6.2K Views
•
09:26 min
•
January 22nd, 2021
DOI :
January 22nd, 2021
•0:04
Introduction
0:52
Dissection and Infection of Ex Vivo Pig Lung (EVPL) Tissue
4:45
Determination of Antibiotic Efficacy
6:39
Results: Screening Bacterial Isolates for Antibiotic Susceptibility with the EVPL Model
8:49
Conclusion
Transcript
Denne metoden lar deg vokse bakterier i et miljø som utløser lignende cellefysiologi og biofilmmorfologi til det du ser i cystiske fibrose lungeinfeksjoner. Lungene er avfallsprodukter i kjøttindustrien, så det er ingen etiske bekymringer. Modellen tilbyr en plattform for å etterligne menneskelig infeksjon uten behov for en levende dyremodell.
Denne teknikken gir forskere en ny måte å screene kandidatmedisiner for potensialet til å komme inn og ødelegge biofilmene som dannes i cystiske fibrose lunger. Med videre utvikling og validering mener vi at EVPR-modellen kan ha potensiell bruk for spesialisert og individualisert antibiotikafølsomhetstesting. Få lunger umiddelbart etter slakting og transporter dem til laboratoriet i en husholdningskjøleboks.
Arbeid på en sterilisert overflate og under en flamme. Plasser lungene på et rent plasthakkingsbrett dekket med autoklavert aluminiumsfolie, og kontroller at bronkiolene forblir intakte. Lungene er ikke egnet for bruk hvis det har vært noen skade på abattoiret eller under transport.
Varm en pallekniv under en flamme og berør kniven veldig kort til lungeområdet rundt bronkisolen for å sterilisere overflaten av vevet. Klipp bort overflatevevet rundt bronkiolen ved hjelp av et sterilt montert barberblad, noe som gjør snitt parallelt med bronkiolen for å forhindre skade. Når bronkiolen har blitt utsatt, gjør et tverrsnitts snitt gjennom bronkiolen på det høyeste punktet synlig.
Bruk sterile tang, hold lett den frie enden av bronkiolen og kutt bort gjenværende uønsket vev ved hjelp av et sterilt montert barberblad. Lag et siste tverrsnitts snitt over bronkiolen før noen forgrening er synlig for å fjerne bronkiolen fra lungene. Plasser bronkiolen i den første DMEM RPMI 1640-vasken.
La det stå i vasken og høst flere deler av bronkiol fra samme lunge for å gi tilstrekkelige vevsseksjoner for det planlagte eksperimentet. Legg eventuelle ekstra bronkiolarseksjoner fra samme lunge i vasken og la dem stå i vasken i minst to minutter. Fjern bronkiolene fra den første vasken, og legg prøvene i en steril Petri-tallerken.
Hold lett hver bronkiol med sterile tang, pass på at du ikke skader vevet. Fjern så mye gjenværende bløtvev som mulig, og kutt vevet i fem millimeter brede strimler ved hjelp av steril disseksjonssaks. Plasser alle bronkolarvevsstrimlene i den andre DMEM RPMI 1640-vasken.
La dem stå i vasken i minst to minutter, fjern deretter vevsstrimlene fra den andre vasken ved hjelp av sterile tang og legg dem i en ren, steril Petri-tallerken. Fjern eventuelt gjenværende bløtvev festet til bronkiolen, og kutt strimlene i firkanter ved hjelp av steril disseksjonssaks. Tilsett den tredje DMEM RPMI 1640 vasken i Petri-parabolen og bland vevstykkene lett i vasken ved å virvle parabolen.
Hell den tredje vasken ut av Petri-parabolen uten å fjerne vevstykkene. Tilsett deretter den endelige SCFM-vasken, og sørg for at alle vevsstykkene er dekket. Steriliser vevet i SCFM under UV-lys i fem minutter.
Bruk sterile tang til å overføre hvert steriliserte bronkolarvevsstykke til individuelle brønner i en 24-brønnsplate som inneholder SCFM agarose pads. For å infisere hvert vevsstykke med ønsket bakteriestamme, berør en koloni dyrket på en agarplate med spissen av en 29-gauge nål festet til en steril 0,5 milliliter insulin sprøyte, og berør deretter kolonien på vevsstykket, forsiktig stikker overflaten. For de uinfekterte kontrollene, stikk forsiktig overflaten av vevsstykket med spissen av nålen, og bruk deretter en pipette for å legge til 500 mikroliter SCFM til hver brønn.
Steriliser en pustende tetningsmembran for hver 24-brønnsplate under ultrafiolett lys i 10 minutter. Fjern lokket fra 24-brønnsplaten og erstatt det med den pustende membranen, og inkuber deretter platene ved 37 grader Celsius uten å riste. Sett opp repliker sett med lungestykker fra minst to uavhengige lunger, ved hjelp av ett sett for negativ kontroll, og ett sett per hver konsentrasjon av antibiotika som skal testes.
Etter 48 timers inkubasjon, inspiser visuelt de uinfiserte vevsstykkene for vekst av endogene bakterier, noe som vil føre til at mediet rundt disse seksjonene blir uklart. Hvis veksten som er typisk for de valgte studieartene observeres, start eksperimentet på nytt med friske lunger. Hvis de uinfekterte vevsdelene ikke viser noen eller minimal bakterievekst, lag en 24-brønns vaskeplate og en 24-brønns behandlingsplate.
Hver brønn av behandlingsplaten skal inneholde 500 mikroliter fersk SCFM uten antibiotika, eller med antibiotika av interesse. Fjern hvert infiserte vevsstykke fra inkubasjonsplaten med flammesteriliserte tang. Virvle den kort i en frisk brønn på vaskeplaten for å fjerne eventuelle ikke-biofilmrelaterte bakterieceller og overføre den til riktig brønn på behandlingsplaten.
Forsegle behandlingsplaten med en frisk pustende membran, og inkuber den deretter ved 37 grader Celsius uten å riste i 18 til 24 timer. Bruk flammesteriliserte tang for å fjerne hvert lungestykke fra 24-brønnsplaten, og legg den i et sterilt to milliliter homogeniseringsrør som inneholder en milliliter PBS og ett gram metallperler. Perle slo i 40 sekunder på fire meter per sekund.
Fortynn lungehomogenatet serielt ved hjelp av PBS, og skriv det på LB agar for å bestemme koloniformingsenhetene i individuelle, ubehandlede og antibiotikabehandlede vevsstykker. Når de vokser i eks-vivo gris lunge eller EVPL, biofilmer av P.aeruginosa og S.aureus demonstrere økt toleranse for antibiotika sammenlignet med følsomhet i standard, industrigodkjent buljong MIC og diskanalyser ved hjelp av standard medier. De ulike effektene av ulike antibiotika på en EVPL-etablert biofilm er skille mellom.
For eksempel oppnås P.aeruginosa-drap i EVPL med 4 til 16X MIC ciprofloxacin, men ikke med 4 til 8X MIC kloramfenikol. S.aureuspopulasjoner som er utsatt for linezolid i diskanalysen, er i stand til å overleve målserumkonsentrasjoner og høyere i EVPL. Selv en optimalisert in-vitro-analyse kan ikke nøyaktig forutsi P.aeruginosa-følsomhet for colistin i EVPL.
Mengden antibiotika som kreves for å oppnå tre logg 10 drap på EVPL-dyrkede bakterier er ofte betydelig høyere enn MIC eller MBEC beregnet fra standard in-vitro analyser. I tillegg til å skille forskjeller mellom antimikrobielle midler, kan denne modellen markere endringer i følsomhet i ulike bakterielle vekststadier og for forskjellige antibiotika doseringsintervaller. Den økende toleransen for P.aeruginosa biofilmer til meropenem som de modnes er vist her.
S.aureusoverlevelse ble målt til 4 og 24 timer etter eksponering for fluklokscillin, noe som gjør det mulig å observere forskjeller i reduksjon av bakterielle celletall over tid og mellom isolasjoner. Variasjoner i bakteriebelastningen øker ofte med utvidet kulturtid. Dette kan sees i ubehandlet kontroll etter 48-timers biofilmutvikling og ytterligere 24-timers eksponering for å ta hensyn til antibiotika doseringsintervall.
Det er avgjørende å opprettholde utmerket steril teknikk gjennom hele disseksjonen, så vi anbefaler å gjøre disseksjonen i et laboratorium eller i et område av laboratoriet ditt som du aldri bruker til mikrobiologiarbeid. Vi brukte nylig modellen til å utforske innføringen av colistin i biofilm, og modellen har et godt potensial for bruk i forskning for å forbedre legemiddelleveransen til biofilmer.
Denne arbeidsflyten kan brukes til å utføre antibiotika mottakelighet testing ved hjelp av en etablert ex vivo modell av bakteriell biofilm i lungene til personer med cystisk fibrose. Bruk av denne modellen kan forbedre den kliniske gyldigheten av MBEC (minimal biofilm utryddelse konsentrasjon) analyser.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved