6.2K Views
•
09:26 min
•
January 22nd, 2021
DOI :
January 22nd, 2021
•0:04
Introduction
0:52
Dissection and Infection of Ex Vivo Pig Lung (EVPL) Tissue
4:45
Determination of Antibiotic Efficacy
6:39
Results: Screening Bacterial Isolates for Antibiotic Susceptibility with the EVPL Model
8:49
Conclusion
Transcript
Med den här metoden kan du odla bakterier i en miljö som utlöser liknande cellfysiologi och biofilmsmorfologi som du ser i cystisk fibros lunginfektioner. Lungorna är en avfallsprodukter inom köttindustrin, så det finns inga etiska bekymmer. Modellen erbjuder en plattform för att efterlikna mänsklig infektion utan behov av en levande djurmodell.
Denna teknik ger forskare ett nytt sätt att screena kandidatläkemedel för potentialen att komma in och förstöra de biofilmer som bildas i cystisk fibros lungor. Med vidareutveckling och validering tror vi att EVPR-modellen kan ha potentiell användning för specialiserade och individualiserade antibiotikakänslighetstester. Få lungor omedelbart efter slakt och transportera dem till laboratoriet i en inhemsk kylbox.
Arbeta på en steriliserad yta och under en låga. Placera lungorna på en ren plasthackbräda täckt med autoklaverad aluminiumfolie och kontrollera att bronkolerna förblir intakta. Lungorna är inte lämpliga för användning om det har upp skadats på slakteriet eller under transporten.
Värm en pallkniv under en flamma och rör mycket kort kniven till lungområdet som omger bronkiolen för att sterilisera vävnadens yta. Skär bort ytvävnaden som omger bronkiolen med ett sterilt monterat rakblad, vilket gör snitt parallellt med bronkiolen för att förhindra skador. När bronkiolen har exponerats, gör ett tvärsnittssnitt genom bronkiolen på den högsta punkten synlig.
Använd sterila tångar, håll lätt bronkiolens fria ände och skär bort eventuell återstående oönskad vävnad med ett sterilt monterat rakblad. Gör ett sista tvärsnittssnitt över bronkiolen innan någon förgrening är synlig för att ta bort bronkiolen från lungorna. Placera bronkiolen i den första DMEM RPMI 1640 tvätten.
Lämna den i tvätten och skörda ytterligare delar av bronkiol från samma lunga för att ge tillräckligt med vävnadssektioner för det planerade experimentet. Placera eventuella ytterligare bronkiolsektioner från samma lunga i tvätten och lämna dem i tvätten i minst två minuter. Ta bort bronkolerna från den första tvätten och placera proverna i en steril Petri-skål.
Håll lätt varje bronkiol med sterila tångar, var försiktig så att vävnaden inte skadas. Ta bort så mycket kvarvarande mjukvävnad som möjligt och skär vävnaden i fem millimeter breda remsor med steril dissekeringssax. Placera alla bronkiolära vävnadsremsor i den andra DMEM RPMI 1640-tvätten.
Lämna dem i tvätten i minst två minuter, ta sedan bort vävnadsremsorna från den andra tvätten med sterila tångar och placera dem i en ren, steril petriskål. Ta bort eventuell återstående mjukvävnad fäst vid bronkiolen och skär remsorna i rutor med steril dissekeringssax. Tillsätt den tredje DMEM RPMI 1640-tvätten i Petri-skålen och blanda lätt vävnadsbitarna i tvätten genom att virvla runt skålen.
Häll den tredje tvätten ur Petri-skålen utan att ta bort vävnadsbitarna. Tillsätt sedan den slutliga SCFM-tvätten och se till att alla vävnadsbitar är täckta. Sterilisera vävnaden i SCFM under UV-ljus i fem minuter.
Använd sterila tångar för att överföra varje steriliserad bronkiolvävnadsbit till enskilda brunnar på en 24-brunnsplatta som innehåller SCFM-agarosakuddar. För att infektera varje vävnadsbit med önskad bakteriestam, rör vid en koloni som odlas på en agarplatta med spetsen av en 29-gauge nål fäst vid en steril 0,5 milliliter insulinspruta och rör sedan kolonin på vävnadsbiten och stick försiktigt ytan. För de oinfekterade kontrollerna, stick försiktigt ytan på vävnadsbiten med nålens spets och använd sedan en pipett för att lägga till 500 mikroliter SCFM till varje brunn.
Sterilisera ett tätningsmembran som andas för varje 24-brunnsplatta under ultraviolett ljus i 10 minuter. Ta bort locket från 24-brunnsplattan och ersätt det med det ventilerande membranet och inkubera sedan plattorna vid 37 grader Celsius utan att skaka. Ställ in replikerade uppsättningar lungbitar från minst två oberoende lungor, med en uppsättning för en negativ kontroll, och en uppsättning per varje koncentration av antibiotika som ska testas.
Efter 48 timmars inkubation, inspektera visuellt de oinfekterade vävnadsbitarna för tillväxt av endogena bakterier, vilket skulle göra mediet runt dessa sektioner grumligt. Om tillväxt som är typisk för den valda studiearten observeras, starta om experimentet med färska lungor. Om de oinfekterade vävnadssektionerna inte visar någon eller minimal bakterietillväxt, förbered en 24-brunns tvättplatta och en 24-brunnsbehandlingsplatta.
Varje brunn på behandlingsplattan bör innehålla 500 mikroliter färsk SCFM utan antibiotika eller med antibiotika av intresse. Ta bort varje infekterad vävnadsbit från inkubationsplattan med flamsteriliserade tångar. Snurra den kort i en frisk brunn på tvättplattan för att ta bort eventuella icke-biofilmrelaterade bakterieceller och överföra den till lämplig brunn på behandlingsplattan.
Försegla behandlingsplattan med ett friskt andningsbart membran och inkubera den sedan vid 37 grader Celsius utan att skaka i 18 till 24 timmar. Använd flamsteriliserade tångar för att ta bort varje lungstycke från 24-brunnsplattan och lägg det i ett sterilt homogeniseringsrör på två milliliter som innehåller en milliliter PBS och ett gram metallpärlor. Pärlan slog i 40 sekunder med fyra meter per sekund.
Späd lunghomumatet seriellt med PBS och plätera det på LB-agar för att bestämma koloniformningsenheterna i enskilda, obehandlade och antibiotikabehandlade vävnadsbitar. När biofilmerna av P.aeruginosa och S.aureus odlas i ex-vivogris lungan eller EVPL visar de ökad tolerans mot antibiotika jämfört med känslighet i standard, branschgodkänd buljong MIC och diskanalyser med hjälp av standardmedier. De olika effekterna av olika antibiotika på en EVPL-etablerad biofilm är urskiljbara.
Till exempel uppnås P.aeruginosa dödande i EVPL med 4 till 16X MIC ciprofloxacin, men inte med 4 till 8X MIC kloramfenikol. S.aureus populationer som är mottagliga för linezolid i diskanalysen kan överleva mål-serum koncentrationer och högre i EVPL. Inte ens en optimerad in vitro-analys kan exakt förutsäga P.aeruginosa mottaglighet för kolistin i EVPL.
Mängden antibiotika som krävs för att uppnå tre log 10-avlivning av EVPL-odlade bakterier är ofta betydligt högre än MIC eller MBEC beräknat från vanliga in vitro-analyser. Förutom att skilja skillnader mellan antimikrobiella medel kan denna modell belysa förändringar i mottaglighet i olika bakterietillväxtstadier och för olika antibiotikadämpande intervall. Den ökande toleransen för P.aeruginosa biofilmer till meropenem som de mognar visas här.
S.aureus överlevnad mättes vid 4 och 24 timmar efter exponering för flucloxacillin, vilket gör det möjligt att observera skillnader i minskningen av bakteriella cellantal över tid och mellan isolat. Variationer i bakteriebelastning ökar ofta med förlängda odlingstider. Detta kan ses i den obehandlade kontrollen efter 48-timmars biofilmutveckling och ytterligare 24-timmars exponering för att ta hänsyn till antibiotikadämpande intervall.
Det är viktigt att upprätthålla utmärkt steril teknik under hela dissekeringen, så vi rekommenderar att du gör dissekeringen i ett labb eller i ett område i ditt labb som du aldrig använder för mikrobiologiarbete. Vi använde nyligen modellen för att utforska colistins inträde i biofilm, och modellen har god potential att användas i forskning för att förbättra läkemedelsleveransen till biofilmer.
Detta arbetsflöde kan användas för att utföra antibiotikakänslighetstestning med hjälp av en etablerad ex vivo-modell av bakteriell biofilm i lungorna hos individer med cystisk fibros. Användning av denna modell kan förbättra den kliniska giltigheten av MBEC (minimal biofilm utrotning koncentration) analyser.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved