이 방법은 낭포성 섬유증 폐 감염에서 보는 것과 유사한 세포 생리학 및 생물막 형태를 유발하는 환경에서 박테리아를 성장시킬 수 있습니다. 폐는 육류 산업에서 폐기물이므로 윤리적 인 우려는 없습니다. 이 모델은 살아있는 동물 모델없이 인간 감염을 모방할 수있는 플랫폼을 제공합니다.
이 기술은 연구원에게 낭포성 섬유증 폐에 형성하는 생물막을 입력하고 파괴하는 잠재력을 위한 후보약을 검열하는 새로운 쪽을 줍니다. 추가 개발 및 검증을 통해 EVPR 모델은 전문적이고 개별화된 항생제 감수성 검사에 잠재적으로 사용할 수 있다고 믿습니다. 도살 직후 폐를 획득하여 가정용 쿨 박스에 있는 실험실로 운반하십시오.
멸균 된 표면과 화염 아래에서 작업하십시오. 폐를 오토클레이브 알루미늄 호일로 덮인 깨끗한 플라스틱 도마에 놓고 기관지가 그대로 유지되어 있는지 확인합니다. 폐는 아바토이르에서 또는 수송 하는 동안 어떤 손상 이었는 경우에 사용하기에 적합하지 않습니다.
팔레트 나이프를 화염 밑에 가열하고 기관지 주변의 폐 부위에 칼을 아주 짧게 만져 조직의 표면을 살균합니다. 멸균 장착 면도날을 사용하여 기관지 주변의 표면 조직을 잘라 내어 손상을 방지하기 위해 기관지와 평행하게 절개를 만듭니다. 기관지가 노출되면 가장 높은 지점에서 기관지 절개를 통해 단면 절개를 합니다.
멸균 집게를 사용하여 기관지의 자유 끝을 가볍게 잡고 멸균 장착 면도날을 사용하여 남은 원치 않는 조직을 잘라냅니다. 어떤 분기가 폐에서 기관지 제거를 볼 수 있습니다 전에 기관지 전반에 걸쳐 최종 단면 절개를합니다. 첫 번째 DMEM RPMI 1640 워시에 기관지 치올을 배치합니다.
세척에 두고 계획된 실험에 대한 충분한 조직 섹션을 산출하기 위해 동일한 폐에서 기관지의 추가 섹션을 수확하십시오. 같은 폐에서 세척에 추가 기관지 섹션을 배치하고 적어도 2 분 동안 세척에 둡니다. 첫 번째 세척에서 기관지 제거하고 샘플을 멸균 페트리 접시에 놓습니다.
각 기관지의 전지포를 멸균 포셉으로 가볍게 잡고 조직을 손상시키지 않도록 주의하십시오. 가능한 한 남아있는 연조직을 제거하고 멸균 해부 가위를 사용하여 조직을 5mm 너비의 스트립으로 자른다. 두 번째 DMEM RPMI 1640 워시에 모든 기관지 티슈 스트립을 놓습니다.
적어도 2 분 동안 세척에 두고 멸균 집게를 사용하여 두 번째 세척에서 티슈 스트립을 제거하고 깨끗하고 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 브론치올에 부착된 나머지 연조직을 제거하고, 멸균 해부 가위를 사용하여 스트립을 사각형으로 자른다. 세 번째 DMEM RPMI 1640 워시를 페트리 접시에 넣고 접시를 소용돌이치면 티슈 조각을 부드럽게 섞습니다.
페트리 접시에서 세 번째 세척을 부은 후 티슈 조각을 제거합니다. 그런 다음 최종 SCFM 세척을 추가하여 모든 조직 조각이 덮여 있는지 확인합니다. UV 빛 아래에서 SCFM에서 조직을 5분간 살균합니다.
멸균 집게를 사용하여 각 멸균 된 기관지 조직 조각을 SCFM 아가로즈 패드가 들어있는 24 웰 플레이트의 개별 우물로 옮겨 넣습니다. 원하는 세균 균주로 각 조직 조각을 감염시키기 위해 멸균 0.5 밀리리터 인슐린 주사기에 부착 된 29 게이지 바늘의 끝으로 한천 접시에서 자란 식민지를 만진 다음 식민지를 조직 조각에 터치하여 표면을 부드럽게 찌릅니다. 감염되지 않은 컨트롤의 경우, 바늘 끝으로 조직 조각의 표면을 부드럽게 찌르고 파이펫을 사용하여 각 우물에 500 마이크로리터의 SCFM을 추가합니다.
자외선 아래 24웰 플레이트당 통기성 밀봉 멤브레인을 10분간 살균합니다. 24웰 플레이트에서 뚜껑을 제거하고 통기성 멤브레인으로 교체한 다음 흔들리지 않고 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 적어도 두 개의 독립적인 폐에서 폐 조각의 복제 세트를 설정, 부정적인 제어를 위해 하나의 세트를 사용하여, 그리고 항생제의 각 농도 당 하나의 세트를 테스트 할 수 있습니다.
48 시간의 인큐베이션 후, 내인성 박테리아의 성장을 위해 감염되지 않은 조직 조각을 시각적으로 검사하여 이 섹션 주변의 배지가 탁탁을 유발합니다. 선택된 연구 종의 전형적인 성장이 관찰되는 경우에, 신선한 폐로 실험을 다시 시작합니다. 감염되지 않은 조직 섹션이 세균성 성장을 전혀 또는 최소한의 것으로 보이지 않으면 24웰 워시 플레이트 1개와 24웰 트리트먼트 플레이트 1개를 준비하십시오.
치료 플레이트의 각 우물은 항생제없이 또는 관심의 항생제와 신선한 SCFM의 500 마이크로 리터를 포함해야합니다. 난동 살균 된 집게로 인큐베이션 플레이트에서 감염된 각 조직 조각을 제거합니다. 세척 판의 신선한 우물에서 간단히 소용돌이하여 비 생물막 관련 세균 세포를 제거하고 처리 플레이트의 적절한 우물로 옮춥니다.
신선한 통기성 멤브레인으로 처리 판을 밀봉한 다음 18~24시간 동안 흔들리지 않고 섭씨 37도에서 배양합니다. 화염 멸균 포셉을 사용하여 24웰 플레이트에서 각 폐 조각을 제거하고 PBS 1밀리리터와 1 그램의 금속 구슬을 포함하는 멸균 2 밀리리터 균질화 튜브에 넣습니다. 비드는 초당 4m에서 40초 동안 이겼다.
PBS를 사용하여 폐 균주전을 직렬적으로 희석하고 LB 천지에 판화하여 개별, 치료 되지 않은 및 항생제 처리 조직 조각에서 식민지 형성 단위를 결정합니다. 전 생체 돼지 폐 또는 EVPL에서 재배할 때 P.aeruginosa및 S.aureus의 생물막은 표준, 업계에서 승인한 국물 MIC 및 표준 매체를 사용하여 항생제에 대한 내성이 증가합니다. EVPL 설립 된 생물 막에 다른 항생제의 다양한 효과 구별 할 수 있습니다.
예를 들어, P.aeruginosa 살인은 EVPL에서 4~16배 MIC 시프로플로생록사신으로 달성되지만 4~8배MIC 클로람페니콜은 달성되지 않습니다. 디스크 분석에서 라인졸리드에 취약한 S.aureus 인구는 EVPL에서 표적 혈청 농도와 더 높은 생존할 수 있습니다. 최적화된 시험관 내 분석조차도 EVPL에서 Colistin에 대한 P.aeruginosa 감수성을 정확하게 예측할 수 없습니다.
EVPL 성장 한 박테리아의 3 개의 로그 10 살인을 달성하는 데 필요한 항생제의 양은 종종 표준 체외 분석에서 계산 된 MIC 또는 MBEC보다 상당히 높습니다. 항균제 사이의 차이를 구별하는 것 외에도,이 모델은 다른 세균 성 성장 단계와 다른 항생제 투약 간격에 대한 감수성의 변화를 강조 할 수 있습니다. P.aeruginosa 생물막의 증가 허용 오차는 성숙으로 메로템에 여기에 표시됩니다.
S.aureus 생존은 플루클로사실린에 4 시간 및 24 시간 후 노출에서 측정되었다, 시간과 격리 사이의 세균성 세포 수의 감소에 차이를 관찰 할 수 있도록. 세균 부하의 변화는 종종 확장 된 배양 시간증가. 이것은 48 시간 생물막 발달 및 항생제 투약 간격을 고려하기 위하여 추가 24 시간 노출 다음 처리되지 않는 통제에서 볼 수 있습니다.
해부 전반에 걸쳐 우수한 멸균 기술을 유지하는 것이 중요하므로 실험실이나 미생물학 작업에 사용하지 않는 실험실 영역에서 해부를 수행하는 것이 좋습니다. 우리는 최근에 바이오 필름에 colistin의 진입을 탐구하기 위하여 모형을 이용하고, 모형은 생물막으로 약 납품을 향상하기 위하여 연구에 있는 좋은 잠재력을 가지고 있습니다.
