Name: tgf-&#946;-mediated endothelial to mesenchymal transition (endmt) and the functional assessment of endmt effectors using crispr/cas9 gene editing
Uploaded: 2021-02-26T14:00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about TGF-ÃŽÂ²-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing at JoVE.com

وقد دعم البحث CGC.NL ومبادرة أبحاث القلب والأوعية الدموية الهولندية: مؤسسة القلب الهولندية، والاتحاد الهولندي للمراكز الطبية الجامعية، والمنظمة الهولندية للبحث والتطوير الصحي، ومنح منحة الأكاديمية الملكية الهولندية للعلوم إلى فيدرا إمباكت (http://www.phaedraresearch.nl). JM مدعوم من قبل مجلس المنح الدراسية الصينية. ويدعم GSD منحة الترامبولين من AFM-Telethon [22379]، FOP إيطاليا ومنحة من La Fundació La Marató de TV3 (#202038).

<ol>
	<li>Ma, J., Sanchez-Duffhues, G., Goumans, M. -. J., Ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;-induced+endothelial+to+mesenchymal+transition+in+disease+and+tissue+engineering.">TGF-&#946;-induced endothelial to mesenchymal transition in disease and tissue engineering.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).</li><li>Piera-Velazquez, S., Jimenez, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+to+mesenchymal+transition:+role+in+physiology+and+in+the+pathogenesis+of+human+diseases.">Endothelial to mesenchymal transition: role in physiology and in the pathogenesis of human diseases.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1281-1324 (2019).</li><li>S&#225;nchez-Duffhues, G., de Vinuesa, G. A., ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cardiovascular+diseases:+developmental+signaling+pathways+gone+awry.">Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: developmental signaling pathways gone awry.</a> Developmental Dynamics. 247 (3), 492-508 (2018).</li><li>Evrard, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+to+mesenchymal+transition+is+common+in+atherosclerotic+lesions+and+is+associated+with+plaque+instability.">Endothelial to mesenchymal transition is common in atherosclerotic lesions and is associated with plaque instability.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-16 (2016).</li><li>Qiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fate+mapping+in+mice+with+pulmonary+hypertension.">Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension.</a> Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).</li><li>Zeisberg, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial-to-mesenchymal+transition+contributes+to+cardiac+fibrosis.">Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis.</a> Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).</li><li>Clere, N., Renault, S., Corre, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cancer.">Endothelial-to-mesenchymal transition in cancer.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).</li><li>Saito, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT+and+EndMT:+regulated+in+similar+ways.">EMT and EndMT: regulated in similar ways.</a> The Journal of Biochemistry. 153 (6), 493-495 (2013).</li><li>Bol&#243;s, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Slug+represses+E-cadherin+expression+and+induces+epithelial+to+mesenchymal+transitions:+a+comparison+with+Snail+and+E47+repressors.">The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors.</a> Journal of Cell Science. 116 (3), 499-511 (2003).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), 006429 (2012).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+definitions+for+research+on+epithelial-mesenchymal+transition.">Guidelines and definitions for research on epithelial-mesenchymal transition.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-12 (2020).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), (2014).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li><li>Arbiser, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+H-ras+stimulates+tumor+angiogenesis+by+two+distinct+pathways.">Oncogenic H-ras stimulates tumor angiogenesis by two distinct pathways.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 94 (3), 861-866 (1997).</li><li>MA, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-?-induced+endothelial+to+mesenchymal+transition+results+from+a+balance+between+SNAIL+and+ID+factors.">TGF-?-induced endothelial to mesenchymal transition results from a balance between SNAIL and ID factors.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 182 (9), (2021).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+impact+of+chromatin+conformation+on+genome+editing+tools.">Probing the impact of chromatin conformation on genome editing tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (13), 6482-6492 (2016).</li><li>Hunter, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+CRISPR+and+shRNA+screens+identify+involvement+of+mitochondrial+electron+transport+in+the+activation+of+evofosfamide.">Functional CRISPR and shRNA screens identify involvement of mitochondrial electron transport in the activation of evofosfamide.</a> Molecular Pharmacology. 95 (6), 638-651 (2019).</li><li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+mediate+long-term+and+high+efficiency+transgene+expression+in+HEK+293T+cells.">Lentiviral vectors mediate long-term and high efficiency transgene expression in HEK 293T cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 12 (5), 407 (2015).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deubiquitinase+activity+profiling+identifies+UCHL1+as+a+candidate+oncoprotein+that+promotes+TGF&#946;-induced+breast+cancer+metastasis.">Deubiquitinase activity profiling identifies UCHL1 as a candidate oncoprotein that promotes TGF&#946;-induced breast cancer metastasis.</a> Clinical Cancer Research. 26 (6), 1460-1473 (2020).</li><li>Medici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+vascular+endothelial+cells+into+multipotent+stem-like+cells.">Conversion of vascular endothelial cells into multipotent stem-like cells.</a> Nature Medicine. 16 (12), 1400 (2010).</li><li>Kokudo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snail+is+required+for+TGF&#946;-induced+endothelial-mesenchymal+transition+of+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells.">Snail is required for TGF&#946;-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells.</a> Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).</li><li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+analysis+unveils+a+prevalent+epithelial/mesenchymal+hybrid+state+during+mouse+organogenesis.">Single-cell RNA-seq analysis unveils a prevalent epithelial/mesenchymal hybrid state during mouse organogenesis.</a> Genome Biology. 19 (1), 1-20 (2018).</li><li>Oatley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+identifies+CD44+as+a+marker+and+regulator+of+endothelial+to+haematopoietic+transition.">Single-cell transcriptomics identifies CD44 as a marker and regulator of endothelial to haematopoietic transition.</a> Nature communications. 11 (1), 1-18 (2020).</li><li>Halaidych, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+responses+and+barrier+function+of+endothelial+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Inflammatory responses and barrier function of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1642-1656 (2018).</li><li>Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessing+endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cardiovascular+diseases.">Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases.</a> Nature Reviews Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Grav, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+triple+knockout+CHO+cell+lines+using+CRISPR/Cas9+and+fluorescent+enrichment.">One-step generation of triple knockout CHO cell lines using CRISPR/Cas9 and fluorescent enrichment.</a> Biotechnology Journal. 10 (9), 1446-1456 (2015).</li><li>Abudayyeh, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+targeting+with+CRISPR-Cas13.">RNA targeting with CRISPR-Cas13.</a> Nature. 550 (7675), 280-284 (2017).</li><li>Paddison, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+short+hairpin+RNAs+for+gene+knockdown+in+mammalian+cells.">Cloning of short hairpin RNAs for gene knockdown in mammalian cells.</a> Nature Methods. 1 (2), 163-167 (2004).</li><li>Reynolds, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+siRNA+design+for+RNA+interference.">Rational siRNA design for RNA interference.</a> Nature Biotechnology. 22 (3), 326-330 (2004).</li><li>Louren&#231;o, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP&#593;+is+crucial+determinant+of+epithelial+maintenance+by+preventing+epithelial-to-mesenchymal+transition.">C/EBP&#593; is crucial determinant of epithelial maintenance by preventing epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-18 (2020).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

فهم آلية EndMT أمر بالغ الأهمية لتعديل هذه العملية واستهداف الأمراض المرتبطة EndMT. هنا ، وصفنا أساليب لإجراء اختبار EndMT الناجم عن β TGF واستجواب دور الحلزون EndMT-TF في EndMT الذي يسببه TGF-β ، من خلال إجراء استنفاد الجينات المستقرة CRISPR/Cas9 بوساطة الحلزون من الخلايا. استنفاد الحلزون باستخدام CRISPR / Cas9 النهج بنجاح إلغاء TGF-β2 مدفوعة EndMT في الخلايا MS-1 (الشكل 3C). لدراسة آثار أي السيتوكينات، مثل TGF-β، على EndMT، تعرضت ECs للسيتوكينات ومن ثم تم تقييم حدوث EndMT وفقا للتغيرات المورفولوجية والتغيرات في التعبير عن العلامة البطانية والميكنشيمالية في الخلايا. TGF-β2 المستحثة بقوة EndMT في خلايا MS-1 يرافقه زيادة قوية في التعبير عن عامل النسخ الحلزون. يمكن أن تختلف EndMT-TFs الناجمة عن TGF-β وفقا للأنواع أو نوع الخلية البطانية الخاصة بالأنسجة. على سبيل المثال، لاحظنا أن الحلزون ولكن ليس سبيكة كان أعلى تنظيما بشكل ملحوظ من قبل TGF-β في خلايا MS-1، بينما في الخلايا البطانية الوريد السري البشري (HUVECs)، يتم زيادة كل من الحلزون والرخوة بعد التعرض ل TGF-β20.
قمنا بتقييم مدى عملية EndMT بطريقتين من خلال فحص تغييرات مورفولوجيا الخلايا ومن ثم عن طريق التحقيق في التغييرات في تعبير العلامات المتعلقة ب EndMT. بعد التعرض TGF-β لمدة 3 أيام، خضعت الخلايا EndMT مع اختلافات مورفولوجية متسقة والتغيرات في التعبير عن علامات EndMT ذات الصلة. بالإضافة إلى تلطيخ immunofluorescence قمنا به هنا، ويمكن أيضا رصد الاختلافات علامة عن طريق النشاف الغربية على مستوى التعبير البروتين أو عن طريق qRT-PCR (في الوقت الحقيقي النسخ العكسي الكمي PCR) في مستويات الجينات21. بالإضافة إلى هاتين الطريقتين لتوفير الوقت والتكاليف التي أظهرناها في هذا البروتوكول، هناك طرق أخرى لفحص EndMT. على سبيل المثال، يمكن إجراء تحليل النسخ (عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي أو qPCR) لمقارنة مستويات التعبير من الجينات ذات الصلة بطانة الرحم وميسينشيمال بين الخلايا المعالجة والسيطرة على تقييم دقيق EndMT22،23. وبالإضافة إلى ذلك، EndMT غالبا ما ينطوي على فقدان مستقر لوظيفة الحاجز، والتي يمكن تقييمها عن طريق التحليل الطيفي المعاوقة24. وعلاوة على ذلك، يمكن فحص دليل إضافي على اقتناء خلايا شبيهة بالخلايا الجذعية بواسطة خلايا مشتقة من EndMT. على سبيل المثال، في ظل ظروف ثقافية محددة، يمكن تمييز الخلايا الشبيهة بالميسينشيمال EndMT إلى أوبلاستات عظمية أو خلايا شوندروسيتي أو خلايا دهونية أو (ميو) الخلايا الليفية. لذلك، فإن التحليل الإضافي لتأكيد التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا التي تنتمي إلى نسب ميسودرم (أي التعبير الجيني وتلطيخ المصفوفة) مفيد لإظهار الطبيعة المتعددة القدرات للخلايا المشتقة من EndMT. وأخيرا، لا تقتصر طرق تقييم EndMT على الدراسات المختبرية، ولكن يمكن استقرائها للتحقيق في العلاقة بين EndMT وبعض الأمراض في الجسم الحي أو في أعضاء الجسم الحي السابق. وبهذا المعنى، فإن استخدام استراتيجيات تتبع النسب الخاصة بالنسب يمتد على نطاق واسع ليشمل الأبحاث المتعلقة ب EndMT25.
للتحقيق في دور الحلزون خلال EndMT ، في هذه الدراسة CRISPR / Cas9 تم استخدام تحرير الجينات لضرب هذا الجين. وأظهرت البيانات أن TGF-β2 فشلت في التوسط EndMT في الحلزون ناقص MS-1 الخلايا. أظهرت هذه الملاحظة أن الحلزون ضروري ل TGF-β2 المستحث EndMT في خلايا MS-1. استخدمنا شريطتعبير SgRNA مستقل يحركه U6 لإدخال sgRNAs محددة ل Cas9 لاستهداف Snail. وبالإضافة إلى هذه الطريقة، وصف ران وآخرون26 استراتيجية أخرى لاستنساخ تسلسل أوليغوس sgRNA في سقالة Cas9 لتوليد بناء يحتوي على كل من Cas9 وgRNAs. وتتيح النهج الجديدة الناشئة ل CRISPR/Cas دمج وظائف إضافية. على سبيل المثال، يمكن تحقيق الضربة القاضية المزدوجة أو الثلاثية من خلال تقديم المزيد من sgRNAs في الخلايا التي تعبر عن Cas927. يستهدف البروتين Cas13 المهندس ويهضم جزيئات الحمض النووي الريبي دون تعطيل الحمض النووي الداخلي28. إلى جانب ضرب الجينات مع CRISPR / Cas ، يمكن استخدام RNAs دبوس الشعر القصير (shRNAs) كبدائل لإسقاط التعبير الجيني المستهدف29بشكل ثابت. لجميع CRISPR / كاس طرق تحرير الجينات ، وينبغي دائما أن تؤخذ في الاعتبار الانقسام خارج الهدف. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تخفيف الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (siRNAs) التعبير الجيني عابرة وتركيز سيرنا مع انقسام الخلية30. كل من هذه الطرق قمع جزئيا التعبير الجيني المستهدف. في المقابل، يستخدم التعبير الجيني خارج الرحم أيضا للتحقق من وظيفة الجينات أثناء EndMT/EMT31. يمكن لهذا النهج تحديد ما إذا كان التنظيم التنظيمي للجين كافيا للحصول على استجابة EndMT. لذلك، يوجد حاليا العديد من الاستراتيجيات التقنية التي يمكن استخدامها لتحديد الجهات التنظيمية المحتملة ل EndMT والتحقق منها. إلى جانب ذلك ، يمكن أن يكون التحليل النسخي خيارا جيدا في تحديد وتحليل شامل للمنظمين ذوي الصلة EndMT. نوصي باستخدام نهج تكميلية مختلفة للتحقيق في تعديل EndMT.
باختصار، قدمنا سير عمل لتحديد العوامل التي قد تلعب أدوارا وظيفية أثناء EndMT الناجم عن β TGF. ويمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لدراسة ما إذا كان يمكن تعديل المحفزات الأخرى (أي السيتوكينات وعوامل النمو والمحفزات الميكانيكية والتفاعلات بين الخلية والخلية) EndMT ، والتفاعل بين TGF-β مع المحفزات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، سلطنا الضوء على نهج باستخدام تحرير الجينات CRIPSR/Cas لتوضيح ما إذا كان هناك حاجة إلى جين معين ل EndMT الناجم عن β TGF. لتوضيح هذه المنهجية، استخدمنا محفز EndMT القوي TGF-α2 في خلايا MS-1، ولكن يمكن تكييف البروتوكولات مع السيتوكينات الأخرى وأنواع الخلايا الأخرى. ونتوقع أن يكون هذا البروتوكول المفصل الموصوف بمثابة نقطة انطلاق للدراسات المستقبلية المتعلقة ب EndMT.

إن الانتقال البطاني إلى المتوسط (EndMT) هو ظاهرة بيولوجية متعددة الخطوات وديناميكية تم ربطها بعمليات فسيولوجية ومرضية متنوعة1و2. عند EndMT الخلايا البطانية تفقد تدريجيا الصفات البطانية، في حين الحصول على خصائص mesenchymal3; وهكذا، فإن الخلايا البطانية المضغوطة بإحكام والمنظمة تنظيما جيدا تفرق إلى خلايا ممدودة تشبه الخلايا المتوسطة. التغيرات المورفولوجية في EndMT تتزامن مع التعديلات في التعبير عن جينات وبروتينات معينة. بشكل عام ، ينخفض التعبير عن البروتينات التي تحافظ على الخصائص البطانية ، بما في ذلك البطانية الوعائية (VE) - cadherin ، الصفائح الدموية / EC جزيء الالتصاق -1 (CD31/Pecam-1). في وقت واحد، تتراكم البروتينات المتعلقة بوظائف العضلات الملساء، مثل أكتين العضلات α (α-Sma) وبروتين العضلات الملساء 22α (Sm22α). وقد أظهرت النتائج الناشئة أن EndMT بعد الولادة يساهم في تطور الأمراض البشرية، مثل السرطان، تليف القلب، ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي (PAH)، تصلب الشرايين (AS)، تليف الأعضاء، الخ2،4،5،6،7. إن الفهم الأعمق للآليات الأساسية ل EndMT وكيفية توجيه عملية EndMT سيوفر أساليب علاجية جديدة للأمراض المرتبطة ب EndMT والطب التجديدي.
TGF-β هي واحدة من الحث EndMT الرئيسية، وغيرها من العوامل المعروفة المعنية تشمل Wnt /β-catenin، نوتش، وبعض السيتوكينات الالتهابية1. وبما أن السياق الخلوي هو المفتاح للاستجابات التي أثارها TGF-β، فإن تفاعل TGF-β مع إشارات ترويج EndMT الأخرى وثيق الصلة ب TGF-β للحصول على استجابة EndMT. عند تفعيل TGF-β نوع سطح الخلية الأول والنوع الثاني مستقبلات سيرين / ثريونين كيناز، يتم تنشيط مسار Smad الكنسي داخل الخلايا. TGF-β مستقبلات بوساطة الفوسفورية Smad2/3 شكل المجمعات غير الرقمية مع Smad4 التي تنقل إلى النواة، حيث أنها upregulate التعبير عن عوامل النسخ EndMT ذات الصلة. على غرار الانتقال الظهاري -mesenchymal (EMT) ، يتم تحريض عوامل النسخ مثل الحلزون ، سبيكة ، تويست ، Zeb1 و Zeb2 عن طريق إشارات TGF-β والمساهمة في إعادة برمجة الجينات في EndMT8.
وقد تم تحديد الحلزون في كثير من الأحيان كعامل رئيسي في EndMT. الحلزون يربط إلى المروج من الجينات ترميز بروتينات الالتصاق الخلية ويقمع النسخ الخاصة بهم، وهو ما يقابله تعزيز التعبير عن البروتينات mesenchymal9. الخلايا البطانية تضم مجموعة غير متجانسة جدا والتأثير النسبي للمحفزات خارج الخلية المتنوعة على EndMT قد تختلف بين السياقات الخلوية البطانية أو أنواع الخلايا10. نظرا لتشابهها مع EMT ، فإن بعض المنهجيات مفيدة للتحقيق في كل من آليات EMT و EndMT8. وفي هذا الصدد، تؤكد الرابطة الدولية ل EMT بقوة على الحاجة إلى تقنيات تكميلية لإثبات حدوث EMT/EndMT11في نهاية المطاف.
هنا نحن نصف طريقة لرصد وتصور عملية EndMT الناجمة عن TGF-β. يوفر تلطيخ immunofluorescence المعلومات الأساسية حول تغيرات التعبير في البروتينات / العلامات المستهدفة ، والتي تستخدم كمؤشرات على ما إذا كانت عملية EndMT تحدث. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يتصور تلطيخ immunofluorescence توطين البروتينات / العلامات ومورفولوجيا الخلايا. لدراسة النشاط المحتمل لصناديق TFs محددة (أو غيرها من المنظمين المنبع أو المصب) المشاركة في TGF-β بوساطة EndMT، ونحن نصف بروتوكول باستخدام تتجمع بانتظام يكرر palindromic قصيرة متباعدة (CRISPR) / CRISPR المرتبطة البروتين 9 (Cas9) تحرير الجينات لاستنفاد جينات محددة من الخلايا، وذلك باستخدام الحلزون TF كمثال. Cas9 هو ثنائي الحمض النووي الريبي الموجهة الإندونوكلياز الذي يتعرف ويلتصق تسلسل مكملة لتسلسل CRISPR في البكتيريا12. يستخدم نظام CRISPR/Cas9 حاليا على نطاق واسع لأنه يسهل الهندسة الوراثية في المختبر وفي الجسم الحي13. بتوجيه من دليل واحد الجيش الملكي النيبالي (sgRNA) ، وأعرب عن ectopically Cas9 يولد كسر حبلا مزدوجة في تسلسل الاستهداف المحدد مسبقا في مكان معين الجينات. يتم الانضمام إلى النهاية غير المتجانسة (NHEJ) لإصلاح فواصل الخيط الناجمة عن Cas9 ، عن طريق عمليات إدراج أو حذف النيوكليوتيدات العشوائية مما يؤدي إلى تعطيل وتعطيل الجين المستهدف. ونصف بالتفصيل أساليب تصميم الزغازات الانتقائية وتوليد ناقلات متوافقة مع العدسية تحتوي على الزغازات الزغازة المصممة. ونتيجة لذلك، يمكن توليد خلايا بطانة الرحم المستقرة المستنفدة للجين بطريقة فعالة وموثوقة.
في هذه الدراسة، استخدمنا الخلايا البطانية الأوعية الدموية الدقيقة المورين (MS-1)14 كنظام نموذجي لفحص عملية EndMT الناجمة عن TGF-β2. أظهرت دراستنا السابقة أن الحلزون هو عامل النسخ الرئيسي الذي زاده TGF-β2 ، والذي يتم من خلاله تحريض EndMT في خلايا MS-115. عند تحرير الجينات CRISPR/Cas9 يبطل التعبير الحلزوني في خلايا MS-1، فشل TGF-β2 في التوسط EndMT. يمكن تطبيق سير العمل هذا لدراسة جينات أخرى (مشتبه بها) مرتبطة ب EndMT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter</td>
			<td>Pall Corporation, USA</td>
			<td>4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215; T4 DNA ligase buffer</td>
			<td>Thermofisher Scientific, USA</td>
			<td>B69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm round glass slice</td>
			<td>Knittel Glass,Germany</td>
			<td>VD10012Y1A.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>BD Eclipse, USA</td>
			<td>300629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Vector Laboratories, USA</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>VECTASHIELD Antifade&#160;Mounting Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AA19_PLKO vector</td>
			<td>Dr. M Gon&#231;alves, Leiden University Medical Center, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Serva Electrophoresis, USA</td>
			<td>1339903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG</td>
			<td>GE Healthcare, USA</td>
			<td>NA931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Cell signaling, USA</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11388991001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer O (10X)</td>
			<td>Thermofisher Scientific, USA</td>
			<td>BO5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BveI (Bspm1)</td>
			<td>Thermofisher Scientific, USA</td>
			<td>ER 1741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>&#160;Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat Alexa 488</td>
			<td>&#160;Invitrogen, USA</td>
			<td>A21208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>&#160;Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>&#160;Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa 594</td>
			<td>&#160;Invitrogen,USA</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabNed Plasmid kit</td>
			<td>LabNed, USA</td>
			<td>LN2400004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-1 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>HEMA, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Transparent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam-1 antibody</td>
			<td>&#160;Becton Dickinson,USA</td>
			<td>553370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences, USA</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLV-Cas9 plasmid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>Cas9BST-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>P9620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen, Germany</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sm22a antibody</td>
			<td>&#160;Abcam, UK</td>
			<td>ab14106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snail</td>
			<td>Cell signaling, USA</td>
			<td>3879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermofisher Scientific, USA</td>
			<td>EL 0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TGF-&#946;2</td>
			<td>Joachim Nickel, University of Wurzburg</td>
			<td>Gift</td>
			<td>Other commercial recommendation: 302-B2, R&#38;D systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>1086031000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris Bioscience, UK</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11814273001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tgf-&#946;-mediated endothelial to mesenchymal transition (endmt) and the functional assessment of endmt effectors using crispr/cas9 gene editing

استجابة للإشارات الخارجية المحددة وتنشيط بعض عوامل النسخ ، يمكن للخلايا البطانية التفريق إلى نمط الظاهرية الشبيه بالميزنشيمال ، وهي عملية يطلق عليها الانتقال البطاني إلى المتوسط (EndMT). وقد أشارت النتائج الناشئة إلى أن EndMT مرتبط سببيا بأمراض بشرية متعددة، مثل التليف والسرطان. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق الخلايا المتوسطة المشتقة من البطانية في إجراءات تجديد الأنسجة، حيث يمكن تمييزها بشكل أكبر إلى أنواع مختلفة من الخلايا (مثل الأروميات العظمية والخلايا الشوندروسيتية). وبالتالي ، فإن التلاعب الانتقائي في EndMT قد يكون له إمكانات سريرية. مثل الانتقال الظهاري-mesenchymal (EMT)، يمكن أن يكون سبب EndMT بقوة من قبل السيتوكين إفراز تحويل عامل النمو بيتا (TGF-β)، الذي يحفز التعبير عن ما يسمى عوامل النسخ EndMT (EndMT-TFs)، بما في ذلك الحلزون والرخوة. هذه EndMT-TFs ثم صعودا وهبوطاتغييد مستويات البروتينات المتوسطة والظهارية، على التوالي. هنا، نقوم بوصف طرق التحقيق في EndMT الناجم عن β TGF في المختبر، بما في ذلك بروتوكول لدراسة دور TFs معينة في EndMT الناجم عن β TGF. باستخدام هذه التقنيات، ونحن نقدم دليلا على أن TGF-α2 يحفز EndMT في خلايا بطانة الأوعية الدموية الدقيقة البنكرياس مورين (خلايا MS-1)، وأن الاستنفاد الوراثي للحلزون باستخدام تتجمع بانتظام يكرر palindromic قصيرة (CRISPR) / CRISPR المرتبطة البروتين 9 (Cas9) بوساطة تحرير الجينات، يلغي هذه الظاهرة. وقد يكون هذا النهج بمثابة نموذج لاستجواب التشكيلات المحتملة لعلم الأحياء البطاني، ويمكن استخدامه لأداء الشاشات الوراثية أو الدوائية من أجل تحديد المنظمين مستجدات EndMT، مع إمكانية تطبيقها في الأمراض البشرية.

TGF-β2 يحفز EndMT ويحفز التعبير الحلزوني في الخلايا البطانية MS-1 TGF-β هي واحدة من السيتوكينات مع أكبر إمكانات للحث EndMT. بعد علاج خلايا MS-1 مع TGF-β2 (1 نانوغرام / مل) لمدة 3 أيام ، تفقد خلايا MS-1 البطانية هيكلها الشبيه بالحصى وتفرق إلى خلايا تشبه المغزل على شكل مغزل (الشكل 1A)15. لمزيد من التحقق من دور TGF-β2 في إحداث تغييرات في الخلايا الظاهري, نحن تعاملنا مسبقا مع الخلايا مع جزيء صغير أكتيفين مستقبلات مثل كيناز (ALK)4/ALK5/ALK7 المانع SB431542 قبل التحفيز TGF-β219. SB431542 إلغاء تماما TGF-β2 الناجمة عن التغيرات في مورفولوجيا الخلية(الشكل 1A). تم إجراء مزيد من التحقيق في عملية EndMT المستحثة TGF-β2 من خلال دراسة التغيرات في التعبير عن العلامات المتعلقة ب EndMT. كما هو مبين في الشكل 1B، انخفض البروتين البطاني Pecam-1 بقوة بعد تحفيز TGF-β2 ، في حين تم رفع عامل Sm22α المتوسط بشكل عميق من قبل TGF-β215. هذه البيانات تتفق مع فكرة أن TGF-β2 أثار EndMT في خلايا MS-1. بعد ذلك ، حققنا في آثار TGF-β2 على تعبير الحلزون والرخوة. كما هو مبين في الشكل 1C، تم تنظيم Snail بشكل ملحوظ من قبل TGF-β2 ، في حين لم يتأثر تعبير Slug ب TGF-β2 في خلايا MS-115. يظهر القياس الكمي لتعبير الحلزون من ثلاث تجارب مستقلة في الشكل 1D.
استنفاد الحلزون بواسطة CRISPR/Cas9 في الخلايا البطانية MS-1 كما تم تحريض الحلزون من قبل TGF-β2 والمشاركة على الأرجح في TGF-β2 بوساطة EndMT، قمنا كريسبر / Cas9 تحرير الجينات لاستنفاد وراثيا التعبير الحلزون في خلايا MS-1. افترضنا أن استنفاد الحلزون سيكون كافيا لمنع TGF-β2 الناجم عن EndMT. كما هو مبين في الشكل 2A، قمنا بتوليد خلايا الحلزون بالضربة القاضية في خطوتين. أولا، تم التعبير عن Cas9 خارج الرحم عن طريق إصابة خلايا MS-1 ب Cas9 تعبر عن الفيروس العدسي. منذ هناك كاسيت مقاومة blasticidin في بناء pLV-Cas9، ونحن فحص التعبير عن Cas9 من قبل تحليل لطخة الغربية في الخلايا المقاومة blasticidin(الشكل 2D). في وقت لاحق، قدمنا sgRNAs التي استهدفت على وجه التحديد الحلزون لتعطيل التعبير البروتين. كما تم تنفيذ هذا الإجراء عن طريق العدوى مع الجسيمات العدسية التي تحمل AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA بناء، والذي يتضمن كاسيت التعبير بوروميسين. أصيبت الخلايا المعبرة عن Cas9 مرة أخرى بالرنا الذي يحتوي على فيروس العدسة وتم اختيارها بشكل أكبر مع البوريميسين. تم تصميم اثنين من أوليغو SGRNA التكميلية التي تستهدف الحلزون مورين مع نشاط منخفض خارج الهدف المتوقع(الشكل 2B, C). بعد إدخال اثنين من SgRNAs الحلزون مستقلة في Cas9 التعبير عن MS-1 الخلايا, تم إلغاء التعبير عن بروتين الحلزون(الشكل 2D)15.
نقص الحلزون يمنع TGF-β2 الناجمة عن EndMT في الخلايا MS-1 لإثبات وظيفة الحلزون في TGF-β2 بوساطة EndMT ، قمنا بإجراء فحص EndMT في الخلايا المستنفدة للحلزون وقارنناه بخلايا MS-1 الأبوية. كما هو مبين في الشكل 3A، كانت الضربة القاضية من الحلزون كافية لمنع مورفولوجيا الخلايا الشبيهة بالخلايا الليفية التي يقودها TGF-β2 في خلايا MS-115. وبالإضافة إلى ذلك، تم حظر تماما انخفاض TGF-β2 بوساطة في Pecam-1 وتعزيز Sm22α في الخلايا MS-1 الحلزون المنضب. باختصار، أثبتنا أن الحلزون أمر بالغ الأهمية لTGF-β2 بوساطة EndMT في خلايا MS-1 (الشكل 3B)15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62198/62198fig1v2.jpg"> الشكل 1. TGF-β2 يحفز EndMT وتعبير الحلزون في خلايا MS-1. أ. آثار TGF-β2 و / أو TGF-β نوع I مستقبلات كيناز المانع SB-431542 على مورفولوجيا الخلية. صور برايتفيلد لخلايا MS-1 عند العلاج مع TGF-β2 (1 نانوغرام / مل) و / أو SB-431542 (SB، 5 ميكرومتر، تدار 30 دقيقة قبل TGF-β2) لمدة 2 أيام. يمثل شريط المقياس 200 ميكرومتر. تلطيخ immunofluorescence من Pecam-1 (الأخضر) وSM22α (أحمر) في خلايا MS-1 المستزرعة في المتوسطة التي تحتوي على TGF-β2 (1 نانوغرام / مل) لمدة 3 أيام. يتم تصور النوى باللون الأزرق (DAPI). شريط المقياس: 50 ميكرومتر. تم تعزيز التعبير عن الحلزون ، ولكن ليس سبيكة ، من خلال تحفيز TGF-β2 ، كما ذكر سابقا في Ma et al15. د- القياس الكمي للتعبير الحلزون من خلال دمج النتائج من ثلاث تجارب لطخة الغربية المستقلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62198/62198fig1v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62198/62198fig2v2.jpg"> الشكل 2. استنفاد الحلزون بواسطة تحرير الجينات CRISPR-Cas9. أ. مخطط يصور كيفية توليد خلايا الضربة القاضية الحلزون. بسيد: بلاستسيدين. بورو: بوروميسين. باء - ال 20 في المائ أوليغونوكليوتيدات من اثنين من sgRNAs مستقلة تستهدف الحلزون باستخدام CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) وكاس أوففايندر (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). جيم - الدوائر التي لا يمكن أن النشاط المتوقع خارج الهدف من gRNAs اثنين للحلزون باستخدام كاس-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). د- Cas9 وتعبير الحلزون في نوع البرية (WT) و Cas9-overexpressed MS-1 تقاس بتحليل لطخة الغربية. هاء - ال هاء خروج المغلوب من الحلزون مع اثنين من gRNAs مستقلة في خلايا MS-1 كما يقاس تحليل لطخة الغربية. أبلغنا عن نتائج مماثلة في Ma et al15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62198/62198fig2v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62198/62198fig3v2.jpg"> الشكل 3. الاستنفاد الوراثي للحلزون يمنع TGF-β2 الناجمة عن EndMT في خلايا MS-1. أ. صور برايتفيلد من خلايا MS-1 عند العلاج مع TGF-β2 (0.1 نانوغرام / مل) لمدة 3 أيام في wildtype (WT، لوحة العليا) والحلزون خرج (لوحة السفلى) الخلايا. يمثل شريط المقياس 200 ميكرومتر. B. تلطيخ Immunofluorescent لPecam-1 (أخضر) و Sm22α (أحمر) ونوى (أزرق) من خلايا MS-1 المستزرعة في المتوسطة التي تحتوي على TGF-β2 (1 نانوغرام / مل) لمدة 3 أيام. استنفاد الحلزون إلغاء TGF-β2 الناجمة عن انخفاض Pecam-1 وزيادة التعبير Sm22α. يمثل شريط المقياس تمثيل تخطيطي 50 ميكرومترا مئويا لتأثير الضربة القاضية الحلزونية على EndMT الناجم عن β TGF في خلايا MS-1. TGF-β يحفز التعبير عن الحلزون من خلال مسار Smad عن طريق الفوسفورية Smad2/3 ويدفع كذلك EndMT. ضرب الحلزون باستخدام CRISPR / Cas9 القائم على تحرير الجينات إلغاء TGF - β بوساطة EndMT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62198/62198fig3v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about TGF-ÃŽÂ²-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing at JoVE.com

TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

نحن نصف طرق التحقيق في EndMT الناجم عن TGF-β2 في الخلايا البطانية من خلال مراقبة تغيرات مورفولوجيا الخلايا وفحص التغيرات في علامة EndMT ذات الصلة باستخدام تلطيخ immunofluorescence. تم وصف تحرير الجينات CRISPR/Cas9 واستخدامه لاستنفاد ترميز الجينات الحلزون للتحقيق في دورها في EndMT الناجم عن TGF-β2.

TGF-β بوساطة البطانية إلى الانتقال المتوسط (EndMT) والتقييم الوظيفي لمؤثري EndMT باستخدام CRISPR/Cas9 تحرير الجينات

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

إن الانتقال البطاني إلى المتوسط هو عملية خلوية تقوم فيها الخلايا البطانية بتغيير مورفولوجيا الحصى إلى نمط فينوتيب يشبه الخلايا الليفية. والسيتوكين TGF بيتا، تحويل عامل النمو بيتا، هو المحرك الرئيسي لهذا التحول. تحليل التغيرات في مورفولوجيا الخلايا ومستويات التعبير من علامات البطانية و mesenchymal يسمح لنا لتقييم حدوث الانتقال البطانية إلى المتوسطة.تربط البيانات الناشئة عملية الانتقال البطانية إلى الأمراض المختلفة بما في ذلك السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية والتليف. وتشير البيانات إلى أن التدخل قد يكون ذا فائدة علاجية. من خلال تحفيز عملية الانتقال البطانية إلى المتوسطة ، والتي تحدث أثناء تكوين الجنين وتطور الأعضاء ، قد نكون قادرين على تجديد الأنسجة المشتقة من الميكنشيمال مثل الغضاريف والعظام والعضلات.للكشف عن البروتين داخل الخلايا عن طريق تلطيخ immunoflourescence، permeabilization الخلية باستخدام 0.1٪ تريتون X-100 ضروري للسماح للأجسام المضادة لتمرير من خلال أغشية الخلايا. مع هذا العرض التوضيحي الفيديو، وسوف يحصل الباحثون على فهم جيد لكيفية التحقيق في دور السيتوكينات مثل TGF-بيتا في الانتقال البطانية إلى المتوسطة. أولا، البذور 1 × 10 ^5 يعكس خلايا MS1 البطانية الجزيرة البنكرياس في DMEM تكملها 10٪ FBS و 100 وحدة لكل ملليلتر من البنسلين والستربتوميسين على لوحة ثقافة 0.1٪ الجيلاتين المغلفة.بعد الحضانة بين عشية وضحاها في حاضنة ثقافة الخلية، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني قبل علاج مع اثنين من ملليلتر من 0.25٪ تريبسين، 0.02٪ حل EDTA لمدة دقيقتين في 37 درجة مئوية. عندما تبدأ الخلايا في الانفصال ، قم بإرواء التفاعل بخمسة ملليلترات من وسيط الثقافة الكامل ونقل تعليق الخلية الناتج إلى أنبوب 15 ملليلتر للطرد المركزي. Resuspend بيليه في أربعة ملليلتر من المتوسطة كاملة جديدة للعد.والبذور 1 × 10 ^ 3 خلايا لكل سنتيمتر مكعب في حاوية جديدة ثقافة الخلية. بعد الثقافة بين عشية وضحاها، علاج اثنين من الآبار مع خمسة ميكرومولار TGF بيتا مستقبلات كيناز المانع SB-431542 واثنين من الآبار مع التحكم في المذيبات DMSO. ووضع الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 30 دقيقة.في نهاية الحضانة، عالج بئرين بالتحكم في السيارة وبأبارين باستخدام TGF-beta 2. بعد ثلاثة أيام، استخدم مجهر مقلوب لفحص مورفولوجيا الخلية لكل مجموعة علاج خلايا تحت التصوير الساطع. لتقييم التغيرات ذات الصلة بعلامة endMT عن طريق تلطيخ immunofluorescent ، فصل الخلايا من ثقافة الخلية MS1 المناسبة ، كما هو موضح.والبذور الخلايا في 1.9 X 10 ^ 3 تركيز الخلايا على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 12 ملليمتر نظارات تغطية مستديرة وضعت داخل الآبار الفردية من لوحة 24 جيدا. بعد الثقافة بين عشية وضحاها، علاج الخلايا مع ملليلتر نانوغرام واحد من TGF-بيتا 2 لمدة ثلاثة أيام. في نهاية الحضانة، اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني وأصلح الثقافات المعالجة ب 300 ميكرولتر من 4٪ فورمالديهايد لكل بئر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.في نهاية التثبيت، اغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني قبل permeabilizing الخلايا مع 300 ميكرولتر من 0.1٪ تريتون X-100 وبرنامج تلفزيوني لكل بئر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، اغسل الخلايا ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني ومنع الخلايا مع 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني. بعد 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، قم بتسمية الخلايا بالأجسام المضادة PECAM-1 و SM22-alpha الأساسية لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، تليها ثلاث يغسل في برنامج تلفزيوني.بعد الغسيل الأخير ، احتضن الخلايا بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، واغسل الخلايا ثلاث مرات مع PBS قبل تركيب الخلايا مع وسيط تصاعد تكمله DAPI وزلة غطاء. ثم ختم حواف الغطاء زلة مع طلاء الأظافر واضحة وصورة التعبير علامة الخلية عن طريق المجهر confocal مضان باستخدام المرشحات المناسبة وفقا لبروتوكولات التصوير القياسية. بعد ثلاثة أيام من العلاج مع TGF-beta 2 ، تفقد خلايا MS1 البطانية بنيتها الشبيهة بالحصى وتفرق إلى خلايا تشبه المغزل.يتم قمع هذا التمايز الناجم عن TGF-beta 2 عندما تتعرض الخلايا لمثبط كيناز مستقبلات TGF-beta SB-431542. يتم تقليل التعبير عن البروتين البطاني PECAM-1 بقوة بعد تحفيز TGF-beta 2 في حين أن العامل المتوسط SM-22 alpha منظم بشكل عميق. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تنظيم الحلزون بشكل ملحوظ من قبل التعرض TGF بيتا 2 في حين لا يتأثر التعبير سبيكة.كما لوحظ CRISPR-Cas9 تحرير الجينات يمكن استخدامها لتسهيل إدخال اثنين من الحلزون دليل واحد مستقل RNAs في Cas9 التعبير عن خلايا MS1 لتعطيل التعبير الحلزون. خروج المغلوب من الحلزون كافية لمنع مورفولوجيا الخلايا الليفية مثل مدفوعة TGF بيتا 2 في خلايا MS1 ومنع TGF-بيتا 2 بوساطة PECAM-1 الانخفاض وتعزيز SM-22 ألفا. يمكن التحقق من صحة تقييم التغيرات في مورفولوجيا الخلايا والتعبير عن العلامات البطانية والميدنشيمالية عن طريق الفلورة المناعية من خلال قياس التعبير عن هذه العلامات على PCR الكمي في تحليل البقع الغربية.وقد سمحت هذه التقنية للكشف عن الانتقال البطانية إلى المتوسطة للباحثين للتحقيق في هذه الأهمية الناشئة كعملية فسيولوجية تحدث في أمراض متعددة.

Research

JoVE Journal

Biology

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

Light/dark Transition Test for Mice

الضوء / الظلام لاختبار الانتقال الفئران

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

الكشف عن البديل خلال الربط طلائي-الوسيطة الانتقالية

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

تعيين بروتوكول لاستخدام الجينات إثراء التحليل لتحديد نموذج الحيوان المناسب للبحوث متعدية

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

تقييم الحيوانات المنوية الأسماك باستخدام برامج وأجهزة التبريد

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Signaling

التحليل الجزيئي غشائي الوسيطة الانتقالية الناجمة عن تحويل الإشارات عامل النمو-β

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

إسكات شراره: CRISPR/كاس 9 الجينوم التحرير في الأسماك الكهربائية ضعيف

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

إعداد وحقن أجنة البعوض Culex لتوليد الطفرات فارغة باستخدام CRISPR / Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

هندسة الجينوم للخلايا B البشرية الأولية باستخدام CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

حقن الجرو والكبار لRNAi و CRISPR تحرير الجينات في Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...