Name: functional characterization of endogenously expressed human ryr1 variants
Uploaded: 2021-06-09T13:45:00
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この原稿に記載されている研究は、スイス国立科学財団(SNF)とスイスマッスル財団からの助成金によって支えられました。

以下に説明するプロトコルは、エティッコムミッションノルトウェスト・ウント・ツェントラルシュヴァイツEKNZの倫理ガイドラインに準拠しています。
エプスタインバー不死化Bリンパ球細胞株の調製11
<ol><li>インフォームド・コンセントの後、RYR1突然変異を運ぶプロビンから、および変異のない健康な家族からEDTA処理された無菌管に全血の30 mLを集?...

<ol>
	<li>Dlamini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RYR1+are+a+common+cause+of+exertional+myalgia+and+rhabdomyolysis.">Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis.</a> Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).</li><li>Klein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+genetic+findings+in+a+large+cohort+of+patients+with+ryanodine+receptor+1+gene-associated+myopathies.">Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies.</a> Human Mutation. 33, 981-988 (2012).</li><li>Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RYR1+in+malignant+hyperthermia+and+central+core+disease.">Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease.</a> Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++mediated+activation+of+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor+ion+channel.">Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).</li><li>Treves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+intracellular+Ca2++transients+in+COS-7+cells+transfected+with+the+cDNA+encoding+skeletal-muscle+ryanodine+receptor+carrying+a+mutation+associated+with+malignant+hyperthermia.">Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia.</a> Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).</li><li>Nakai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+dihydropyridine+receptor+channel+activity+in+the+presence+of+ryanodine+receptor.">Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor.</a> Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).</li><li>Durham, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RyR1+S-nitrosylation+underlies+environmental+heat+stroke+and+sudden+death+in+Y522S+RyR1+knockin+mice.">RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice.</a> Cell. 133 (81), 53-65 (2008).</li><li>Zvaritch, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++dysregulation+in+Ryr1(I4895T/wt)+mice+causes+congenital+myopathy+with+progressive+formation+of+minicores,+cores,+and+nemaline+rods.">Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).</li><li>Elbaz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-allelic+expression+of+the+RyR1+p.A4329D+mutation+decreases+muscle+strength+in+slow-twitch+muscles+in+mice.">Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).</li><li>Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+homeostasis+in+human+primary+muscle+cells+from+malignant+hyperthermia+susceptible+and+normal+individuals.">Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals.</a> Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).</li><li>Girard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-lymphocytes+from+Malignant+Hyperthermia-Susceptible+patients+have+an+increased+sensitivity+to+skeletal+muscle+ryanodine+receptor+activators.">B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077 (2001).</li><li>Ducreux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ryanodine+receptor+mutations+on+interleukin-6+release+and+intracellular+calcium+homeostasis+in+human+myotubes+from+Malignant+Hyperthermia-+Susceptible+individuals+and+patients+affected+by+Central+Core+Disease.">Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).</li><li>Ducreux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+ryanodine+receptors+carrying+three+amino+acid+substitutions+identified+in+patients+affected+by+multi-minicore+disease+and+central+core+disease,+expressed+in+immortalized+lymphocytes.">Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes.</a> Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).</li><li>Tilgen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+four+novel+mutations+in+the+C-terminal+membrane+spanning+domain+of+the+ryanodine+receptor+1:+association+with+central+core+disease+and+alteration+of+calcium+homeostasis.">Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis.</a> Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).</li><li>Treves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+excitation-coupled+Ca2++entry+induces+nuclear+translocation+of+NFAT+and+contributes+to+IL-6+release+from+myotubes+from+patients+with+central+core+disease.">Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease.</a> Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).</li><li>Yasuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JP-45/JSRP1+variants+affect+skeletal+muscle+excitation+contraction+coupling+by+decreasing+the+sensitivity+of+the+dihydropyridine+receptor.">JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor.</a> Human Mutation. 34, 184-190 (2013).</li><li>Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+ryanodine+receptor+is+involved+in+calcium+signaling+in+human+B+lymphocytes.">Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).</li><li>Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorocresol,+an+additive+to+commercial+succinylcholine,+induces+contracture+of+human+malignant+Hyperthermia+Susceptible+muscles+via+activation+of+the+ryanodine+receptor+Ca2++channel.">Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel.</a> Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).</li><li>Kushnir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptor+calcium+leak+in+circulating+B-lymphocytes+as+a+biomarker+for+heart+failure.">Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure.</a> Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).</li><li>Zullo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+ryanodine+receptor+sequence+variants+using+a+metabolic+assay+in+immortalized+B-lymphocytes.">Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes.</a> Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).</li><li>Hoppe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypermetabolism+in+B-lymphocytes+from+malignant+hyperthermia+susceptible+individuals.">Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals.</a> Scientific Reports. 6, 33372 (2016).</li><li>Monnier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homozygous+splicing+mutation+causing+a+depletion+of+skeletal+muscle+RYR1+is+associated+with+multi-minicore+disease+congenital+myopathy+with+ophthalmoplegia.">A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia.</a> Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).</li><li>Schartner, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dihydropyridine+receptor+(DHPR,+CACNA1S)+congenital+myopathy.">Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy.</a> Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).</li><li>Ullrich, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+excitation-contraction+coupling+and+excitation+coupled+Ca2++entry+in+human+myotubes+carrying+CAV3+mutations+linked+to+rippling+muscle+disease.">Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease.</a> Human Mutation. 32, 1-9 (2010).</li><li>Rokach, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+skeletal+muscle-+derived+cell+line:+biochemical,+cellular+and+electrophysiological+characterization.">Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization.</a> Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RYR1+mutations+in+core+myopathies.">Characterization of RYR1 mutations in core myopathies.</a> Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).</li><li>Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+proton+release+from+cultured+human+myotubes+to+identify+malignant+hyperthermia+susceptibility.">Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility.</a> Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).</li></ol>

本論文に記載されているプロトコルは、いくつかの研究所で、カルシウム恒常性に対するRYR1変異の影響を研究するために有効に活用されている。この論文で概説されているアプローチの重要なステップは、生物材料の無菌性、細胞培養技術および技術および入手可能性を扱う。原則として、EBV不死化Bリンパ球の使用は、より簡単であり、変異型RyR1チャネルを含む細胞株を生成することを可?...

現在までに700以上のRYR1変異体がヒト集団で同定され、悪性温熱症感受性(MHS)、運動誘発横紋筋融解症、中核疾患(CCD)、マルチミニコア病(MmD)、心筋症(CNM)1、2、3を含む様々な神経筋疾患に関連している;しかし、その機能効果を特徴付ける研究は遅れており、突然変異の約10%だけが機能的にテストされている。異なる実験的アプローチを使用して、特定のRyR1バリアントの影響を評価することができます。 WTおよび変異体RYR1 cDNA4、5に対するプラスミドコードを有するヘクロスミドおよびCOS-7細胞などの異種細胞のトランスフェクションを含む、WTおよび変異型RYR1 cDNAをコードするプラスミドおよびベクターを用いた異端マウス線維芽細胞の導入、続いてmyo-DとのトランスダクションとmyoTubetubeへの分化、変異体RyR1s7、8、9を担持するトランスジェニック動物モデルの生成は、10、11、12の内在的にRYR1変異体を発現する患者からの細胞の特徴付けである。このような方法は、異なる突然変異が機能的にRyR1 Ca2+チャネルに与える影響を確立するのに役立っています。
ここでは、RYR1変異の機能的効果を評価するために開発された方法について説明する。細胞内カルシウム恒常性の様々なパラメータは、ヒト細胞において、ミオチューブやエプスタインバーウイルス(EBV)を含む、YR1カルシウムチャネルを内発的に発現し、Bリンパ球を不死化した。細胞は患者から得られ、培養中に拡大され、フラ-2またはインド-1などのレシオメトリック蛍光カルシウムインジクターを装填する。休養期[Ca2+]を含む病原性RYR1突然変異のために変化することが報告されているパラメータは、異なる薬理学的アゴニストに対する感受性および細胞内Ca2+ストアのサイズは、蛍光顕微鏡を用いて、または蛍光計を用いた細胞集団において、単一細胞レベルで測定される。突然変異担体から得られた細胞で得られた結果は、次いで、健康な対照ファミリーメンバーから得られたものと比較される。このアプローチは、(i)MHSに関連する多くの突然変異が休息[Ca2+]の増加につながり、4-クロロm-クレゾール10、11、12、13でKCl誘導脱分極または薬理学的RyR1活性化のいずれかに用量応答曲線の左へのシフトにつながることを実証した。(ii) CCDに関連する変異は、ライR1の薬理学的活性化によって放出されるピークの減少につながる [Ca2+] 細胞内Ca2+が12,13,14,15を格納する場合のサイズを減少させる;(iii) いくつかの変異体は、Ca2+ホメオスタシス13に影響を与えない。この実験的アプローチの利点は、RyR1タンパク質が過剰発現せず、生理学的レベルが存在し、細胞(筋肉細胞およびBリンパ球の両方)が変異を含む細胞株を提供することができる。いくつかの欠点は、患者がカルシウム恒常性および/または励起収縮結合(ECC)に関与するタンパク質をコードする複数の遺伝子に変異を運ぶ可能性があり、これは実験的結論を複雑にする可能性があるという事実に関連する。例えば、2つのJP-45変異体がMHSおよび対照集団において同定され、それらの存在は、ジヒドロピリジン受容体(DHPR)の感受性に影響を与える16を活性化する。患者は利用可能である必要があり、生物学的材料は新たに収集される必要があり、倫理的許可は地元の倫理委員会から取得する必要があります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-chloro-m-cresol</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>24940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>172202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caffeine</td>
			<td>Merk</td>
			<td>102584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cascade 125+ CCD camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cascade 128+ CCD</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>41639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>3778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17144002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2/AM</td>
			<td>Invitrogen Life Sciences</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11382II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23017015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanthanum</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>61490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microperfusion system</td>
			<td>ALA-Scientific</td>
			<td>DAD VM 12 valve manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin Software</td>
			<td>OriginLab Corp</td>
			<td>Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco Life Sciences</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber POC-R</td>
			<td>Pecon</td>
			<td>000000-1116-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21875091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorimeter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>LS50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>586005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture inserts</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visiview</td>
			<td>Visitron Systems GmbH</td>
			<td>Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert S100 TV microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss glass coverslips</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>0727-016</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional characterization of endogenously expressed human ryr1 variants

RYR1遺伝子の700以上の変異体は、悪性温熱療法感受性、コアミオパシーおよび中心核筋症を含む異なる神経筋障害を有する患者において同定されている。RYR1突然変異に関連する多様な型素型のために、将来の治療介入のために患者が運んだ変異体を分類し、非病原性変異体を同定するために、その機能的効果を特徴付けるのが基本である。多くの研究室では、患者の細胞に発現するRYR1変異を機能的に特徴付ける方法の開発に関心を持っています。このアプローチは、多くの利点を有する:変異が内因的に発現し、RyR1は過剰発現せず、異種のRyR1発現細胞の使用は避ける。しかし、患者はRYR1を除いて異なる遺伝子に変異を提示する可能性があるため、同じ突然変異を有する個体の生物学的物質の結果を、異なる遺伝的背景を有する場合に比較することが重要である。本稿は、(a)エプスタインバーウイルス不死化ヒトBリンパ球および(b)筋肉生検に由来する衛星細胞および筋管内に分化された、内因的に発現したRYR1変異体の機能的効果を研究するために開発された方法を説明する。次に、薬理学的なRyR1活性化剤の添加によって引き起こされる細胞内カルシウム濃度の変化をモニターする。選択した細胞タイプには、レシオメトリック蛍光カルシウム指標がロードされ、細胞内[Ca2+]変化は、蛍光顕微鏡検査によって単一細胞レベルまたは分光蛍光計を用いた細胞集団のいずれかで監視される。休息[Ca2+]では、アゴニスト用量応答曲線を、健康なコントロールからの細胞と、特定の変異体の機能的効果に関する洞察をもたらすRYR1変異体を有する患者との間で比較される。

[Ca2+] EBV不死化Bリンパ球の集団におけるi測定 原発性Bリンパ球は、B細胞抗原受容体刺激シグナル伝達プロセス中にCa2+放出チャネルとして機能するRyR1アイソフォームを発現する。EBVを用いたB細胞の不死化は、遺伝学者が患者のゲノム情報を含む細胞株を得るために日常的に使用される...

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Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

ここでは、エプスタインバーウイルスで内因的に発現するRYR1変異の機能的効果を研究するために用いられる方法について、ヒトBリンパ球および筋生検由来衛星細胞をミオチューブに分化した不死生のヒトリンパ球が説明されている。

内在的に発現したヒトRYR1変異体の機能特性評価

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia ...

このプロトコルは患者材料を使用するため重要です。患者が病気を持っている場合、細胞を使用すると、患者の生物学的応答をより正確に反映する必要があります。このテクニックは、実行が簡単で、簡単で、洗練された機器を必要としません。これらの方法は、診断に使用することができ、例えば、RYR1突然変異が機能的にカルシウム恒常性を変化させる、ならびに化合物の潜在的な治療機能を試験することを証明する。個々の研究者の知識と技術力に応じて、実際の患者サンプルを使用する前にテスト実験を行う必要があります。EBV形質転換Bリンパ球の細胞内カルシウム濃度の変化を監視するために、クレブスリンガー溶液およびFura-2 AMの1ミリリットル濃度当たりの7番目の細胞に10倍の不死化されたB細胞を摂氏37度で30分のインキュベートのために5ミクロモルの最終濃度に再懸濁させる。インキュベーションの終わりに、遠心分離によって細胞を収集し、新鮮なクレブスリンガー溶液中のペレットをミリリットル濃度当たり6番目の細胞に2倍10〜6番目の細胞で再懸濁する。実験を開始する直前に、細胞を再び遠心分離し、0.5ミリモルEGTAを添加したクレブスリンガー溶液の1.5ミリリットルの細胞を迅速に再懸濁させるが、カルシウムは添加しなかった。細胞をガラス、3ミリリットル分光蛍光計キュベットに移し、最大速度と37°Cに設定された磁気攪拌機を約30秒間備えた分光蛍光計の蛍光比を記録します。単一細胞のカルシウム放出応答を評価するには、クレブスリンガー溶液の1ミリリットルに1ミリリットルのFura-2 AMを装填した細胞を個々のポリLリジンコーティングガラスカバースリップに1回1回プレートし、加湿細胞培養器で37°Cでカバースリップを37°Cでインキュベートします。細胞が付着したら、カバースリップを灌流チャンバーに入れ、毎分1ミリモルのカルシウムを補ったクレブスリンガーの溶液の2ミリリットルで細胞を浸透させ始める。40倍の油浸し目的と適切なフィルターを備えた反転蛍光顕微鏡を使用して、ソフトウェア制御の充電結合デバイスカメラ取り付けで、固定露光時間でオンライン測定を記録します。細胞刺激を達成するために、アゴニストの異なる濃度を追加するために12バルブと細胞灌流刺激剤を使用してください。ヒトの筋肉生検からミオチューブを分離するには、まず生殖不能PBSで生検をすすいで余分な血液を取り除き、組織を0.5~1ミリメートルの断片に細分化する。1.5ミリリットルのヒト筋肉成長培地を含む6ウェル組織培養プレートの各ウェルに2〜3個の断片を挿入し、1回の挿入物につき500マイクロリットルの培地を各ウェルに挿入し、プレートを細胞培養インキュベーターに入れる。ヒトミオチューブにおけるカルシウム発現の変化を測定するために、多核化ミオチューブが観察される場合、ミオチューブ培養上清を、1ミリモルFura-2 AMの10マイクロリットルを添加した新鮮な分化培地に置き換えて、細胞培養インキュベーターで30分間インキュベートする。インキュベーションの最後に、1つのガラスカバースリップ培養液を灌流チャンバーに移し、2ミリモル塩化カルシウムを補ったクレブスリンガーの溶液で細胞をすすいすります。次に、20倍の水浸し目的を使用して実証されたオンラインカルシウム測定を行います。この代表的な分析では、長期にわたって徐々に安静レベルに戻ったアゴニストの添加後、EBV不死化Bリンパ球でカルシウムの急激な増加が観察された。同様の実験では、400ナノモルタプシガーギンを添加すると、2.4個の任意の単位のピーク蛍光値に達する大きなカルシウム過渡期を引き起こした。この蛍光値は、対応する用量応答曲線が構築された場合に100%であると考えられた。この分析では、不死化B細胞を5ミリモルカフェインで20秒間刺激し、340および380ナノメートルの蛍光比を即座に増加させた。各カフェイン濃度試験について、蛍光の340×380ナノメートルの比でカフェイン誘発ピークを計算し、用量応答曲線を構築するために使用した。分化されたミオチューブからのカルシウム放出は、塩化カリウムによるフラッシング、アゴニストの異なる濃度、および/またはカフェイン、および正常な用量応答曲線を生成することに応答して評価することもできる。細胞がFura-2で正しくロードされていること、そして340ナノメートルと380ナノメートルの両方の波長がアゴニストの添加に反応することを確認することが重要です。蛍光カルシウム指標を用いた細胞内カルシウム測定は、ほとんどの哺乳動物細胞で調べることができ、異なる刺激に応答して細胞内カルシウムの変化の研究に応用することができます。

Research

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