3.3K Views
•
08:47 min
•
March 15th, 2021
DOI :
March 15th, 2021
•0:04
Introduction
0:51
Transmission X-Ray Microscope (TXM) Loading
1:49
TXM Brightfield Imaging
2:56
Fluorescence Mode Mosaic Acquisition
3:44
X-Ray Imaging
4:52
Tomography Acquisition
7:07
Results: Representative Cryo Soft X-Ray Tomograms
8:00
Conclusion
Transcript
Cryo Soft röntgentomografi kan ge kvantitativ värdefull information på cellnivå som kan användas som fristående eller tillsammans med andra bildtekniker. Sensorbild i fryst hydratiserat tillstånd som behöver färgas eller sektioneras. Dessutom är det en teknik med högt dataflöde, eftersom varje tomogram samlas in på bara några minuter.
Mjuk röntgenkryotomografi erbjuder en perfekt plattform för att följa processen för cellåterställning i infekterade eller defekta celler på encellsnivå. Denna teknik kan rapportera effekten av nya antivirala läkemedel eller och genterapi för att återställa infektionen av redigerade fenotyper. För att ladda prover i röntgenmikroskopet för överföring, kyla överföringskammaren med flytande kväve tills den når mindre än 100 Kelvin.
Fyll arbetsstationen med ytterligare flytande kväve och slå på värmaren på arbetsstationens fälg. När arbetsstationens fälg slutar koka, placera kryoboxen som innehåller galler på lämpliga platser i arbetsstationen under kryoförhållanden och ladda gallret på de tidigare kylda provhållarna. Ladda hållarna på skytteln och skydda dem med locken.
Ladda skytteln i överföringskammaren vid mindre än 100 Kelvin och pumpa kammaren ner till lågt vakuum. Fäst överföringskammaren i mikroskopet och följ vakuumproceduren på skärmen för att ladda överföringskammarens skyttel i mikroskopet. När skytteln är i mikroskopet med proverna, använd mikroskoprobotarmen för att överföra en provhållare till provsteget.
För ljusfältsavbildning av rutnätet med det synliga ljusmikroskopet online, välj mikroskopkameran för synligt ljus och slå på LED-källan för synligt ljusmikroskop för ljusfältsavbildning. Klicka på Rörelse, Kontroll, Prov och Prov theta för att rotera provet till minus 60 grader så att det vetter mot det synliga ljusmikroskopmålet och välj Rörelsekontroll och Prov och ändra prov X och prov Y för att flytta provet till de förväntade centrerade positionerna. Välj Mikroskop, Förvärv, Förvärvsinställningar, Förvärvslägen, Kontinuerlig och Start och klicka på Rörelsekontroll och prov för att välja prov Z för att förfina fokus med mindre steg ner till fem mikron tills cellerna och / eller hålen i kolstödfilmen är i fokus.
Välj sedan Mikroskop, Förvärv, Förvärvsinställningar, Förvärvslägen, Mosaik och Börja för att starta förvärvet av en fullständig mosaikkarta över rutnätet i ljusfältsläge med standardvärdena för mosaiken. För mosaikavbildning i fluorescensläge, stäng av LED-källan för synligt ljusmikroskop för ljusfältsavbildning och välj LED-ljuskällan som motsvarar önskad excitationsvåglängd och motsvarande optiska filter manuellt på inställningen. Välj Mikroskop, Förvärv, Förvärvsinställningar, Förvärvslägen, Kontinuerlig och Starta och klicka på Rörelsekontroll och prov för att välja prov Z för att förfina fokus på fluorescensbilden.
Klicka sedan på Mikroskop, Förvärv, Förvärvsinställningar, Förvärvslägen, Mosaik och Börja skaffa en mosaikkarta som behåller parametrarna X och Y från ljusfältsmosaiken. Stäng sedan av LED-ljuskällan. För röntgenmosaikförvärv, byt utgångsslitsen till fem mikron och använd en sekunds exponering vid MISTRAL.
Välj Mikroskop, Förvärv, Förvärvsinställningar, Kamerainställningar och Binning för att justera fokus med hjälp av Z-exempelöversättningen. Välj Rörelsekontroll och prov för att välja prov Z.Börja i steg om fem mikron, förfina fokus ner till steg på 0,5 mikron tills cellen eller kolfoliehålen är väl i fokus. Om du vill hämta en mosaikkarta över maskrutan klickar du på Mikroskop, Förvärv, Förvärvsinställningar, Förvärvsläge, Mosaik och Start.
När kartan har förvärvats klickar du på Rörelsekontroll och Prov och ändrar prov X och prov Y för att flytta provet till en platt fältposition. Ställ in exponeringstiden på en sekund vid MISTRAL. Normalisera sedan den förvärvade mosaiken med den platta fältbilden för att få överföringen och spara den normaliserade mosaiken.
Om du vill justera provet på rotationsaxeln med rotationen vid noll grader väljer du Rörelsekontroll och prov och ändrar provet X, prov Y och prov Z för att fokusera på cellens funktion att sätta på rotationsaxeln. För att rotera provet till en positiv thetaposition, välj Rörelsekontroll och Prov och ändra Sample theta till positiv theta. Använd linjeverktyget för att rita en linje på cellens funktion för att sätta på rotationsaxeln.
För att rotera provet till en negativ thetaposition, välj Rörelsekontroll och prov och ändra Sample theta till negativ theta. Använd linjeverktyget för att rita en linje på cellens funktion för att sätta på rotationsaxeln. När du är i positiv eller negativ thetaposition, använd prov Z-översättningen för att flytta den valda funktionen till mittpositionen mellan båda linjerna och upprepa provrotationen tills ett minsta linje-till-linje-avstånd erhålls.
När proveta är lika med noll flyttar du provet X två gånger det avstånd som behövs för att placera den valda funktionen i mitten av synfältet och flyttar zonplattan X för att föra tillbaka funktionen till mitten av synfältet. Om du vill optimera zonplattans Z-position med avseende på den nya rotationsaxeln väljer du Mikroskop, Förvärv, Förvärvsinställningar, Förvärvslägen och Fokalserie och klickar på Start för att spela in en zonplatta Z-fokalserie. Klicka sedan på Rörelsekontroll och Zonplatta och välj zonplatta Z för att flytta zonplattan Z till den position där provet är i fokus.
Om du vill hämta ett tomogram klickar du på Rörelsekontroll och sampling och väljer Sample theta för att flytta den negativa maximala vinkeln till plus 0,1. Klicka på Mikroskop, Förvärv, Förvärvsinställningar, Förvärvslägen och Tomografi för att ställa in antalet bilder som det totala antalet vinklar, med hänsyn till bilden i vinkel noll och vinkelområdet, och ställ in antalet bilder. Välj Vinkelstart och vinkelslut, klicka på Mikroskop, Förvärv, Förvärvsinställningar, Kamerainställningar och ställ in exponeringstiden.
Klicka på Start för att starta förvärvet av tomografilutningsserien. Det ideala provet bör ha enstaka celler i mitten av ett fyrkantigt nät inbäddat i ett tunt lager av is och omgivet av väl dispergerade guldfiduciella markörer. Många olika organeller, såsom mitokondrier, endoplasmatisk retikel, vakuoler och kärnan bör kunna särskiljas i det slutliga rekonstruerade tomogrammet tack vare den kvantitativa rekonstruktionen av de linjära absorptionskoefficienterna.
I denna bild kan en kvadrat med högre celldensitet observeras. I detta exempel var blottningen mindre effektiv, vilket ledde till ett tjockare islager med sprickor. Även om vissa större strukturer kan kännas igen i denna beredning, förlorades fina detaljer inom bullret och kornig konsistens på grund av den dåliga förglasningskvaliteten hos den tjocka isen.
Det kryokonserverade provet bör hanteras minimalt, eftersom de flesta artefakterna induceras när proverna i detta skede. Vanligtvis, korrelativ kryo-synlig ljusfotomikroskopi, använder du en före kryosubstrattomografi. Dessutom kan spektralmikroskopi göras vid relevanta kemiska element.
Detta protokoll fyller en nisch genom att arbeta i en prov- och upplösningsregim, som inte är lättillgänglig med någon annan direkt bildteknik, vilket möjliggör få mikron och 30 nanometer halv tonhöjdsupplösning.
Här presenteras ett protokoll som beskriver provberedningen och datainsamlingsstegen som krävs i kryo mjuk röntgentomografi (SXT) för att avbilda ultrastrukturen hos hela kryobevarade celler med en upplösning av 25 nm halv tonhöjd.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved