3.3K Views
•
08:47 min
•
March 15th, 2021
DOI :
March 15th, 2021
•0:04
Introduction
0:51
Transmission X-Ray Microscope (TXM) Loading
1:49
TXM Brightfield Imaging
2:56
Fluorescence Mode Mosaic Acquisition
3:44
X-Ray Imaging
4:52
Tomography Acquisition
7:07
Results: Representative Cryo Soft X-Ray Tomograms
8:00
Conclusion
Transcript
Cryo Soft røntgentomografi kan give kvantitativ værdifuld information på celleniveau, der kan bruges som en selvstændig eller sammen med andre billeddannelsesteknikker. Sensorbillede i frosset hydreret tilstand, som er nødvendigt til farvning eller sektionering. Derudover er det en teknik med høj gennemstrømning, fordi hvert tomogram opsamles på kun få minutter.
Blød røntgenkromotomografi tilbyder en perfekt platform til at følge processen med cellerestaurering i inficerede eller defekte celler på enkeltcelleniveau. Denne teknik kan rapportere effekten af nye antivirale lægemidler eller og genterapi for at vende tilbage infektionen af redigerede fænotyper. For at indlæse prøver i transmissionsrngenmikroskopet afkøles overføringskammeret med flydende nitrogen, indtil det når mindre end 100 Kelvin.
Fyld arbejdsstationen med ekstra flydende nitrogen, og tænd for arbejdsstationens fælg. Når arbejdsstationens fælg holder op med at koge, skal du placere kryoboksen med gitter på de relevante steder på arbejdsstationen under cryo-forhold og lægge gitterene på de tidligere afkølede prøveholdere. Læg holderne på rumfærgen og beskyt dem med dækslerne.
Læg rumfærgen i overføringskammeret ved mindre end 100 Kelvin, og pump kammeret ned til lavt vakuum. Fastgør overføringskammeret til mikroskopet, og følg vakuumproceduren på skærmen for at indlæse overførselskammerbussen i mikroskopet. Når rumfærgen er i mikroskopet med prøverne, skal du bruge mikroskoprobotarmen til at overføre en prøveholder til prøvetrinnet.
For lysfeltbilleddannelse af gitteret med online synligt lysmikroskop skal du vælge det synlige lysmikroskopkamera og tænde LED-kilden til synligt lysmikroskop til lysfeltbilleddannelse. Klik på Bevægelse, Kontrol, Prøve og Prøve theta for at rotere prøven til minus 60 grader, så den vender mod det synlige lysmikroskopmål, og vælg Bevægelseskontrol og Prøve og skift prøve X og prøve Y for at flytte prøven til de forventede centrerede positioner. Vælg Mikroskop, Anskaffelse, Anskaffelsesindstillinger, Anskaffelsestilstande, Kontinuerlig, og start og klik på Bevægelseskontrol og prøve for at vælge prøve Z for at forfine fokus med mindre trin ned til fem mikron, indtil cellerne og/eller hullerne i kulstofstøttefilmen er i fokus.
Vælg derefter Mikroskop, Anskaffelse, Anskaffelsesindstillinger, Anskaffelsestilstande, Mosaik og Start for at starte anskaffelsen af et komplet mosaikkort over gitteret i brightfield-tilstand ved hjælp af standardværdierne for mosaikken. Til mosaikbilleddannelse i fluorescenstilstand skal du slukke for LED-kilden til synligt lysmikroskop til lysfeltbilleddannelse og vælge LED-lyskilden, der svarer til den ønskede excitationsbølgelængde, og det tilsvarende optiske filter manuelt på opsætningen. Vælg Mikroskop, Anskaffelse, Anskaffelsesindstillinger, Anskaffelsestilstande, Kontinuerlig, og start og klik på Bevægelseskontrol og Prøve for at vælge prøve Z for at finjustere fokus på fluorescensbilledet.
Klik derefter på Mikroskop, Erhvervelse, Anskaffelsesindstillinger, Anskaffelsestilstande, Mosaik og Start for at erhverve et mosaikkort, der bevarer de positionelle X- og Y-parametre fra lysfeltmosaikken. Sluk derefter LED-lyskilden. Til erhvervelse af røntgenmosaik skal du ændre udgangsspalten til fem mikron og bruge en eksponering på et sekund ved MISTRAL.
Vælg Mikroskop, Anskaffelse, Anskaffelsesindstillinger, Kameraindstillinger og Binning for at justere fokus ved hjælp af Z-eksempeloversættelsen. Vælg Bevægelseskontrol og Prøve for at vælge prøve Z.Start i trin på fem mikron, finjust fokus ned til trin på 0,5 mikron, indtil cellen eller kulstoffoliehullerne er godt i fokus. Hvis du vil have et mosaikkort over maskefirkanten, skal du klikke på Mikroskop, Anskaffelse, Indstillinger for anskaffelse, Anskaffelsestilstand, Mosaik og Start.
Når kortet er erhvervet, skal du klikke på Bevægelseskontrol og Eksempel og ændre eksempel X og prøve Y for at flytte eksemplet til en flad feltposition. Indstil eksponeringstiden til et sekund ved MISTRAL. Normaliser derefter den erhvervede mosaik ved det flade feltbillede for at opnå transmissionen og gemme den normaliserede mosaik.
Hvis du vil justere prøven på rotationsaksen med rotationen ved nul grader, skal du vælge Bevægelseskontrol og Prøve og ændre prøve X, prøve Y og prøve Z for at fokusere på funktionen i cellen, der skal sættes på rotationsaksen. Hvis du vil rotere prøven til en positiv theta-position, skal du vælge Motion Control og Sample og ændre Sample theta til positiv theta. Brug linjeværktøjet til at tegne en linje på cellens funktion for at sætte rotationsaksen på.
Hvis du vil rotere prøven til en negativ theta-position, skal du vælge Bevægelseskontrol og Prøve og ændre Sample theta til negativ theta. Brug linjeværktøjet til at tegne en linje på cellens funktion for at sætte rotationsaksen på. Mens du er i positiv eller negativ theta-position, skal du bruge prøve Z-oversættelsen til at flytte den valgte funktion til midterpositionen mellem begge linjer og gentage prøverotationen, indtil der opnås en mindste linje-til-linje-afstand.
Når prøvetetaen er lig med nul, skal du flytte eksemplet X dobbelt så langt som den afstand, der er nødvendig for at placere den valgte funktion i midten af synsfeltet, og flytte zonepladen X for at bringe funktionen tilbage til midten af synsfeltet. Hvis du vil optimere zonepladens Z-position igen i forhold til den nye rotationsakse, skal du vælge Mikroskop, Anskaffelsesindstillinger, Anskaffelsestilstande og Fokusserie og klikke på Start for at optage en zoneplade Z-fokusserie. Klik derefter på Bevægelseskontrol og Zoneplade, og vælg zoneplade Z for at flytte zonepladen Z til den position, hvor prøven er i fokus.
Hvis du vil hente et tomogram, skal du klikke på Bevægelseskontrol og Eksempel og vælge Eksempel på theta for at flytte den negative maksimale vinkel til plus 0,1. Klik på Mikroskop, Anskaffelse, Anskaffelsesindstillinger, Anskaffelsestilstande og Tomografi for at indstille antallet af billeder som det samlede antal vinkler under hensyntagen til billedet i vinkel nul og vinkelområdet, og indstil antallet af billeder. Vælg Vinkelstart og Vinkelslut, klik på Mikroskop, Anskaffelse, Indstillinger for anskaffelse, Kameraindstillinger, og indstil eksponeringstiden.
Klik på Start for at starte anskaffelsen af tomografihældeserien. Den ideelle prøve skal have enkeltceller i midten af et kvadratisk net indlejret i et tyndt lag is og omgivet af godt spredte guldfiducialmarkører. Mange forskellige organeller, såsom mitokondrier, endoplasmatiske retikulaer, vakuoler og kernen, bør kunne skelnes i det endelige rekonstruerede tomogram takket være den kvantitative rekonstruktion af de lineære absorptionskoefficienter.
På dette billede kan en firkant med højere celletæthed observeres. I dette eksempel var blotting mindre effektiv, hvilket førte til et tykkere islag med revner. Selvom nogle større strukturer kan genkendes i dette præparat, gik fine detaljer tabt inden for støj og kornet tekstur på grund af den dårlige forglasningskvalitet af den tykke is.
Den kryo-konserverede prøve skal håndteres minimalt, da de fleste artefakter induceres, når prøverne i dette trin. Normalt, korrelativ kryo-synligt lys fotomikroskopi, du bruger en før kryo substrat tomografi. Derudover kan spektralmikroskopi udføres ved relevante kemiske elementer.
Denne protokol udfylder en niche ved at operere i et prøve- og opløsningsregime, som ikke er let tilgængelige med nogen anden direkte billeddannelsesteknik, hvilket tillader få mikron og 30 nanometer halvhøjdeopløsning.
Her præsenteres en protokol, der beskriver de prøveforberedelses- og dataindsamlingstrin, der kræves i kryo blød røntgentomografi (SXT) for at afbilde ultrastrukturen af hele kryokonserverede celler i en opløsning på 25 nm halv tonehøjde.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved