क्रायो सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राफी द्वारा सेल का एक 3 डी कार्टोग्राफिक विवरण

क्रायो सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राफी सेलुलर स्तर पर मात्रात्मक मूल्यवान जानकारी प्रदान कर सकती है जिसका उपयोग अन्य इमेजिंग तकनीकों के साथ स्टैंडअलोन या संयोजन के रूप में किया जा सकता है। एक जमे हुए हाइड्रेटेड राज्य में सेंसर छवि जो धुंधला या अनुभाग के लिए आवश्यक हैं। इसके अलावा, यह एक उच्च-थ्रूपुट तकनीक है, क्योंकि प्रत्येक टोमोग्राम केवल कुछ ही मिनटों में एकत्र किया जाता है।

सॉफ्ट एक्स-रे क्रायो-टोमोग्राफी एकल-सेल स्तर पर संक्रमित या दोषपूर्ण कोशिकाओं में सेल बहाली की प्रक्रिया का पालन करने के लिए एक आदर्श मंच प्रदान करता है। यह तकनीक नई एंटीवायरल दवाओं या जीन थेरेपी की प्रभावकारिता की रिपोर्ट कर सकती है ताकि रीडेक्टेड फेनोटाइप के संक्रमण को वापस किया जा सके। संचरण एक्स-रे माइक्रोस्कोप में नमूनों को लोड करने के लिए, तरल नाइट्रोजन के साथ स्थानांतरण कक्ष को ठंडा करें जब तक कि यह 100 केल्विन से कम तक न पहुंच जाए।

अतिरिक्त तरल नाइट्रोजन के साथ वर्कस्टेशन भरें और वर्कस्टेशन रिम के हीटर को चालू करें। जब वर्कस्टेशन रिम उबलना बंद कर देता है, तो क्रायो परिस्थितियों के तहत वर्कस्टेशन में उपयुक्त स्थानों में ग्रिड युक्त क्रायो बॉक्स रखें और पहले से ठंडा नमूना धारकों पर ग्रिड लोड करें। शटल पर धारकों को लोड करें और उन्हें कवर के साथ सुरक्षित करें।

100 केल्विन से कम पर स्थानांतरण कक्ष में शटल लोड करें और कक्ष को कम वैक्यूम तक पंप करें। माइक्रोस्कोप में स्थानांतरण कक्ष संलग्न करें और माइक्रोस्कोप में स्थानांतरण कक्ष शटल को लोड करने के लिए स्क्रीन पर वैक्यूम प्रक्रिया का पालन करें। एक बार शटल नमूनों के साथ माइक्रोस्कोप में है, नमूना चरण में एक नमूना धारक को स्थानांतरित करने के लिए माइक्रोस्कोप रोबोट हाथ का उपयोग करें।

ऑनलाइन दृश्यमान प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ ग्रिड के ब्राइटफील्ड इमेजिंग के लिए, दृश्यमान प्रकाश माइक्रोस्कोप कैमरा का चयन करें और ब्राइटफील्ड इमेजिंग के लिए दृश्यमान प्रकाश माइक्रोस्कोप एलईडी स्रोत को चालू करें। नमूना को माइनस 60 डिग्री पर घुमाने के लिए मोशन, नियंत्रण, नमूना, और नमूना थीटा क्लिक करें ताकि यह दृश्यमान प्रकाश माइक्रोस्कोप उद्देश्य का सामना कर सके, और मोशन कंट्रोल और नमूना का चयन करें और नमूना X और नमूना Y को परिवर्तित करें ताकि नमूना को अपेक्षित केंद्रित पदों पर ले जाया जा सके। माइक्रोस्कोप, अधिग्रहण, अधिग्रहण सेटिंग्स, अधिग्रहण मोड, निरंतर का चयन करें, और प्रारंभ करें और नमूना नियंत्रण और नमूना का चयन करने के लिए गति नियंत्रण और नमूना पर क्लिक करें पांच माइक्रोन के लिए छोटे चरणों के साथ फोकस को परिष्कृत करने के लिए जब तक कि कोशिकाओं और / या कार्बन समर्थन फिल्म के छेद फोकस में नहीं हैं।

फिर का चयन करें माइक्रोस्कोप, अधिग्रहण, अधिग्रहण सेटिंग्स, अधिग्रहण मोड, मोज़ेक, और मोज़ेक के लिए डिफ़ॉल्ट मानों का उपयोग करके ब्राइटफ़ील्ड मोड में ग्रिड के पूर्ण मोज़ेक मानचित्र का अधिग्रहण शुरू करने के लिए प्रारंभ करें। प्रतिदीप्ति मोड मोज़ेक इमेजिंग के लिए, ब्राइटफील्ड इमेजिंग के लिए दृश्यमान प्रकाश माइक्रोस्कोप एलईडी स्रोत को बंद कर दें और वांछित उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और सेटअप पर मैन्युअल रूप से संबंधित ऑप्टिकल फ़िल्टर के अनुरूप एलईडी प्रकाश स्रोत का चयन करें। माइक्रोस्कोप, अधिग्रहण, अधिग्रहण सेटिंग्स, अधिग्रहण मोड, निरंतर का चयन करें, और प्रारंभ करें और प्रतिदीप्ति छवि पर ध्यान केंद्रित करने के लिए नमूना Z का चयन करने के लिए गति नियंत्रण और नमूना क्लिक करें।

उसके बाद, माइक्रोस्कोप, अधिग्रहण, अधिग्रहण सेटिंग्स, अधिग्रहण मोड, मोज़ेक, और ब्राइटफ़ील्ड मोज़ेक से स्थितीय X और Y पैरामीटर को बनाए रखने वाला मोज़ेक मानचित्र प्राप्त करने के लिए प्रारंभ करें क्लिक करें. उसके बाद, एलईडी लाइट स्रोत बंद करें। एक्स-रे मोज़ेक अधिग्रहण के लिए, निकास भट्ठा को पांच माइक्रोन में बदलें और MISTRAL में एक सेकंड के जोखिम का उपयोग करें।

नमूना Z अनुवाद का उपयोग कर फ़ोकस समायोजित करने के लिए माइक्रोस्कोप, अधिग्रहण, अधिग्रहण सेटिंग्स, कैमरा सेटिंग्स, और Binning का चयन करें। पांच माइक्रोन के चरणों में शुरू होने वाले नमूना Z.Starting का चयन करने के लिए गति नियंत्रण और नमूना का चयन करें, सेल या कार्बन पन्नी छेद अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित करने तक 0.5 माइक्रोन के चरणों पर ध्यान केंद्रित करें। जाल वर्ग का एक मोज़ेक मानचित्र प्राप्त करने के लिए, माइक्रोस्कोप, अधिग्रहण, अधिग्रहण सेटिंग्स, अधिग्रहण मोड, मोज़ेक, और प्रारंभ करें क्लिक करें.

जब मानचित्र अधिग्रहीत कर लिया गया है, तो गति नियंत्रण और नमूना क्लिक करें और नमूना X और नमूना Y परिवर्तित करने के लिए नमूना किसी समतल फ़ील्ड स्थिति में नमूना ले जाने के लिए। MISTRAL में एक सेकंड के लिए एक्सपोज़र समय सेट करें। फिर, संचरण प्राप्त करने और सामान्यीकृत मोज़ेक को बचाने के लिए फ्लैट फ़ील्ड छवि द्वारा अधिग्रहित मोज़ेक को सामान्य करें।

रोटेशन अक्ष पर नमूने को शून्य डिग्री पर रोटेशन के साथ संरेखित करने के लिए, मोशन कंट्रोल और नमूना का चयन करें और रोटेशन अक्ष पर रखने के लिए सेल की सुविधा पर ध्यान केंद्रित करने के लिए नमूना X, नमूना Y, और नमूना Z को बदलें। नमूने को एक सकारात्मक थीटा स्थिति में घुमाने के लिए, मोशन कंट्रोल और नमूना का चयन करें और नमूना थीटा को सकारात्मक थीटा में बदलें। रोटेशन अक्ष पर रखने के लिए कक्ष की सुविधा पर रेखा खींचने के लिए रेखा उपकरण का उपयोग करें.

नमूना को एक नकारात्मक थीटा स्थिति में घुमाने के लिए, गति नियंत्रण और नमूना का चयन करें और नमूना थीटा को नकारात्मक थीटा में परिवर्तित करें। रोटेशन अक्ष पर रखने के लिए कक्ष की सुविधा पर रेखा खींचने के लिए रेखा उपकरण का उपयोग करें. सकारात्मक या नकारात्मक थीटा स्थिति में रहते हुए, चयनित सुविधा को दोनों लाइनों के बीच केंद्र की स्थिति में ले जाने के लिए नमूना जेड अनुवाद का उपयोग करें और न्यूनतम लाइन-टू-लाइन दूरी प्राप्त होने तक नमूना रोटेशन को दोहराएं।

जब नमूना थीटा शून्य के बराबर होता है, तो नमूना X को फ़ील्ड-ऑफ-व्यू के केंद्र में चयनित सुविधा को रखने के लिए आवश्यक दूरी से दोगुना ले जाएँ, और सुविधा को फ़ील्ड-ऑफ-व्यू के केंद्र में वापस लाने के लिए ज़ोन प्लेट X को स्थानांतरित करें। नए रोटेशन अक्ष के संबंध में ज़ोन प्लेट Z स्थिति को पुन: ऑप्टिमाइज़ करने के लिए, माइक्रोस्कोप, अधिग्रहण, अधिग्रहण सेटिंग्स, अधिग्रहण मोड और फोकल सीरीज़ का चयन करें और ज़ोन प्लेट Z फोकल श्रृंखला रिकॉर्ड करने के लिए प्रारंभ करें क्लिक करें. उसके बाद, गति नियंत्रण और ज़ोन प्लेट क्लिक करें और ज़ोन प्लेट Z को उस स्थिति में ले जाने के लिए ज़ोन प्लेट Z का चयन करें जिस पर नमूना फ़ोकस में है.

टोमोग्राम प्राप्त करने के लिए, गति नियंत्रण और नमूना क्लिक करें और ऋणात्मक अधिकतम कोण को प्लस 0.1 पर ले जाने के लिए नमूना थीटा का चयन करें. कोण शून्य और कोणीय श्रेणी पर छवि को ध्यान में रखते हुए, कोणों की कुल संख्या के रूप में छवियों की संख्या सेट करने के लिए माइक्रोस्कोप, अधिग्रहण, अधिग्रहण सेटिंग्स, अधिग्रहण मोड और टोमोग्राफी क्लिक करें, और छवियों की संख्या सेट करें। कोण प्रारंभ और कोण अंत का चयन करें, माइक्रोस्कोप, अधिग्रहण, अधिग्रहण सेटिंग्स, कैमरा सेटिंग्सक्लिक करें, और एक्सपोज़र समय सेट करें।

टोमोग्राफी झुकाव श्रृंखला का अधिग्रहण प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ करें क्लिक करें. आदर्श नमूने में बर्फ की एक पतली परत में एम्बेडेड एक वर्ग जाल के केंद्र में एकल कोशिकाएं होनी चाहिए और अच्छी तरह से बिखरे हुए सोने के फिड्यूशियल मार्करों से घिरा होना चाहिए। कई अलग-अलग ऑर्गेनेल, जैसे माइटोकॉन्ड्रिया, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुला, रिक्तिकाएं, और नाभिक को रैखिक अवशोषण गुणांक के मात्रात्मक पुनर्निर्माण के लिए धन्यवाद, अंतिम पुनर्निर्मित टोमोग्राम में प्रतिष्ठित होने में सक्षम होना चाहिए।

इस छवि में, उच्च सेल घनत्व के साथ एक वर्ग देखा जा सकता है। इस उदाहरण में, ब्लोटिंग कम कुशल था, जिससे दरारों के साथ एक मोटी बर्फ की परत हो गई। भले ही इस तैयारी में कुछ बड़ी संरचनाओं को पहचाना जा सकता है, मोटी बर्फ की खराब विट्रीफिकेशन गुणवत्ता के कारण शोर और दानेदार बनावट के भीतर ठीक विवरण खो गए थे।

क्रायो-संरक्षित नमूने को कम से कम नियंत्रित किया जाना चाहिए, क्योंकि इस चरण में नमूने होने पर अधिकांश कलाकृतियों को प्रेरित किया जाता है। आमतौर पर, correlative क्रायो-दृश्यमान प्रकाश फोटोमाइक्रोस्कोपी, आप क्रायो सब्सट्रेट टोमोग्राफी से पहले का उपयोग करते हैं। इसके अलावा, वर्णक्रमीय माइक्रोस्कोपी प्रासंगिक रासायनिक तत्वों पर की जा सकती है।

यह प्रोटोकॉल एक नमूना और रिज़ॉल्यूशन शासन में संचालित करके एक आला भरता है, जो किसी भी अन्य प्रत्यक्ष इमेजिंग तकनीक द्वारा आसानी से सुलभ नहीं हैं, जिससे कुछ माइक्रोन और 30-नैनोमीटर हाफ-पिच रिज़ॉल्यूशन की अनुमति मिलती है।