6.2K Views
•
09:26 min
•
January 22nd, 2021
DOI :
January 22nd, 2021
•0:04
Introduction
0:52
Dissection and Infection of Ex Vivo Pig Lung (EVPL) Tissue
4:45
Determination of Antibiotic Efficacy
6:39
Results: Screening Bacterial Isolates for Antibiotic Susceptibility with the EVPL Model
8:49
Conclusion
Transcript
Denne metode giver dig mulighed for at dyrke bakterier i et miljø, der udløser lignende cellefysiologi og biofilmmorfologi til det, som du ser i cystisk fibrose lungeinfektioner. Lungerne er affaldsprodukter i kødindustrien, så der er ingen etiske bekymringer. Modellen tilbyder en platform til at efterligne menneskelig infektion uden behov for en levende dyremodel.
Denne teknik giver forskerne en ny måde at screene kandidat medicin for potentialet til at komme ind og ødelægge biofilm, der dannes i cystisk fibrose lunger. Med yderligere udvikling og validering mener vi, at EVPR-modellen kan have potentiel brug for specialiserede og individualiserede antibiotikafølsomhedstest. Få lunger umiddelbart efter slagtning og transport dem til laboratoriet i en indenlandsk køleboks.
Arbejd på en steriliseret overflade og under en flamme. Placer lungerne på en ren plast skærebræt dækket med autoklaveret aluminiumsfolie, og kontrollere, at bronchioles forblive intakt. Lungerne er ikke egnede til brug, hvis der er sket skader på slagteriet eller under transport.
Varm en pallekniv under en flamme og rør meget kort kniven til det område af lungen, der omgiver bronchiolen for at sterilisere vævets overflade. Skær overfladevævet omkring bronchiolen væk ved hjælp af et sterilt monteret barberblad, hvilket gør snit parallelt med bronchiolen for at forhindre skader. Når bronchiolen er blevet udsat, skal du gøre et tværsnitsindsnit gennem bronchiolen på det højeste punkt synligt.
Brug sterile pincet, hold let den frie ende af bronchiolen og skær eventuelt resterende uønsket væv væk ved hjælp af et sterilt monteret barberblad. Lav et sidste tværsnitsindsnit over bronchiolen, før nogen forgrening er synlig for at fjerne bronchiolen fra lungerne. Placer bronchiole i den første DMEM RPMI 1640 vask.
Lad det blive i vasken og høst yderligere dele af bronchiol fra samme lunge for at give tilstrækkelige vævssektioner til det planlagte forsøg. Placer eventuelle yderligere bronchiolar sektioner fra samme lunge i vasken og lad dem i vasken i mindst to minutter. Fjern bronchiolerne fra den første vask, og læg prøverne i en steril petriskål.
Hold let hver bronchiole med sterile pincet, og pas på ikke at beskadige vævet. Fjern så meget resterende blødt væv som muligt, og skær vævet i fem millimeter brede strimler ved hjælp af steril dissektion saks. Placer alle bronchiolar væv strimler i den anden DMEM RPMI 1640 vask.
Efterlad dem i vasken i mindst to minutter, fjern derefter vævsstrimlerne fra den anden vask ved hjælp af sterile pincet og læg dem i en ren, steril petriskål. Fjern eventuelt resterende blødt væv, der er fastgjort til bronchiolen, og skær strimlerne i firkanter ved hjælp af steril dissektionssaks. Tilsæt den tredje DMEM RPMI 1640 vask i petriskålen og bland let vævsstykkerne i vasken ved at hvirvle skålen.
Hæld den tredje vask ud af petriskålen uden at fjerne vævsstykkerne. Tilsæt derefter den endelige SCFM-vask, der sikrer, at alle vævsstykkerne er dækket. Steriliser vævet i SCFM under UV-lys i fem minutter.
Brug sterile pincet til at overføre hver steriliseret bronchiolar væv stykke i individuelle brønde af en 24-brønd plade, der indeholder SCFM agarose puder. For at inficere hvert vævsstykke med den ønskede bakteriestamme skal du røre ved en koloni dyrket på en agarplade med spidsen af en 29-gauge nål fastgjort til en steril 0,5 milliliter insulinsprøjte og derefter røre ved kolonien på vævsstykket og forsigtigt stikke overfladen. For de uinficerede kontroller skal du forsigtigt stikke overfladen af vævsstykket med nålespidsen og derefter bruge en pipette til at tilføje 500 mikroliter SCFM til hver brønd.
Steriliser en åndbar tætningsmembran for hver 24-brønds plade under ultraviolet lys i 10 minutter. Fjern låget fra 24-brøndspladen og udskift det med den åndbare membran, og inkubter derefter pladerne ved 37 grader Celsius uden at ryste. Opsæt replikatsæt af lungestykker fra mindst to uafhængige lunger ved hjælp af et sæt til negativ kontrol og et sæt pr. koncentration af antibiotika, der skal testes.
Efter 48 timers inkubation inspiceres de uinficerede vævsstykker visuelt for vækst af endogene bakterier, hvilket ville få mediet omkring disse sektioner til at være uklart. Hvis der observeres en vækst, der er typisk for de udvalgte forsøgsarter, skal du genstarte forsøget med friske lunger. Hvis de uinficerede vævssektioner ikke viser nogen eller minimal bakterievækst, skal du forberede en 24-brønds vaskeplade og en 24-brøndsbehandlingsplade.
Hver brønd af behandlingspladen skal indeholde 500 mikroliter frisk SCFM uden antibiotika eller med det antibiotika, der er af interesse. Fjern hvert inficeret vævsstykke fra inkubationspladen med flammesteriliserede pincet. Svirr det kort i en frisk brønd på vaskepladen for at fjerne eventuelle ikke-biofilm-associerede bakterieceller og overføre det til den passende brønd af behandlingspladen.
Forsegl behandlingspladen med en frisk åndbar membran, og inkubter den derefter ved 37 grader Celsius uden at ryste i 18 til 24 timer. Brug flammesteriliserede pincet til at fjerne hvert lungestykke fra 24-brøndspladen, og læg det i et sterilt 2-milliliter homogeniseringsrør, der indeholder en milliliter PBS og et gram metalperler. Perleslag i 40 sekunder med fire meter i sekundet.
Fortynd lunge homogenatet serielt ved hjælp af PBS, og plade det på LB agar at bestemme kolonien danner enheder i individuelle, ubehandlet, og antibiotika-behandlede vævsstykker. Når de dyrkes i ex-vivo svine lungen eller EVPL, biofilm af P.aeruginosa og S.aureus demonstrere øget tolerance over for antibiotika i forhold til modtagelighed i standard, industri-godkendte bouillon MIC og disk assays ved hjælp af standard medier. De forskellige virkninger af forskellige antibiotika på en EVPL-etableret biofilm kan skelnes.
For eksempel opnås P.aeruginosa drab i EVPL med 4 til 16X MIC ciprofloxacin, men ikke med 4 til 8X MIC chloramphenicol. S.aureus populationer, der er modtagelige for linezolid i disken assay er i stand til at overleve mål-serum koncentrationer og højere i EVPL. Selv en optimeret in-vitro assay kan ikke præcist forudsige P.aeruginosa modtagelighed for colistin i EVPL.
Mængden af antibiotika, der kræves for at opnå tre log 10 drab på EVPL-dyrkede bakterier er ofte betydeligt højere end MIC eller MBEC beregnet ud fra standard in-vitro assays. Ud over at skelne mellem antimikrobielle midler kan denne model fremhæve ændringer i modtagelighed i forskellige bakterielle vækststadier og for forskellige antibiotikadoseringsintervaller. Den stigende tolerance over for P.aeruginosa biofilm til meropenem som de modnes er vist her.
S.aureus overlevelse blev målt ved 4 og 24 timer efter eksponering for flucloxacillin, hvilket gør det muligt at observere forskelle i reduktionen af bakteriecelletællinger over tid og mellem isolater. Variationer i bakteriebelastning øges ofte med udvidede kulturtider. Dette kan ses i den ubehandlede kontrol efter 48-timers biofilm udvikling og en yderligere 24-timers eksponering for at tage højde for antibiotika dosering interval.
Det er vigtigt at opretholde fremragende steril teknik i hele dissektionen, så vi anbefaler at gøre dissektionen i et laboratorium eller i et område af dit laboratorium, som du aldrig bruger til mikrobiologiarbejde. Vi har for nylig brugt modellen til at udforske indtræden af colistin i biofilm, og modellen har et godt potentiale for brug i forskning for at forbedre lægemiddellevering i biofilm.
Denne arbejdsgang kan bruges til at udføre antibiotika modtagelighed test ved hjælp af en etableret ex vivo model af bakteriel biofilm i lungerne hos personer med cystisk fibrose. Anvendelsen af denne model kan øge den kliniske validitet af MBEC -assays (minimal koncentration af biofilmudryddelse).
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved