هذه الطريقة تسمح لك لزراعة البكتيريا في بيئة تؤدي إلى فسيولوجيا الخلايا مماثلة ومورفولوجيا بيو فيلم لتلك التي تراها في التهابات الرئة التليف الكيسي. الرئتين هي منتجات النفايات في صناعة اللحوم، لذلك لا توجد مخاوف أخلاقية. يوفر النموذج منصة لمحاكاة العدوى البشرية دون الحاجة إلى نموذج حيواني حي.
هذه التقنية يعطي الباحثين طريقة جديدة لفحص الأدوية المرشحة لاحتمال دخول وتدمير الأغشية الحيوية التي تتشكل في الرئتين التليف الكيسي. مع مزيد من التطوير والتحقق من الصحة، ونحن نعتقد أن نموذج EVPR يمكن أن يكون الاستخدام المحتمل لاختبار قابلية المضادات الحيوية المتخصصة والفردية. الحصول على الرئتين مباشرة بعد ذبح ونقلها إلى المختبر في صندوق بارد المحلية.
العمل على سطح معقم وتحت لهب. ضع الرئتين على لوحة تقطيع بلاستيكية نظيفة مغطاة بورق الألومنيوم المعبي تلقائيا ، وتحقق من أن القصيبات لا تزال سليمة. الرئتين ليست مناسبة للاستخدام إذا كان هناك أي ضرر في المسلخ أو أثناء النقل.
سخني سكين منصة نقالة تحت اللهب والمس السكين لفترة وجيزة إلى منطقة الرئة المحيطة بالبرونيكول لتعقيم سطح الأنسجة. قطع الأنسجة السطحية المحيطة برونشيول باستخدام شفرة حلاقة محمولة على العقيمة، مما يجعل شقوق موازية لبرونيكول لمنع أي ضرر. بمجرد أن يتعرض القصيبات الهوائية، قم بإجراء شق مقطعي عرضي عبر القصيبات الهوائية عند أعلى نقطة مرئية.
باستخدام ملقط معقم، عقد طفيفة نهاية حرة من القصيبات وقطع أي الأنسجة غير المرغوب فيها المتبقية باستخدام شفرة حلاقة محمولة على العقيمة. إجراء شق المقطع العرضي النهائي عبر الشعب الهوائية قبل أي تفريع مرئية لإزالة القصيبات من الرئتين. وضع القصيبات في أول غسل DMEM RPMI 1640.
اتركه في الغسيل وحصاد أجزاء إضافية من القصبات الهوائية من نفس الرئة لتسفر عن أقسام أنسجة كافية للتجربة المخطط لها. ضع أي أقسام إضافية من القصبات الهوائية من نفس الرئة في الغسيل واتركها في الغسيل لمدة دقيقتين على الأقل. إزالة القصيبات من الغسيل الأول، ووضع العينات في طبق بيتري معقمة.
عقد طفيفة كل القصيبات مع ملقط معقمة، مع الحرص على عدم تلف الأنسجة. إزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة الرخوة المتبقية، وقطع الأنسجة إلى شرائح خمسة ملليمترات واسعة باستخدام مقص تشريح معقمة. ضع جميع شرائط الأنسجة القصبية في غسل DMEM RPMI 1640 الثاني.
اتركها في الغسيل لمدة دقيقتين على الأقل، ثم أزيلي شرائح الأنسجة من الغسيل الثاني باستخدام ملقط معقم ووضعها في طبق بيتري نظيف ومعقم. إزالة أي الأنسجة الرخوة المتبقية تعلق على القصيبات، وقطع الشرائط إلى مربعات باستخدام مقص تشريح معقمة. إضافة الثالث DMEM RPMI 1640 يغسل في طبق بيتري ومزيج طفيفة قطع الأنسجة في غسل عن طريق تدوير الطبق.
صب غسل الثالث من طبق بيتري دون إزالة قطع الأنسجة. ثم أضف غسل SCFM النهائي، وضمان تغطية جميع قطع الأنسجة. تعقيم الأنسجة في SCFM تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس دقائق.
استخدام ملقط معقم لنقل كل قطعة أنسجة الشعب الهوائية المعقمة في آبار فردية من لوحة 24 جيدا تحتوي على منصات Agarose SCFM. لإصابة كل قطعة نسيج بالسلالة البكتيرية المطلوبة ، المس مستعمرة تزرع على طبق أجار مع طرف إبرة عيار 29 متصلة بحقنة الأنسولين المعقمة 0.5 ملليلتر ، ثم المس المستعمرة على قطعة الأنسجة ، وخز السطح بلطف. بالنسبة للضوابط غير المصابة ، وخز بلطف سطح قطعة الأنسجة مع غيض من الإبرة ، ثم استخدم ماصة لإضافة 500 ميكرولتر من SCFM إلى كل بئر.
تعقيم غشاء الختم تنفس لكل لوحة 24 جيدا تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق. إزالة الغطاء من لوحة 24 جيدا واستبداله مع غشاء تنفس، ثم احتضان لوحات في 37 درجة مئوية دون اهتزاز. إعداد مجموعات تكرار قطع الرئة من اثنين على الأقل من الرئتين مستقلة، وذلك باستخدام مجموعة واحدة للسيطرة السلبية، ومجموعة واحدة لكل تركيز من المضادات الحيوية ليتم اختبارها.
بعد 48 ساعة من الحضانة ، فحص بصريا قطع الأنسجة غير المصابة لنمو البكتيريا الذاتية ، مما يؤدي إلى أن تكون الوسائط المحيطة بهذه الأقسام عكرة. إذا لوحظ نمو نموذجي لأنواع الدراسة المختارة، فأعد تشغيل التجربة بالرئتين الطازجتين. إذا لم تظهر أقسام الأنسجة غير المصابة أي نمو بكتيري أو الحد الأدنى، فاستعد صفيحة غسيل واحدة من 24 بئرا ولوحة علاج واحدة من 24 بئرا.
يجب أن يحتوي كل بئر من لوحة العلاج على 500 ميكرولتر من SCFM الطازجة دون مضادات حيوية ، أو مع المضادات الحيوية ذات الاهتمام. إزالة كل قطعة الأنسجة المصابة من لوحة الحضانة مع ملقط اللهب المعقمة. دوامة لفترة وجيزة في بئر جديدة من لوحة الغسيل لإزالة أي خلايا بكتيرية غير بيو فيلم المرتبطة ونقله إلى البئر المناسب من لوحة العلاج.
ختم لوحة العلاج مع غشاء تنفس جديدة، ثم احتضانه في 37 درجة مئوية دون اهتزاز لمدة 18 إلى 24 ساعة. استخدم ملقط معقم باللهب لإزالة كل قطعة رئة من لوحة 24 بئرا ، ووضعها في أنبوب تجانس معقم من ملليلترين يحتوي على ملليلتر واحد من PBS وغرام واحد من الخرز المعدني. فاز حبة لمدة 40 ثانية في أربعة أمتار في الثانية الواحدة.
تخفيف تسلسلي تجانس الرئة باستخدام برنامج تلفزيوني، ولوحة على أجار LB لتحديد وحدات تشكيل مستعمرة في الفردية، غير المعالجة، وقطع الأنسجة المعالجة بالمضادات الحيوية. عندما تزرع في الرئة خنزير الجسم الحي السابق أو EVPL، الأغشية الحيوية من P.aeruginosa وS.aureus إظهار زيادة التسامح مع المضادات الحيوية بالمقارنة مع قابلية في معيار، وافقت الصناعة مرق هيئة التصنيع العسكري وأقراص المقايسات باستخدام وسائل الإعلام القياسية. الآثار المختلفة للمضادات الحيوية المختلفة على بيو فيلم EVPL المنشأة يمكن تمييزها.
على سبيل المثال، يتم تحقيق قتل P.aeruginosa في EVPL مع 4 إلى 16X هيئة التصنيع العسكري ciprofloxacin، ولكن ليس مع 4 إلى 8X هيئة التصنيع العسكري الكلورامفينيكول. مجموعات S.aureus المعرضة للخطوط في فحص القرص قادرة على البقاء على قيد الحياة تركيزات المصل المستهدف وأعلى في EVPL. حتى المقايسة المحسنة في المختبر لا يمكن التنبؤ بدقة بقابلية P.aeruginosa للكوليستين في EVPL.
كمية المضادات الحيوية المطلوبة لتحقيق ثلاثة سجل 10 قتل البكتيريا التي تزرع EVPL غالبا ما تكون أعلى بكثير من هيئة التصنيع العسكري أو MBEC محسوبة من المقايسات القياسية في المختبر. بالإضافة إلى التمييز بين العوامل المضادة للميكروبات، يمكن لهذا النموذج تسليط الضوء على التغيرات في قابلية في مراحل النمو البكتيرية المختلفة وفترات مختلفة المضادات الحيوية ال دوسينج. يظهر هنا التسامح المتزايد للأغشية الحيوية P.aeruginosa إلى ميروبينيم عندما تنضج.
تم قياس بقاء S.aureus على قيد الحياة في 4 و 24 ساعة بعد التعرض للفلوكلوكساسيلين ، مما يجعل من الممكن ملاحظة الاختلافات في تقليل عدد الخلايا البكتيرية عبر الزمن وبين العزلات. الاختلافات في الحمل البكتيري غالبا ما تزيد مع تمديد أوقات الثقافة. ويمكن رؤية ذلك في السيطرة غير المعالجة بعد تطوير بيو فيلم على مدار 48 ساعة والتعرض على مدار 24 ساعة أخرى لحساب الفاصل الزمني ل تناول المضادات الحيوية.
من المهم الحفاظ على تقنية معقمة ممتازة طوال فترة التشريح ، لذلك نوصي بإجراء التشريح في المختبر أو في منطقة من المختبر لا تستخدمها أبدا في أعمال علم الأحياء المجهرية. استخدمنا مؤخرا هذا النموذج لاستكشاف دخول الكوليستين إلى بيو فيلم، والنموذج لديه إمكانات جيدة للاستخدام في البحوث لتحسين تسليم الأدوية إلى الأغشية الحيوية.
