Antibioticum werkzaamheid testen in een Ex vivo model van Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus Biofilms in de Cystic Fibrosis Lung

Met deze methode kunt u bacteriën kweken in een omgeving die vergelijkbare celfysiologie en biofilmmorfologie activeert als die welke u ziet bij cystische fibrose longinfecties. De longen zijn een afvalproduct in de vleesindustrie, dus er zijn geen ethische zorgen. Het model biedt een platform om menselijke infectie na te bootsen zonder dat er een levend diermodel nodig is.

Deze techniek geeft onderzoekers een nieuwe manier om kandidaat-geneesmiddelen te screenen op het potentieel om de biofilms die zich vormen in cystische fibroselongen binnen te dringen en te vernietigen. Met verdere ontwikkeling en validatie zijn we van mening dat het EVPR-model potentieel gebruik kan hebben voor gespecialiseerde en geïndividualiseerde antibioticagevoeligheidstests. Verkrijg longen onmiddellijk na het slachten en transporteer ze naar het laboratorium in een huishoudelijke koelbox.

Werk op een gesteriliseerd oppervlak en onder een vlam. Leg de longen op een schone plastic snijplank bedekt met autoclaaf aluminiumfolie en controleer of de bronchiolen intact blijven. De longen zijn niet geschikt voor gebruik als er schade is opgetreden in het slachthuis of tijdens het transport.

Verwarm een palletmes onder een vlam en raak het mes heel kort aan op het gebied van de long rond de bronchiol om het oppervlak van het weefsel te steriliseren. Snijd het oppervlakteweefsel rond de bronchiol weg met behulp van een steriel gemonteerd scheermesje, waardoor incisies parallel aan de bronchiol worden gemaakt om schade te voorkomen. Zodra de bronchiol is blootgesteld, maak je een dwarsdoorsnede door de bronchiol op het hoogste punt zichtbaar.

Houd met een steriele tang het vrije uiteinde van de bronchiol lichtjes vast en snijd het resterende ongewenste weefsel weg met behulp van een steriel gemonteerd scheermesje. Maak een laatste dwarsdoorsnede-incisie over de bronchiol voordat een vertakking zichtbaar is om de bronchiol uit de longen te verwijderen. Plaats de bronchiol in de eerste DMEM RPMI 1640 wasbeurt.

Laat het in de was en oogst extra secties van bronchiole uit dezelfde long om voldoende weefselsecties op te leveren voor het geplande experiment. Plaats eventuele extra bronchiolaire secties uit dezelfde long in de was en laat ze minstens twee minuten in de was staan. Verwijder de bronchiolen uit de eerste wasbeurt en plaats de monsters in een steriele petrischaal.

Houd elke bronchiole lichtjes vast met een steriele tang en zorg ervoor dat het weefsel niet wordt beschadigd. Verwijder zoveel mogelijk overgebleven zacht weefsel en snijd het weefsel in stroken van vijf millimeter breed met een steriele dissectieschaar. Plaats alle bronchiolaire weefselstrips in de tweede DMEM RPMI 1640 wasbeurt.

Laat ze minstens twee minuten in de was, verwijder vervolgens de tissuestrips uit de tweede wasbeurt met een steriele tang en plaats ze in een schone, steriele petrischaal. Verwijder het resterende zachte weefsel dat aan de bronchiol is bevestigd en snijd de stroken in vierkanten met een steriele dissectieschaar. Voeg de derde DMEM RPMI 1640 wasbeurt toe aan de Petrischaal en meng de tissuestukken in de was lichtjes door de schaal te wervelen.

Giet de derde was uit de Petrischaal zonder de weefselstukken te verwijderen. Voeg vervolgens de laatste SCFM-was toe, zodat alle weefselstukken bedekt zijn. Steriliseer het weefsel in SCFM onder UV-licht gedurende vijf minuten.

Gebruik steriele tangen om elk gesteriliseerd bronchiolaire weefselstuk over te brengen in individuele putten van een 24-putplaat met SCFM-agarose pads. Om elk weefselstuk te infecteren met de gewenste bacteriële stam, raak je een kolonie aan die op een agarplaat is gegroeid met de punt van een 29-gauge naald bevestigd aan een steriele insulinespuit van 0,5 milliliter en raak je de kolonie vervolgens aan op het weefselstuk en prikt u voorzichtig het oppervlak. Prik voor de niet-geïnfecteerde regelaars voorzichtig het oppervlak van het weefselstuk met de punt van de naald en gebruik vervolgens een pipet om 500 microliters SCFM aan elke put toe te voegen.

Steriliseer een ademend afdichtingsmembraan voor elke 24-put plaat onder ultraviolet licht gedurende 10 minuten. Verwijder het deksel van de 24-put plaat en vervang het door het ademende membraan en incubeer de platen vervolgens op 37 graden Celsius zonder te schudden. Stel repliceersets van longstukken op uit ten minste twee onafhankelijke longen, met behulp van één set voor een negatieve controle en één set per elke te testen concentratie antibioticum.

Inspecteer na 48 uur incubatie de niet-geïnfecteerde weefselstukken visueel op groei van endogene bacteriën, waardoor het medium rond deze secties troebel zou zijn. Als de groei die typisch is voor de geselecteerde studiesoort wordt waargenomen, start u het experiment opnieuw met verse longen. Als de niet-geïnfecteerde weefselsecties geen of minimale bacteriële groei vertonen, bereid dan één 24-wells wasplaat en één 24-well behandelingsplaat voor.

Elke put van de behandelingsplaat moet 500 microliter verse SCFM bevatten zonder antibiotica of met het antibioticum van belang. Verwijder elk geïnfecteerd weefselstuk van de incubatieplaat met een vlamgesteriliseerde tang. Wervel het kort in een verse put van de wasplaat om niet-biofilm-geassocieerde bacteriële cellen te verwijderen en breng het over naar de juiste put van de behandelingsplaat.

Sluit de behandelingsplaat af met een vers ademend membraan en incubeer het vervolgens op 37 graden Celsius zonder 18 tot 24 uur te schudden. Gebruik een vlamgesteriliseerde tang om elk longstuk van de 24-putplaat te verwijderen en doe het in een steriele homogenisatiebuis van twee milliliter met een milliliter PBS en een gram metalen kralen. Kraal sloeg 40 seconden met vier meter per seconde.

Verdun het longhomogenaat serieel met PBS en leg het op LB-agar om de kolonievormende eenheden te bepalen in individuele, onbehandelde en met antibiotica behandelde weefselstukken. Wanneer gekweekt in de ex-vivo varkenslong of EVPL, tonen biofilms van P.aeruginosa en S.aureus een verhoogde tolerantie voor antibiotica in vergelijking met gevoeligheid in standaard, door de industrie goedgekeurde bouillon MIC- en schijftesten met behulp van standaardmedia. De verschillende effecten van verschillende antibiotica op een EVPL-gevestigde biofilm zijn te onderscheiden.

Bijvoorbeeld, P.aeruginosa doden wordt bereikt in EVPL met 4 tot 16X MIC ciprofloxacine, maar niet met 4 tot 8X MIC chlooramfenicol. S.aureus populaties die gevoelig zijn voor linezolid in de schijftest zijn in staat om doel-serum concentraties te overleven en hoger in EVPL. Zelfs een geoptimaliseerde in-vitrotest kan de gevoeligheid van P.aeruginosa voor colistine in de EVPL niet nauwkeurig voorspellen.

De hoeveelheid antibioticum die nodig is om drie log 10-doden van EVPL-gekweekte bacteriën te bereiken, is vaak aanzienlijk hoger dan de MIC of de MBEC berekend op basis van standaard in-vitrotesten. Naast het onderscheiden van verschillen tussen antimicrobiële middelen, kan dit model veranderingen in gevoeligheid in verschillende bacteriële groeistadia en voor verschillende antibioticadoseringsintervallen benadrukken. De toenemende tolerantie van P.aeruginosa biofilms voor meropenem naarmate ze ouder worden, wordt hier getoond.

S.aureus overleving werd gemeten na 4 en 24 uur na blootstelling aan flucloxacilline, waardoor het mogelijk was om verschillen in de vermindering van het aantal bacteriële cellen in de tijd en tussen isolaten waar te nemen. Variaties in bacteriële belasting nemen vaak toe met langere kweektijden. Dit is te zien in de onbehandelde controle na 48-uurs biofilmontwikkeling en een verdere blootstelling van 24 uur om rekening te houden met het doseringsinterval van antibiotica.

Het is cruciaal om een uitstekende steriele techniek te behouden tijdens de dissectie, dus we raden aan om de dissectie in een lab of in een deel van uw laboratorium te doen dat u nooit gebruikt voor microbiologisch werk. We hebben het model onlangs gebruikt om de invoer van colistine in biofilm te onderzoeken, en het model heeft een goed potentieel voor gebruik in onderzoek om de levering van geneesmiddelen in biofilms te verbeteren.