. Forbered løsningerne til Myosin 5a og hold dem på is. Flow i 10 mikroliter af Myosin 5a gennem dias flow kammer og vente et minut.Derefter flow i 10 mikroliter på en milligram per milliliter BSA i motilitet buffer med DTT. Gentag dette to gange og vent et minut efter den tredje vask. Brug hjørnet af et silkepapir eller filtrerpapir til at transportere opløsningen gennem kanalen ved forsigtigt at placere papirets hjørne ved flowkammerets udgang.Vask derefter med 10 mikroliter motilitetsbuffer med DTT. Pipetter den sorte actinopløsning med en en milliliter sprøjte og en 27-gauge nål til at klippe actin filamenter, før der indføres denne opløsning til kammeret. Tilsæt den sorte actin til kammeret i nærværelse af en millimolar ATP i 50 millimolar MB med en millimolar DTT.Dernæst flow i 50 mikroliter af motilitet buffer med DTT og en millimolar ATP at nedbryde kammeret af frie actin filamenter. Vask med 10 mikroliter af motilitet buffer med DTT tre gange for at nedbryde kammeret af enhver ATP. Flow i 10 mikroliter af 20 nanomolar RH actin opløsning, der indeholder motilitet buffer med DTT og vente et minut til at tillade streng binding af actin filamenter til Myosin 5a fastgjort til overfladen af dækslet slip.Vask med 10 mikroliter på 50 millimolar motilitet buffer med DTT to gange for at fjerne ubundne RH actin filamenter. Flow i 30 mikroliter af endelig buffer. Optag billeder på et fluorescensmikroskop ved hjælp af en excitationsbølgelængde på 561 nanometer for at visualisere RH-aktinen.Forbered løsningerne til Myosin 5a omvendt motilitetsanalyse og hold dem på is. Vask dem kammer med 10 mikroliter af motilitet buffer med DTT. Flow i 10 mikroliter på et milligram per milliliter BSA i motilitet buffer med DTT.Gentag dette to gange og venter et minut efter den tredje vask. Brug silke eller filterpapir til at transportere opløsningen gennem kanalen ved forsigtigt at placere papirets hjørne ved flowkammerets udgang. Vask derefter kammeret med 10 mikroliter motilitetsbuffer med DTT tre gange.Flow i 10 mikroliter af NeutrAvidin-opløsningen i motilitetsbuffer med DTT og vent et minut. Vask derefter med 10 mikroliter af denne opløsning tre gange. Flow i 10 mikroliter BRH-aktin indeholdende motilitetsbuffer med DTT ved hjælp af en storboret pipettespids.Og vent et øjeblik. Vask derefter med 10 mikroliter motilitetsbuffer med DTT tre gange. Flow i 30 mikroliter af endelig buffer med 10 nanomolar Myosin 5a.Og straks indlæse på den samlede interne refleksion fluorescens mikroskop. Begynd at optage, når det optimale fokus for TIRF-billedbehandling er fundet. Rensningen af ikke-muskel Myosin 2b, væsentlige lyskæder og regulatoriske lyskæder samt Myosin 5a og calmodulin blev evalueret ved at udføre SDS-PAGE.Den glidende actin filament assay viser kendetegnene ved en ideel og sporbar film byder på glatte bevægelser af mærket actin filamenter. Den sorte actin vask sikrede, at de døde myosin hoveder blev fjernet fra målefeltet yderligere bidrager til den samlede glatte bevægelse af actin filamenter. Filament tracking output billeder fra fast track-programmet blev opnået for ikke-muskel Myosin 2b og Myosin 5a.Et repræsentativt histogram viser, at Actomyosin 2b glidehastigheden er 77 nanometer i sekundet. Og actomyosin 5a er 515 nanometer i sekundet. I mangel af methylcellulose forbliver actin filamenter ikke så tæt forbundet med den myosinbelagte overflade, hvilket får den til at floppe tæt på overfladen af den ikke-muskel myosin 2b-coatede dæksedler.Myosin bevægelse blev observeret på overflade-tøjret fluorescerende actin filamenter ved hjælp af den omvendte motilitet assay. Det er vigtigt at klippe den umærkede actin, før du introducerer den til flowcellen for den sorte actin vask, som vil give mulighed for glat translokation af actin. Yderligere eksperimenter kan undersøge, hvordan myosinmotilitet påvirkes af myosinmutationer, belastningsfremkaldende proteiner, ionstyrke og regulerende proteiner.Forskellige cellulære tilstande kan rekonstitueres til fremtidige undersøgelser. Disse metoder giver mulighed for biokemiske og biofysiske undersøgelser af, hvordan forskellige myosinisoformer varierer i deres bevægelige og mekaniske egenskaber på enkeltmolekyle- og ensembleniveau.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Cell Polarization and Migration

SCIENTISTS IN ACTION

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiseret Akustisk Udlevering til seriel fortynding af peptid agonister i Potens Bestemmelse assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Små kolorimetriske Assays af intracellulære laktat og pyruvat i at ødelægge Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantificering af hypopigmentering aktivitet In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering af fysiologisk aktive tylakoiderne og deres anvendelse i energiafhængige Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruger i Vitro fluorescens resonans energioverførsel at studere dynamikken i proteinkomplekser på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In vitro-allestedsnærværende og Deubiquitinationassays af Nukleosomale histoner

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

En planarian motilitet assay at måle biomodulerende egenskaber af naturlige produkter

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbaseret endonukleasekoblet DNA-methyleringsassay til screening for DNA-methyltransferasehæmmere

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

In vitro Karakterisering af histon chaperoner ved hjælp af analytiske, pull-down og chaperoning assays

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Kvantificering af bakteriel overflade sværmende bevægelighed på induktorgradientplader

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...