Name: tgf-&#946;-mediated endothelial to mesenchymal transition (endmt) and the functional assessment of endmt effectors using crispr/cas9 gene editing
Uploaded: 2021-02-26T14:00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about TGF-ÃŽÂ²-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing at JoVE.com

अनुसंधान CGC.NL और नीदरलैंड कार्डियो वैस्कुलर रिसर्च इनिशिएटिव द्वारा समर्थित किया गया था: डच हार्ट फाउंडेशन, डच फेडरेशन ऑफ यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर्स, नीदरलैंड ऑर्गनाइजेशन फॉर हेल्थ रिसर्च एंड डेवलपमेंट, और रॉयल नीदरलैंड एकेडमी ऑफ साइंसेज ग्रांट को Phaedra-impact (http://www.phaedraresearch.nl) से सम्मानित किया गया । जेएम को चीनी छात्रवृत्ति परिषद द्वारा समर्थित किया जाता है । जीएसडी को एएफएम-टेलीथॉन [22379], एफओपी इटालिया से ट्रैम्पोलिन अनुदान और ला फंडासिओ ला मार्टो डी टीवी3 (#202038) से अनुदान द्वारा समर्थित किया जाता है।

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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

इस प्रक्रिया को मॉडुलन करने और एंडएमटी से संबंधित बीमारियों को लक्षित करने के लिए एंडएमटी के तंत्र को समझना महत्वपूर्ण है। यहां, हमने कोशिकाओं से घोंघा के CRISPR/Cas9-मध्यस्थता स्थिर जीन की कमी का प्रदर्शन करके, टीजीएफ-β-प्रेरित एंडएमटी परख करने और टीजीएफ-β-ट्रिगर एंडएमटी में एंडएमटी-टीएफ घोंघा की भूमिका से पूछताछ करने के तरीकों का वर्णन किया । CRISPR/Cas9 दृष्टिकोण का उपयोग कर घोंघा की कमी सफलतापूर्वक एमएस-1 कोशिकाओं(चित्रा 3C)में TGF-12 संचालित EndMT निरस्त । एंडएमटी पर टीजीएफ-β जैसे किसी भी साइटोकिन्स के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए, ईसीएस को साइटोकिन्स के संपर्क में किया गया था और फिर एंडएमटी की घटना का आकलन रूपात्मक परिवर्तनों और एंडोथेलियल और मेसेन्चिमल मार्कर अभिव्यक्ति के अनुसार किया गया था। TGF-12 दृढ़ता से एमएस-1 कोशिकाओं में EndMT प्रेरित प्रतिलेखन कारक घोंघा की अभिव्यक्ति में एक मजबूत वृद्धि के साथ। टीजीएफ-β द्वारा प्रेरित एंडएमटी-टीएफएस प्रजातियों या ऊतक-विशिष्ट एंडोथेलियल सेल प्रकार के अनुसार भिन्न हो सकता है। उदाहरण के लिए, हमने देखा कि घोंघा लेकिन स्लग को एमएस-1 कोशिकाओं में टीजीएफ-β द्वारा काफी हद तक उपनियमित किया गया था, जबकि मानव गर्भनाल नस एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूवीसी) में, टीजीएफ-β20के संपर्क में आने के बाद घोंघा और स्लग दोनों बढ़ जाते हैं।
हमने सेल आकृति विज्ञान परिवर्तनों की जांच करके और फिर एंडएमटी से संबंधित मार्कर अभिव्यक्ति में परिवर्तनों की जांच करके दो तरीकों से एंडएमटी प्रक्रिया की सीमा का आकलन किया। 3 दिनों के लिए टीजीएफ-β एक्सपोजर के बाद, कोशिकाओं को लगातार रूपात्मक विविधताओं और एंडएमटी से संबंधित मार्कर की अभिव्यक्ति में परिवर्तन के साथ एंडएमटी से गुजरना पड़ा। हम यहां प्रदर्शन इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के अलावा, मार्कर विविधताओं को प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर पर पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा या जीन स्तर21पर क्यूआरटी-पीसीआर (रीयल-टाइम क्वांटिटेटिव रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर) द्वारा भी निगरानी की जा सकती है। इस प्रोटोकॉल में हमने जो दो समय और लागत-बचत विधियों को दिखाया है, उसके अलावा, एंडएमटी की जांच करने के अन्य तरीके हैं। उदाहरण के लिए, इलाज और नियंत्रण कोशिकाओं के बीच एंडोथेलियल-और मेसेंचिमल से संबंधित जीन के अभिव्यक्ति स्तर की तुलना करने के लिए ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण (आरएनए अनुक्रमण या क्यूपीसीआर द्वारा) प्रदर्शन करना एंडएमटी22, 23का सटीक आकलन कर सकता है। इसके अलावा, एंडएमटी में अक्सर बाधा कार्य का स्थिर नुकसान होता है, जिसका मूल्यांकन बाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी24द्वारा किया जा सकता है। इसके अलावा, एंडएमटी-व्युत्पन्न कोशिकाओं द्वारा स्टेम सेल जैसी संपत्तियों के अधिग्रहण के अतिरिक्त प्रमाण की जांच की जा सकती है। उदाहरण के लिए, विशिष्ट संस्कृति स्थितियों के तहत, एंडएमटी मेसेनचिमल जैसी कोशिकाओं को ऑस्टियोब्लास्ट, कोंड्रोसाइट्स, एडिपोसाइट्स या (मायो) फाइब्रोब्लास्ट में और अलग किया जा सकता है। इसलिए, मेसोडर्म वंश (यानी, जीन अभिव्यक्ति और मैट्रिक्स धुंधला) से संबंधित विभिन्न कोशिका प्रकारों में भेदभाव की पुष्टि करने के लिए अतिरिक्त विश्लेषण एंडएमटी-व्युत्पन्न कोशिकाओं की बहुपेंट प्रकृति का प्रदर्शन करने के लिए उपयोगी है। अंत में, एंडएमटी मूल्यांकन विधियां इन विट्रो अध्ययनों तक सीमित नहीं हैं, लेकिन वीवो में या पूर्व वीवो अंगों में एंडएमटी और कुछ बीमारियों के बीच संबंध की जांच करने के लिए एक्सपेरिमेंट किया जा सकता है। इस अर्थ में, एंडोथेलियल-विशिष्ट वंश ट्रेसिंग रणनीतियों का उपयोग मोटे तौर पर एंडएमटी से संबंधित अनुसंधान25तक बढ़ाया गया है।
एंडएमटी के दौरान घोंघा की भूमिका की जांच करने के लिए, इस अध्ययन में CRISPR/Cas9 जीन संपादन का उपयोग इस जीन को खटखटाने के लिए किया गया था । आंकड़ों से पता चला है कि TGF-12 घोंघा कमी एमएस-1 कोशिकाओं में EndMT मध्यस्थता करने में विफल रहा है । इस अवलोकन से पता चला कि एमएस-1 कोशिकाओं में टीजीएफ-12 प्रेरित एंडएमटी के लिए घोंघा आवश्यक है। हमने घोंघा को लक्षित करने के लिए Cas9 के लिए विशिष्ट एसजीआरएनए शुरू करने के लिए एक स्वतंत्र U6-चालित sgRNA अभिव्यक्ति कैसेट का उपयोग किया। इस विधि के अलावा, भागा एट अल.26 ने Cas9 पाड़ में sgRNA ओलिगोस अनुक्रम क्लोनिंग के लिए एक और रणनीति का वर्णन किया ताकि Cas9 और gRNAs दोनों युक्त निर्माण उत्पन्न किया जा सके। उभरते उपन्यास दृष्टिकोण CRISPR/Cas के लिए अतिरिक्त कार्यों को शामिल करने की अनुमति देते हैं । उदाहरण के लिए, Cas927व्यक्त कोशिकाओं में अधिक sgRNAs वितरित करके डबल या ट्रिपल नॉकआउट प्राप्त किया जा सकता है । इंजीनियर Cas13 प्रोटीन लक्ष्य और अंतर्जात डीएनए28को बाधित किए बिना आरएनए अणुओं को पचा । CRISPR/Cas के साथ जीन बाहर दस्तक देने के अलावा, लघु हेयरपिन RNAs (shRNAs) विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है नीचे स्थिर लक्षित जीन अभिव्यक्ति29दस्तक । सभी CRISPR/Cas जीन संपादन विधियों के लिए, ऑफ-टारगेट दरार को हमेशा ध्यान में रखा जाना चाहिए । इसके अलावा, छोटे हस्तक्षेप आरएनए (siRNAs) क्षणिक रूप से जीन अभिव्यक्ति मौन और सिरना एकाग्रता सेल डिवीजन30के साथ पतला है । ये दोनों तरीके आंशिक रूप से लक्षित जीन अभिव्यक्ति को दबाते हैं । इसके विपरीत, एंडएमटी/ईएमटी31के दौरान जीन फंक्शन को सत्यापित करने के लिए एक्टोपिक जीन एक्सप्रेशन का भी इस्तेमाल किया जाता है । यह दृष्टिकोण यह निर्धारित कर सकता है कि किसी जीन का अपरेगुलेशन एंडएमटी प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है या नहीं। इसलिए, वर्तमान में कई तकनीकी रणनीतियां हैं जिनका उपयोग एंडएमटी के संभावित नियामकों की पहचान करने और सत्यापित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, एंडएमटी से संबंधित नियामकों की पहचान और व्यापक विश्लेषण में ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण एक अच्छा विकल्प हो सकता है। हम एंडएमटी के मॉड्यूलेशन की जांच करने के लिए विभिन्न पूरक दृष्टिकोणों का उपयोग करने की सलाह देते हैं।
संक्षेप में, हमने उन कारकों की पहचान करने के लिए एक कार्यप्रवाह पेश किया जो टीजीएफ-β-प्रेरित एंडएमटी के दौरान कार्यात्मक भूमिकाएं निभा सकते हैं। इस विधि का उपयोग यह अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है कि क्या अन्य उत्तेजनाएं (यानी, साइटोकिन्स, विकास कारक, यांत्रिक उत्तेजनाएं, सेल-सेल इंटरैक्शन) एंडएमटी को संशोधित कर सकते हैं, और अन्य उत्तेजनाओं के साथ टीजीएफ-β का परस्पर क्रिया। इसके अलावा, हमने CRIPSR/Cas जीन संपादन का उपयोग करके एक दृष्टिकोण पर प्रकाश डाला ताकि यह स्पष्ट किया जा सके कि क्या टीजीएफ-β-प्रेरित एंडएमटी के लिए एक निश्चित जीन की आवश्यकता है । इस पद्धति को समझाने के लिए, हमने एमएस-1 कोशिकाओं में मजबूत एंडएमटी प्रेरक टीजीएफ-ए2 का उपयोग किया, लेकिन प्रोटोकॉल को अन्य साइटोकिन्स और अन्य सेल प्रकारों के अनुकूल बनाया जा सकता है। हम उम्मीद करते हैं कि वर्णित यह विस्तृत प्रोटोकॉल भविष्य के एंडएमटी से संबंधित अध्ययनों के लिए एक कदम पत्थर के रूप में काम करेगा।

एंडोथेलियल टू मेसेंचिमल ट्रांजिशन (एंडएमटी) एक बहुस्टेप और गतिशील जैविक घटना है जिसे विविध शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं से जोड़ा गया है1,2. एंडएमटी एंडोथेलियल कोशिकाओं पर धीरे-धीरे अपने एंडोथेलियल लक्षण खो देते हैं, जबकि मेसेंचिमल गुण प्राप्त करते हैं3; इस प्रकार, कसकर संकुचित और अच्छी तरह से संगठित एंडोथेलियल कोशिकाएं लम्बी मेसेंचिमल जैसी कोशिकाओं में अंतर करती हैं। एंडएमटी में रूपात्मक परिवर्तन कुछ जीन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन के साथ मेल खाते हैं। सामान्य तौर पर, संवहनी एंडोथेलियल (वीई)-कैडेरिन, प्लेटलेट/ईसी आसंजन अणु-1 (सीडी 31/पेकैम-1) सहित एंडोथेलियल विशेषताओं को बनाए रखने वाले प्रोटीन की अभिव्यक्ति में गिरावट आती है । इसके साथ ही, मेसेंचिमल कार्यों से संबंधित प्रोटीन, जैसे α-चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन (α-एसएमए) और चिकनी मांसपेशी प्रोटीन 22α (Sm22α) जमा होते हैं। उभरते परिणामों ने दिखा दिया है कि प्रसवोत्तर एंडएमटी मानव रोगों के विकास में योगदान देता है, जैसे कैंसर, कार्डियक फाइब्रोसिस, पल्मोनरी धमनी उच्च रक्तचाप (पीएएच), एथेरोस्क्लेरोसिस (एएस), अंग फाइब्रोसिस, आदि2,4,5,6,7। एंडएमटी के अंतर्निहित तंत्रों की गहरी समझ और एंडएमटी प्रक्रिया को कैसे निर्देशित किया जाए, एंडएमटी से संबंधित बीमारियों और पुनर्योजी दवा के लिए उपन्यास चिकित्सीय तरीके प्रदान करेंगे।
टीजीएफ-β मुख्य एंडएमटी प्रेरकों में से एक है, और अन्य ज्ञात शामिल कारकों में Wnt/β-catenin, पायदान, और कुछ भड़काऊ साइटोकिन्स1शामिल हैं । चूंकि सेलुलर संदर्भ टीजीएफ-β द्वारा ट्रिगर की गई प्रतिक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए टीजीएफ-β का इंटरप्ले अन्य एंडएमटी को बढ़ावा देने वाले संकेतों के साथ एक एंडएमटी प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए टीजीएफ-β के लिए प्रासंगिक है। टीजीएफ-β सेल सरफेस टाइप I और टाइप II सेरीन/थ्रेओनिन किनेज रिसेप्टर्स की सक्रियता पर, इंट्रासेल्युलर कैनोनिकल स्माड पाथवे सक्रिय है। टीजीएफ-β रिसेप्टर-मध्यस्थता वाले फॉस्फोरीलेटेड Smad2/3 Smad4 के साथ हेट्रोमेरिक कॉम्प्लेक्स बनाते हैं जो नाभिक में स्थानांतरित होते हैं, जहां वे एंडएमटी से संबंधित प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति को बढ़ाते हैं। एपिथेलियल-मेसेन्चिमल ट्रांजिशन (ईएमटी) के समान, घोंघा, स्लग, ट्विस्ट, जेब1 और जेब2 जैसे ट्रांसक्रिप्शन कारक टीजीएफ-β सिग्नलिंग द्वारा प्रेरित होते हैं और एंडएमटी8में जीन रीप्रोग्रामिंग में योगदान देते हैं।
घोंघा अक्सर EndMT में एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में पहचान की गई है । घोंघा जीन एन्कोडिंग सेल-सेल आसंजन प्रोटीन के प्रमोटर को बांधता है और उनके प्रतिलेखन को दबा देता है, जो मेसेंकिमल प्रोटीन9की अभिव्यक्ति की वृद्धि से प्रतिसंतुलित होता है। एंडोथेलियल कोशिकाओं में बहुत ही विषम आबादी होती है और एंडएमटी पर विविध बाहुलीय उत्तेजनाओं का सापेक्ष प्रभाव एंडोथेलियल सेलुलर संदर्भों या सेल प्रकार10के बीच भिन्न हो सकता है । ईएमटी के साथ इसकी समानताओं के कारण, कुछ तरीके तंत्र ईएमटी और एंडएमटी8दोनों की जांच करने के लिए उपयोगी हैं। इस संबंध में, ईएमटी इंटरनेशनल एसोसिएशन (टेमटिया) अंततः ईएमटी/एंडएमटी11की घटना को प्रदर्शित करने के लिए पूरक तकनीकों की आवश्यकता पर जोर देता है ।
यहां हम टीजीएफ-β-प्रेरित एंडएमटी प्रक्रिया की निगरानी और कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग लक्षित प्रोटीन/मार्कर में अभिव्यक्ति परिवर्तन के बारे में बुनियादी जानकारी प्रदान करता है, जिसका उपयोग एंडएमटी प्रक्रिया के संकेतक के रूप में किया जाता है । इसके अतिरिक्त, इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग प्रोटीन/मार्कर और सेल आकृति विज्ञान के स्थानीयकरण की कल्पना कर सकते हैं । टीजीएफ-β मध्यस्थता एंडएमटी में शामिल विशिष्ट टीएफ (या अन्य अपस्ट्रीम या डाउनस्ट्रीम नियामकों) की संभावित गतिविधि का अध्ययन करने के लिए, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो एक उदाहरण के रूप में टीएफ घोंघे का उपयोग करके कोशिकाओं से विशिष्ट जीन को कम करने के लिए क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स (CRISPR) /CRISPR-संबद्ध प्रोटीन 9 (Cas9) जीन संपादन का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । Cas9 एक दोहरी आरएनए-निर्देशित डीएनए एंडोन्यूक्लियेज है जो बैक्टीरिया12में CRISPR दृश्यों के पूरक दृश्यों को पहचानता है और क्लीव्स करता है। CRISPR/Cas9 प्रणाली वर्तमान में बड़े पैमाने पर उपयोग किया जाता है क्योंकि यह इन विट्रो और वीवो13में जेनेटिक इंजीनियरिंग की सुविधा प्रदान करता है । एक एकल गाइड आरएनए (sgRNA) द्वारा निर्देशित, एक्टोपिकल रूप से व्यक्त Cas9 एक विशिष्ट जीन लोकस में एक पूर्वचयनित लक्ष्यीकरण अनुक्रम पर एक डबल स्ट्रैंड ब्रेक उत्पन्न करता है। गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल होने (एनएचईजे) Cas9-प्रेरित स्ट्रैंड ब्रेक की मरम्मत के लिए होता है, यादृच्छिक न्यूक्लियोटाइड सम्मिलन या विलोपन के माध्यम से जिससे लक्षित जीन में व्यवधान और निष्क्रियता होती है। हम चुनिंदा एसजीआरएनए डिजाइन करने और डिज़ाइन किए गए एसजीआरएनए वाले लेंटीविराल-संगत वैक्टर उत्पन्न करने के लिए विस्तार से तरीकों का वर्णन करते हैं। नतीजतन, स्थिर जीन-समाप्त एंडोथेलियल कोशिकाओं को कुशल और विश्वसनीय तरीके से उत्पन्न किया जा सकता है।
इस अध्ययन में, हमने टीजीएफ-2-प्रेरित एंडएमटी प्रक्रिया की जांच करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में मुरीन अग्नाशय माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एमएस-1)14 का उपयोग किया। हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि घोंघा मुख्य प्रतिलेखन कारक TGF-12 द्वारा वृद्धि हुई है, जिसके द्वारा EndMT एमएस-1 कोशिकाओं15में प्रेरित किया जाता है । एमएस-1 कोशिकाओं में घोंघा अभिव्यक्ति को समाप्त करने के लिए CRISPR/Cas9 जीन संपादन पर, TGF-12 EndMT मध्यस्थता करने में विफल रहा । इस कार्यप्रवाह को अन्य (संदिग्ध) एंडएमटी से संबंधित जीन का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter</td>
			<td>Pall Corporation, USA</td>
			<td>4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215; T4 DNA ligase buffer</td>
			<td>Thermofisher Scientific, USA</td>
			<td>B69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm round glass slice</td>
			<td>Knittel Glass,Germany</td>
			<td>VD10012Y1A.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>BD Eclipse, USA</td>
			<td>300629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Vector Laboratories, USA</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>VECTASHIELD Antifade&#160;Mounting Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AA19_PLKO vector</td>
			<td>Dr. M Gon&#231;alves, Leiden University Medical Center, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Serva Electrophoresis, USA</td>
			<td>1339903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG</td>
			<td>GE Healthcare, USA</td>
			<td>NA931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Cell signaling, USA</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11388991001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer O (10X)</td>
			<td>Thermofisher Scientific, USA</td>
			<td>BO5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BveI (Bspm1)</td>
			<td>Thermofisher Scientific, USA</td>
			<td>ER 1741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>&#160;Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat Alexa 488</td>
			<td>&#160;Invitrogen, USA</td>
			<td>A21208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>&#160;Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>&#160;Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa 594</td>
			<td>&#160;Invitrogen,USA</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabNed Plasmid kit</td>
			<td>LabNed, USA</td>
			<td>LN2400004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-1 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>HEMA, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Transparent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam-1 antibody</td>
			<td>&#160;Becton Dickinson,USA</td>
			<td>553370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences, USA</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLV-Cas9 plasmid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>Cas9BST-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>P9620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen, Germany</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sm22a antibody</td>
			<td>&#160;Abcam, UK</td>
			<td>ab14106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snail</td>
			<td>Cell signaling, USA</td>
			<td>3879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermofisher Scientific, USA</td>
			<td>EL 0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TGF-&#946;2</td>
			<td>Joachim Nickel, University of Wurzburg</td>
			<td>Gift</td>
			<td>Other commercial recommendation: 302-B2, R&#38;D systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>1086031000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris Bioscience, UK</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11814273001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tgf-&#946;-mediated endothelial to mesenchymal transition (endmt) and the functional assessment of endmt effectors using crispr/cas9 gene editing

विशिष्ट बाहरी संकेतों और कुछ ट्रांसक्रिप्शन कारकों की सक्रियता के जवाब में, एंडोथेलियल कोशिकाएं एक मेसेंचिमल जैसे फेनोटाइप में अंतर कर सकती हैं, एक प्रक्रिया जिसे मेसेंचिमल संक्रमण (एंडएमटी) के लिए एंडोथेलियल कहा जाता है। उभरते परिणामों ने सुझाव दिया है कि एंडएमटी फाइब्रोसिस और कैंसर जैसे कई मानव रोगों से जुड़ा हुआ है। इसके अलावा, एंडोथेलियल-व्युत्पन्न मेसेंचिमल कोशिकाओं को ऊतक पुनर्जनन प्रक्रियाओं में लागू किया जा सकता है, क्योंकि उन्हें विभिन्न कोशिका प्रकारों (जैसे, ऑस्टियोब्लास्ट और कोंड्रोसाइट्स) में और अलग किया जा सकता है। इस प्रकार, एंडएमटी के चयनात्मक हेरफेर में नैदानिक क्षमता हो सकती है। एपिथेलियल-मेसेंचिमल ट्रांजिशन (ईएमटी) की तरह, एंडएमटी को स्रावित साइटोकिन ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर-बीटा (टीजीएफ-β) द्वारा दृढ़ता से प्रेरित किया जा सकता है, जो घोंघा और स्लग सहित तथाकथित एंडएमटी ट्रांसक्रिप्शन कारकों (एंडएमटी-टीएफ) की अभिव्यक्ति को उत्तेजित करता है। ये एंडएमटी-टीएफ क्रमशः मेसेंचिमल और एंडोथेलियल प्रोटीन के स्तर को बढ़ाते हैं। यहां, हम टीजीएफ-β-प्रेरित एंडएमटी इन विट्रो की जांच करने के तरीकों का वर्णन करते हैं, जिसमें टीजीएफ-β-प्रेरित एंडएमटी में विशेष टीएफएस की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल है। इन तकनीकों का उपयोग करके, हम इस बात का सबूत देते हैं कि टीजीएफ-ए2 मुरीन अग्नाशय माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एमएस-1 कोशिकाओं) में एंडएमटी को उत्तेजित करता है, और यह कि संकुल का उपयोग करके घोंघा की आनुवंशिक कमी नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स (CRISPR) / CRISPR-संबद्ध प्रोटीन 9 (Cas9) -मध्यस्थता जीन संपादन, इस घटना को निरस्त करती है। यह दृष्टिकोण एंडोथेलियल जीव विज्ञान के संभावित मॉड्यूलर से पूछताछ करने के लिए एक मॉडल के रूप में काम कर सकता है, और मानव रोग में संभावित अनुप्रयोग के साथ, एंडएमटी के उपन्यास नियामकों की पहचान करने के लिए आनुवंशिक या औषधीय स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

TGF-12 EndMT लाती है और एमएस-1 एंडोथेलियल कोशिकाओं में घोंघा अभिव्यक्ति को उत्तेजित करता है टीजीएफ-β एंडएमटी को प्रेरित करने की सबसे बड़ी क्षमता के साथ साइटोकिन्स में से एक है। 3 दिनों के लिए TGF-ο2 (1 एनजी/एमएल) के साथ एमएस-1 कोशिकाओं के इलाज के बाद, एंडोथेलियल एमएस-1 कोशिकाओं को अपने कोबलस्टोन की तरह संरचना खो देते है और धुरी के आकार का mesenchymal की तरह कोशिकाओं में अंतर(चित्रा 1A)15। सेल फेनोटाइपिक परिवर्तनों को प्रेरित करने में TGF-ο2 की भूमिका को और सत्यापित करने के लिए, हमने टीजीएफ-2 उत्तेजना19से पहले छोटे अणु एक्टिविन रिसेप्टर-जैसे किनेज (ALK) 4/ALK5/ALK7 अवरोधक SB431542 के साथ कोशिकाओं का पूर्व-इलाज किया । SB431542 पूरी तरह से tGF-ο2-प्रेरित सेल आकृति विज्ञान परिवर्तन(चित्रा 1A)को निरस्त कर दिया। टीएमटीएस-2 प्रेरित एंडएमटी प्रक्रिया को एंडएमटी से संबंधित मार्कर की अभिव्यक्ति में परिवर्तनों का अध्ययन करके आगे की जांच की गई। जैसा कि चित्रा 1 Bमें दिखाया गया है, टीजीएफ-ए2 उत्तेजना के बाद एंडोथेलियल प्रोटीन पेकैम-1 में शक्तिशाली रूप से कमी आई थी, जबकि मेसेंचिमल कारक Sm22α को टीजीएफ-215द्वारा गहराई से उपनियमित किया गया था। ये डेटा इस धारणा के अनुरूप हैं कि TGF-12 ने एमएस-1 कोशिकाओं में एंडएमटी को ट्रिगर किया। इसके बाद, हमने घोंघा और स्लग अभिव्यक्ति पर टीजीएफ-2 के प्रभावों की जांच की। जैसा कि चित्रा 1Cमें दिखाया गया है, घोंघा को टीजीएफ-ए2 द्वारा स्पष्ट रूप से बढ़ाया गया था, जबकि स्लग अभिव्यक्ति एमएस-1 कोशिकाओं15में टीजीएफ-ए2 से प्रभावित नहीं थी। तीन स्वतंत्र प्रयोगों से घोंघा अभिव्यक्ति का मात्राकरण चित्र 1 डीमें दिखाया गया है ।
 एमएस-1 एंडोथेलियल कोशिकाओं में CRISPR/Cas9 द्वारा घोंघा की कमी के रूप में घोंघा TGF-12 द्वारा प्रेरित किया गया था और संभावना TGF-12 मध्यस्थता EndMT में शामिल है, हम CRISPR/Cas9 जीन संपादन का प्रदर्शन किया आनुवंशिक रूप से एमएस-1 कोशिकाओं में घोंघा अभिव्यक्ति समाप्त । हमने परिकल्पना की है कि घोंघा की कमी TGF-12-प्रेरित EndMT को बाधित करने के लिए पर्याप्त होगा । जैसा कि चित्रा 2 एमें दिखाया गया है, हमने दो चरणों में घोंघा नॉकआउट कोशिकाओं को उत्पन्न किया। सबसे पहले, Cas9 को एक Cas9 व्यक्त लेंटीवायरस के साथ एमएस-1 कोशिकाओं को संक्रमित करके व्यक्त किया गया था। चूंकि पीएलवी-Cas9 निर्माण में ब्लास्टिसिडिन प्रतिरोध कैसेट है, इसलिए हमने ब्लास्टिसिडिन प्रतिरोधी कोशिकाओं(चित्रा 2डी)में पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा Cas9 की अभिव्यक्ति की जांच की। इसके बाद, हमने एसजीआरएन की शुरुआत की जिसने विशेष रूप से घोंघा को अपनी प्रोटीन अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए लक्षित किया । यह प्रक्रिया एए 19 पीएलको.1-घोंघा-एसजीआरएनए निर्माण को ले जाने वाले लेंटीवायरल कणों के साथ संक्रमण द्वारा भी की गई थी, जिसमें एक प्यूरोमाइसिन अभिव्यक्ति कैसेट शामिल है। Cas9-एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं को फिर से जीएनए से संक्रमित किया गया था जिसमें लेंटीवायरस होता था और आगे प्यूरोमाइसिन के साथ चुना जाता था। मुरीन घोंघा को लक्षित करने वाले दो पूरक sgRNA ओलिगोस को अनुमानित कम ऑफ-टारगेट गतिविधि(चित्रा 2बी, सी)के साथ डिजाइन किया गया था। एमएस-1 कोशिकाओं को व्यक्त करते हुए Cas9 में दो स्वतंत्र घोंघा sgRNAs शुरू करने के बाद, घोंघा प्रोटीन अभिव्यक्ति(चित्रा 2D)15निरस्त किया गया था ।
घोंघा की कमी एमएस-1 कोशिकाओं में TGF-12-प्रेरित EndMT रोकता है TGF-12-मध्यस्थता EndMT में घोंघा के समारोह का प्रदर्शन करने के लिए, हम घोंघा समाप्त कोशिकाओं में एक EndMT परख प्रदर्शन किया और यह माता पिता के एमएस-1 कोशिकाओं के साथ तुलना में । जैसा कि चित्रा 3 एमें दिखाया गया है, घोंघा का नॉकआउट एमएस-1 कोशिकाओं15में टीजीएफ-ए2 द्वारा संचालित फाइब्रोब्लास्ट जैसी सेल आकृति विज्ञान को बाधित करने के लिए पर्याप्त था। इसके अलावा, पेकैम-1 में टीजीएफ-ए2-मध्यस्थता गिरावट और Sm22α की वृद्धि पूरी तरह से घोंघा-समाप्त एमएस-1 कोशिकाओं में अवरुद्ध हो गई थी। संक्षेप में, हमने दिखा दिया कि एमएस-1 कोशिकाओं(चित्रा 3B)15में टीजीएफ-2-मध्यस्थता एंडएमटी के लिए घोंघा महत्वपूर्ण है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62198/62198fig1v2.jpg"> चित्रा 1। TGF-12 एमएस-1 कोशिकाओं में EndMT और घोंघा अभिव्यक्ति लाती है। A. सेल आकृति विज्ञान पर टीजीएफ-ए2 और/या टीजीएफ-β प्रकार आई रिसेप्टर किनेज़ अवरोधक एसबी-४३१५४२ के प्रभाव । TGF-1 ng/mL) और/या एसबी-431542 (एसबी, 5 माइक्रोन, TGF-ο2 से पहले 30 मिनट प्रशासित) के साथ उपचार पर एमएस-1 कोशिकाओं के ब्राइटफील्ड छवियों 2 दिनों के लिए । स्केल बार 200 माइक्रोन बी का प्रतिनिधित्व करता है। एमएस-1 कोशिकाओं में पेकैम-1 (हरा) और Sm22α (लाल) का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला 3 दिनों के लिए टीजीएफ-12 (1 एनजी/एमएल) युक्त मध्यम में सुसंस्कृत। नाभिक नीले रंग (DAPI) में कल्पना कर रहे हैं। स्केल बार: 50 माइक्रोन सी पश्चिमी दाग के साथ पूरे सेल lysate TGF-1 2 उत्तेजित एमएस-1 कोशिकाओं। घोंघा की अभिव्यक्ति, लेकिन स्लग नहीं, TGF-12 उत्तेजना द्वारा बढ़ाया गया था, जैसा कि पहले एमए एट अल15में रिपोर्ट किया गया था। डी. तीन स्वतंत्र पश्चिमी दाग प्रयोगों से परिणामों को एकीकृत करके घोंघा अभिव्यक्ति का मात्राकरण। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62198/62198fig1v2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62198/62198fig2v2.jpg"> चित्रा 2। CRISPR-Cas9 जीन संपादन द्वारा घोंघा की कमी। A. घोंघा नॉकआउट कोशिकाओं को उत्पन्न करने के तरीके को दर्शाती योजना। बीएसडी: ब्लास्टिसिडिन। पुरो: प्यूरोसिन। B. दो स्वतंत्र sgRNAs के ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स ने चोपचओपी (http://chopchop.cbu.uib.no/) और कैस-ओफइंडर (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) का उपयोग करके घोंघा को लक्षित किया । सी. कैस-ओफ़इंडर (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) का उपयोग करके घोंघा के लिए दो जीआरएएनए की भविष्यवाणी की गई ऑफ-टारगेट गतिविधि। डी. जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) और Cas9-overexpressed एमएस-1 में Cas9 और घोंघा अभिव्यक्ति पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा मापा । ई. एमएस-1 कोशिकाओं में दो स्वतंत्र gRNAs के साथ घोंघा के नॉकआउट के रूप में पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा मापा । हम एमए एट अल15में इसी तरह के परिणाम की सूचना दी । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62198/62198fig2v2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62198/62198fig3v2.jpg"> चित्रा 3। घोंघा की आनुवंशिक कमी एमएस-1 कोशिकाओं में TGF-1-प्रेरित EndMT रोकता है । A. वाइल्डटाइप (डब्ल्यूटीई, अपर पैनल) और घोंघा (लोअर पैनल) कोशिकाओं में 3 दिनों के लिए TGF-1 (0.1 एनजी/एमएल) के साथ उपचार पर एमएस-1 कोशिकाओं की ब्राइटफील्ड छवियां। स्केल बार 3 दिनों के लिए टीजीएफ-ए2 (1 एनजी/एमएल) युक्त मध्यम में सुसंस्कृत एमएस-1 कोशिकाओं के पेकैम-1 (हरे), Sm22α (लाल) और नाभिक (नीला) के लिए 200 μm. बी इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला का प्रतिनिधित्व करता है। पेकैम-1 की घोंघा की कमी TGF-12-प्रेरित कमी और Sm22α अभिव्यक्ति की वृद्धि। स्केल बार एमएस-1 कोशिकाओं में टीजीएफ-β-प्रेरित एंडएमटी पर घोंघा नॉकआउट के प्रभाव का 50 माइक्रोन सी योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व का प्रतिनिधित्व करता है। टीजीएफ-β स्माड पाथवे के माध्यम से फॉस्फोरीटिंग Smad2/3 द्वारा घोंघा की अभिव्यक्ति को उत्तेजित करता है और आगे EndMT ड्राइव करता है। CRISPR/Cas9 आधारित जीन संपादन abrogated TGF-β-मध्यस्थता EndMT का उपयोग कर घोंघा दस्तक । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62198/62198fig3v2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

Watch this Scientific Journal Video about TGF-ÃŽÂ²-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing at JoVE.com

TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

हम कोशिका आकृति विज्ञान परिवर्तन देख कर एंडोथेलियल कोशिकाओं में TGF-12-प्रेरित EndMT की जांच करने और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला का उपयोग कर अभिव्यक्ति EndMT से संबंधित मार्कर परिवर्तन की जांच करने के तरीकों का वर्णन करते हैं । CRISPR/Cas9 जीन संपादन का वर्णन किया गया था और टीजीएफ-ο2-प्रेरित EndMT में अपनी भूमिका की जांच करने के लिए जीन एन्कोडिंग घोंघा को कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

टीजीएफ-β-मध्यस्थता एंडोथेलियल से मेसेंचिमल ट्रांजिशन (एंडएमटी) और CRISPR/Cas9 जीन संपादन का उपयोग करके एंडएमटी प्रभावकर्ताओं का कार्यात्मक मूल्यांकन

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

एंडोथेलियल टू मेसेंचिमल संक्रमण एक सेलुलर प्रक्रिया है जिसमें एंडोथेलियल कोशिकाएं अपने कोबलस्टोन आकृति विज्ञान को फाइब्रोब्लास्ट जैसे फेनोटाइप में बदल देती हैं। और साइटोकिन टीजीएफ-बीटा, विकास कारक बीटा को बदलना, इस संक्रमण का एक मुख्य चालक है। सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन और एंडोथेलियल और मेसेंचिमल मार्कर के अभिव्यक्ति के स्तर का विश्लेषण हमें मेसेंचिमल संक्रमण के लिए एंडोथेलियल की घटना का आकलन करने की अनुमति देता है।उभरते हुए डेटा कैंसर, हृदय रोग और फाइब्रोसिस सहित विभिन्न रोगों के लिए एंडोथेलियल को मेसेंचिमल संक्रमण प्रक्रिया से जोड़ते हैं। और आंकड़ों से पता चलता है कि हस्तक्षेप चिकित्सकीय लाभ का हो सकता है । भ्रूणजन्म और अंग विकास के दौरान होने वाली मेसेंचिमल संक्रमण प्रक्रिया के लिए एंडोथेलियल को उत्तेजित करके, हम संभवतः उपास्थि, हड्डी और मांसपेशियों जैसे मेसेंचिमल-व्युत्पन्न ऊतकों को पुनर्जीवित करने में सक्षम हो सकते हैं।इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा इंट्रासेलुलर प्रोटीन का पता लगाने के लिए, 0.1% ट्राइटन एक्स-100 का उपयोग करके सेल पारमेबिलाइजेशन एंटीबॉडी को कोशिका झिल्ली के माध्यम से पारित करने की अनुमति देने के लिए आवश्यक है। इस वीडियो प्रदर्शन के साथ, शोधकर्ताओं को इस बात की अच्छी समझ मिलेगी कि एंडोथेलियल में टीजीएफ-बीटा जैसे साइटोकिन्स की भूमिका की जांच कैसे की जाए। सबसे पहले, बीज 1 x 10 ^ डीएमईएम में अग्नाशय आइलेट एंडोथेलियल एमएस1 कोशिकाओं को 0.1% जिलेटिन-लेपित संस्कृति प्लेट पर पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 10% एफबीएस और 100 इकाइयों प्रति मिलीलीटर के साथ पूरक किया गया।सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेशन के बाद, 0.25% ट्राइप्सिन के दो मिलीलीटर, 0.02% ईडीटीए समाधान के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर दो मिनट के लिए इलाज करने से पहले पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं। जब कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू कर दिया है, पूर्ण संस्कृति माध्यम के पांच मिलीलीटर के साथ प्रतिक्रिया बुझाने और अपकेंद्रित्र के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए जिसके परिणामस्वरूप सेल निलंबन हस्तांतरण । मतगणना के लिए नए सिरे से पूर्ण माध्यम के चार मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें।और बीज 1 X 10 ^ 3 कोशिकाओं प्रति घन सेंटीमीटर एक नई सेल संस्कृति कंटेनर में । रातोंरात संस्कृति के बाद, पांच माइक्रोमोलर टीजीएफ-बीटा रिसेप्टर किनेस अवरोधक एसबी-431542 और डीएमएसओ सॉल्वेंट नियंत्रण वाले दो कुओं के साथ दो कुओं का इलाज करें। और कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।इनक्यूबेशन के अंत में, वाहन नियंत्रण के साथ दो कुओं और टीजीएफ-बीटा 2 के साथ दो कुओं का इलाज करें। तीन दिनों के बाद, ब्राइटफील्ड इमेजिंग के तहत प्रत्येक सेल उपचार समूह के सेल आकृति विज्ञान की जांच करने के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। इम्यूनोफ्लोर्सेंट धुंधला द्वारा एंडएमटी से संबंधित मार्कर परिवर्तनों का आकलन करने के लिए, कोशिकाओं को एक उपयुक्त MS1 सेल संस्कृति से अलग करें, जैसा कि प्रदर्शन किया गया है।और एक 1.9 X 10 ^ 3 कोशिकाओं पर एकाग्रता पर कोशिकाओं बीज ०.१% जिलेटिन पर लेपित 12 मिलीमीटर गोल कवर चश्मे एक 24 अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं के भीतर रखा । रातोंरात संस्कृति के बाद, तीन दिनों के लिए टीजीएफ-बीटा 2 के एक नैनोग्राम मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं का इलाज करें। इनक्यूबेशन के अंत में, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4% फॉर्मलडिहाइड प्रति अच्छी तरह से 300 माइक्रोलीटर के साथ इलाज संस्कृतियों को ठीक करें।निर्धारण के अंत में, कोशिकाओं को पीबीएस के साथ तीन बार धोएं, ०.१% ट्राइटन एक्स-१०० के ३०० माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को पार करने से पहले और पीबीएस प्रति अच्छी तरह से कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए । इनक्यूबेशन के अंत में, पीबीएस में कोशिकाओं को तीन बार धोएं और पीबीएस में 3% बीएसए के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक करें। कमरे के तापमान पर ४५ मिनट के बाद, कमरे के तापमान पर ४५ मिनट के लिए प्राथमिक PECAM-1 और SM22-अल्फा एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं लेबल, PBS में तीन वॉश के बाद ।अंतिम धोने के बाद, कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, और कोशिकाओं को एक DAPI-पूरक बढ़ते माध्यम और एक कवर पर्ची के साथ कोशिकाओं को बढ़ते से पहले पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। फिर स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवर स्लिप के किनारों को सील करें और मानक इमेजिंग प्रोटोकॉल के अनुसार उपयुक्त फिल्टर का उपयोग करके फ्लोरेसेंस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल मार्कर अभिव्यक्ति को चित्रित करें। टीजीएफ-बीटा 2 के साथ तीन दिनों के उपचार के बाद, एंडोथेलियल एमएस1 कोशिकाएं अपनी कोबलस्टोन जैसी संरचना खो देती हैं और धुरी के आकार की मेसेन्चिमल जैसी कोशिकाओं में अंतर करती हैं।यह टीजीएफ-बीटा 2 प्रेरित भेदभाव तब दबाया जाता है जब कोशिकाओं को टीजीएफ-बीटा रिसेप्टर किनेस अवरोधक एसबी-431542 के संपर्क में आता है। टीजीएफ-बीटा 2 उत्तेजना के बाद एंडोथेलियल प्रोटीन पेकैम-1 की अभिव्यक्ति में मजबूती से कमी आई है जबकि मेसेंचिमल फैक्टर एसएम-22 अल्फा गहराई से अपनाइज्ड है । इसके अलावा, घोंघा स्पष्ट रूप से टीजीएफ-बीटा 2 एक्सपोजर द्वारा उपनियमित है जबकि स्लग अभिव्यक्ति प्रभावित नहीं होती है।जैसा कि देखा गया CRISPR-Cas9 जीन संपादन का उपयोग घोंघा अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए Cas9-एक्सप्रेस एमएस1 कोशिकाओं में दो स्वतंत्र घोंघा एकल गाइड आरएनए की शुरूआत को सुविधाजनक बनाने के लिए किया जा सकता है। घोंघा के नॉकआउट MS1 कोशिकाओं में TGF-बीटा 2 द्वारा संचालित फाइब्रोब्लास्ट की तरह सेल आकृति विज्ञान को बाधित करने के लिए और TGF-बीटा 2 मध्यस्थता PECAM-1 गिरावट और एसएम-22 अल्फा वृद्धि ब्लॉक करने के लिए पर्याप्त है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा एंडोथेलियल और मेसेंचिमल मार्कर की सेल आकृति विज्ञान और अभिव्यक्ति में परिवर्तन के आकलन को पश्चिमी दाग विश्लेषण में मात्रात्मक पीसीआर पर इन मार्कर की अभिव्यक्ति को मापकर और मान्य किया जा सकता है।मेसेंचिमल संक्रमण के लिए एंडोथेलियल का पता लगाने के लिए इस तकनीक ने शोधकर्ताओं को एक शारीरिक प्रक्रिया के रूप में इस उभरते महत्व की जांच करने की अनुमति दी है जो कई बीमारियों में होती है।

Research

JoVE Journal

Biology

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

Light/dark Transition Test for Mice

/ प्रकाश अंधेरे चूहे के लिए संक्रमण टेस्ट

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Mesenchymal संक्रमण के लिए प्रेरण और उपकला का विश्लेषण

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

उपकला-Mesenchymal संक्रमण के दौरान वैकल्पिक Splicing की जांच

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

जीन सेट संवर्धन विश्लेषण का उपयोग करने के लिए अनुवाद अनुसंधान के लिए उपयुक्त पशु मॉडल की पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

मछली शुक्राणु मूल्यांकन सॉफ्टवेयर और शीतलक उपकरणों का उपयोग

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Signaling

Endothelial-mesenchymal संक्रमण के आणविक विश्लेषण विकास कारक बदलने से प्रेरित-β संकेतन

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

स्पार्क को सिलिंग: कमजोर इलेक्ट्रिक मछली में CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 का उपयोग करके नल उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए क्यूलेक्स मच्छरों के भ्रूण तैयार करना और इंजेक्शन लगाना

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 का उपयोग कर प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं के जीनोम इंजीनियरिंग

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

नासोनिया विट्रिपेनिस में आरएनएआई और CRISPR जीन संपादन के लिए पुपल और वयस्क इंजेक्शन

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...