Name: tgf-&#946;-mediated endothelial to mesenchymal transition (endmt) and the functional assessment of endmt effectors using crispr/cas9 gene editing
Uploaded: 2021-02-26T14:00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about TGF-ÃŽÂ²-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing at JoVE.com

Forskningen stöddes av CGC.NL och Nederländerna Cardio Vascular Research Initiative: Dutch Heart Foundation, Dutch Federation of University Medical Centers, Nederländerna Organization for Health Research and Development och Royal Netherlands Academy of Sciences Grant som tilldelades Phaedra-Impact (http://www.phaedraresearch.nl). JM stöds av Kinas stipendieråd. GSD stöds av ett trampolinbidrag från AFM-Telethon [22379], FOP Italia och ett bidrag från La Fundació La Marató de TV3 (#202038).

1. Induktion av EndMT av TGF-β2
<ol><li>MS-1 celler i Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) som innehåller 10% fetala nötkreatur serum (FBS) och 100 U/mL penicillin/streptomycin i en inkubator (5% CO2,37 °C). Täck alla kulturrätter/tallrikar med 0,1% w/v gelatin i 10 min före användning.</li>
	<li>Tvätta försiktigt MS-1-celler med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), tillsätt 2 ml trypsin-EDTA-lösning (0,25% trypsin och 0,02% EDTA) till en 10 cm skål och inkubera i 2 min vid 37 °C för att lossa dem. Tillsätt därefter 5 ml komplett odlingsmedium för att släcka reaktionen.</li>
	<li>Överför cellfjädringen till ett 15 ml-rör och centrifugera vid 200 x g i 3 minuter vid rumstemperatur.</li>
	<li>Kassera supernatanten och återanvänd cellerna i 4 ml färskt medium som innehåller FBS och penicillin/streptomycin. Räkna cellerna med hjälp av en automatisk cellräknare.</li>
	<li>Frö 1 x 103 celler per cm2 för vidare odling. Till exempel frö 9,5 x 103 celler /brunn för 6-brunnsplattor, eller 1,9 x 103 celler /brunn för 24-brunnsplattor.</li>
	<li>Inkubera cellerna över natten så att de kan klibba och återhämta sig och stimulera sedan MS-1-celler med TGF-β2 i 3 dagar. Tillsätt TGF-β receptorkinahämmare SB431542 (5 μM) 30 min före STIMULERING AV TGF-β2. Behandla andra celler med fordon (DMSO). OBS: Lös upp TGF-β2 i 4 mM HCl som innehåller 0, 1% humant bovint serumalbumin (BSA). Lägg till samma mängd ligandbuffert utan TGF-β2 i kontrollgruppen. TGF-β2-koncentrationen kan anpassas till 0,1-1 ng/ml för specifika analyser. Se indikationer i motsvarande siffror.</li>
	<li>Efter 3 dagar, undersöka cell morfologi med ljusa fältet imaging (med ett inverterat mikroskop) och utföra immunofluorescens färgning (se steg 2) för att bedöma EndMT-relaterade markör ändringar. Utför minst tre oberoende experiment för att erhålla biologiska triplicater.</li>
</ol>2. Immunofluorescens färgning
<ol><li>Trypsinize odlade MS-1 celler (steg 1.2) och sedan återförslutna 1,9 x 103 celler på en 0,1% w/ v gelatinbelagd 12 mm rund täckglas placerad på botten av en 24-brunnsplatta.</li>
	<li>Efter odling av cellerna över natten, tillsätt TGF-β2 (slutlig koncentration 1 ng/ml) till cellerna i 3 dagar. Använd medium innehållande ligandbuffert som negativ kontroll.</li>
	<li>Utför Pecam-1 och Sm22α färgning.<ol>
<li>Efter att ha stimulerat cellerna med TGF-β2 (eller Control) i 3 dagar, ta bort mediet och tvätta cellerna med 1x PBS.</li>
		<li>Tillsätt 300 μL 4% formaldehyd till varje brunn och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur för att fixa cellerna. Tvätta 3x med 1x PBS efter inkubation.</li>
		<li>Tillsätt 300 μL 0,1% Triton X-100 i 1x PBS till varje brunn och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur för att permeabilisera cellerna. Efter inkubation, ta bort Triton X-100-lösningen och tvätta cellerna 3x med 1x PBS.</li>
		<li>Blockera cellerna med 3% bovint serumalbumin (BSA) i 1x PBS i 45 min vid rumstemperatur.</li>
		<li>Späd ut de primära Pecam-1- och Sm22α-antikropparna som känner igen murinproteiner 1:500 med 1x PBS. Inkubera sedan de fasta cellerna med primära antikroppar i 45 minuter vid rumstemperatur.</li>
		<li>Efter tvättning 3x med 1x PBS, inkubera cellerna med 1000x utspädda sekundära antikroppar, inklusive åsneantiråtta Alexa 488 och getantikanin Alexa 594, i 45 min vid rumstemperatur. OBS: Skydda proverna från ljus vid färgning.</li>
		<li>Efter sköljning 3x med 1x PBS, placera täckglaset såtat med celler med ansiktet nedåt på en droppe monteringsmedium som innehåller 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) på en glid för att måla kärnorna.</li>
		<li>Fixera täckglasets periferi med transparent nagellack och förvara det vid 4 °C.</li>
		<li>Skaffa representativa bilder med ett konfokalt mikroskop. Ställ in laservåglängderna på 405 nm, 488 nm respektive 552 nm för att upptäcka DAPI, Pecam-1 respektive Sm22α. För varje kanal togs alla bilder med samma inställningar och exponeringstid. Utför minst tre oberoende experiment för att erhålla biologiska triplicater.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Knock out of Snail med CRISPR / Cas9 redigering
<ol><li>Designa två oberoende sgRNAs som riktar sig mot murin Snail.<ol>
<li>Designa sgRNAs med hjälp av onlineverktygen CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/) och Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) enligt det riktade gennamnet och arten.</li>
		<li>Förutsäg aktiviteten utanför målet för de designade sgRNAs som riktar sig till Snail med två oberoende algoritmer, inklusive Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) och CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/).</li>
		<li>Välj två sgRNAs med den lägsta off-activity. Designa två kompletterande sgRNA oligos med BveI-skärplatsen. Sense oligo börjar med 5 '-ACCG-3' och antisense oligo börjar med 5'-AAAC-3'.</li>
		<li>Beordra att oligos syntetiseras kommersiellt för vidare användning.</li>
	</ol></li>
	<li>Klona den kompletterande guiden RNA oligos till BveI-smälta AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. Bve (bve) I-stuffer Lentiviral vektor plasmid att genereraAA19 pLKO.1-Snail-sgRNA16.<ol>
<li>Klipp AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. Bve (bve) I-stuffer plasmid med BveI enzym16. Blanda 2 μg AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. Bve (bve) I-stuffer plasmid, 5 μL 10x Buffer O och 5 μL BveI enzym och tillsätt sterilt vatten för att nå en total volym på 50 μL.</li>
		<li>Vortex och snurra kort ner reaktionsmixen. Inkubera reaktionen vid 37 °C i 1 timme.</li>
		<li>Ladda reaktionsblandningen på en 1% agarosgel och kör i 1x Tris-acetat-EDTA (TAE, 50x TAE-bestånd: 242 g Tris-bas upplöst i vatten, 57,1 ml glacial ättiksyra, 100 ml 500 mM EDTA-lösning (pH 8,0) och tillsätt vatten till totalt 1 L) buffert tills en bra separation uppnås.</li>
		<li>Skär ryggradsfragmentet från gelén, isolera det med ett gelextraktionskit enligt tillverkarens protokoll (se materialförteckningen)och eluera ryggraden i 40 μL elueringsbuffert (EB).</li>
		<li>Blanda 5 μL 100 pmol/μL sense oligo och 5 μL 100 pmol/μL antisense oligo med 1 μL 1 M Tris-HCl (pH 8.0) och tillsätt sterilt vatten för att nå totalt 100 μL för att glödgning av gRNA oligos. Inkubera blandningen i 5 min vid 100 °C och täck sedan rören med aluminiumfolie. Därefter kyler du långsamt lösningen till rumstemperatur för vidare användning som insats.</li>
		<li>Att ligate den kompletterande gRNA oligos och BveI-smälta ryggraden, blanda 1 μL isolerat BveI-skär AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA.BveI-stuffer ryggrad och 2 μL skär (utspädd 1:300) med 2 μL 10x T4 DNA-ligasbuffert och 1 μL T4 DNA-ligas, och tillsätt sterilt vatten för att nå totalt 20 μL. Snurra kort röret och inkubera det i 4 timmar vid rumstemperatur för vidare användning. Obs: När du utför ligaturen, se till att två kontrollgrupper ingår. För en kontrollgrupp, blanda 1 μL isolerat ryggrad, 2 μL 10x T4 DNA-ligasbuffert och 1 μL T4 DNA-ligas och tillsätt sterilt vatten för att nå totalt 20 μL, men utan oligo-DNA. För den andra kontrollgruppen, blanda 1 μL isolerat ryggrad och 2 μL 10x T4 DNA-ligasbuffert och tillsätt sterilt vatten för att nå totalt 20 μL, men utan glödgade oligos och T4 ligase. Dessa två kontroll ligationer används för att bestämma reaktions bakgrunden i nästa omvandlings steg och ange hur effektiv ligaturen är.</li>
	</ol></li>
	<li>Omvandla reaktionsblandningen till kompetent TOP10 E. coli.<ol>
<li>Samla in kompetent TOP10 E. coli. celler från frysen -80 °C och tina dem på is.</li>
		<li>Tillsätt 2 μL ligationsblandning till 50 μL kompetenta celler och håll röret på is i 30 minuter.</li>
		<li>Värmechocka röret vid 42 °C i 30 s. Lägg röret på is i 2 minuter.</li>
		<li>Tillsätt 950 μL färsk lysogent buljongmedel (LB) till blandningen och skaka kraftigt vid 37 °C i 60 min.</li>
		<li>Snurra ner och plätera cellerna på en varm ampicillin (100 μg/mL) motstånd LB-platta. Inkubera plattan vid 37 °C över natten.</li>
	</ol></li>
	<li>Kontrollera att gRNA-oligos har förs in framgångsrikt i plasmiden.<ol>
<li>Välj 3-5 kolonier på plattan i 1 ml ampicillin (100 μg/ml) som innehåller LB medium och skaka över natten vid 30 °C.</li>
		<li>Isolera plasmid-DNA:t med ett plasmidkit enligt tillverkarens protokoll (Table of Materials) och sekvensera det med U6-promotorprimerprimer 5'- GAGGGCCTATTTCCCATGATT -3' för att verifiera den framgångsrika införandet av gRNA-oligo.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Generera Snigel knockout MS-1 celler
<ol><li>Producera lentivirala partiklar som transporterar Cas9 eller Snigelinriktade gRNAs.<ol>
<li>Kultur HEK 293T celler i DMEM som innehåller 10% fetala nötkreatur serum och 100 U/mL penicillin/streptomycin i 14,5 cm rätter (eller T75 flaskor) i en inkubator (5% CO2,37 °C).</li>
		<li>Blanda 9,9 μg målgenplasmid, AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA eller pLV-Cas917 plasmid, tillsammans med hjälpplasmiderna 3,5 μg pCMV-VSVG (kodning av G-proteinet i vesikulärt stomatitvirus, VSV-G), 6,6 μg varvkänsligt element plasmid pMDLg-RRE (kodning Gag och Pol) och 5,0 μg pRSV-REV (kodning Rev) i 500 μL serumfritt medium. Återanvänd 50 μL polyetylnimin (PEI) (2,5 mg/ml) i 500 μL serumfritt medium. Blanda försiktigt plasmider och PEI-preparat genom att pipetting upp och ner. Inkubera blandningen i 20 minuter vid rumstemperatur.</li>
		<li>Transfekta HEK 293T celler genom att tillsätta blandningsmediet från steg 4,1,2 till 80% sammanflödesceller i 14,5 cm rätter (eller T75 flaskor) som innehåller DMEM medium med 10% FBS och 100 U/mL penicillin/streptomycin. HEK293T-celler används eftersom de lätt transfekteras och genererar höga nivåer av virus18.</li>
		<li>Överför transfected HEK 293T celler till en biosäkerhet i mikrobiologiska och biomedicinska laboratorium (BMBL) att odla dem i 24 h.</li>
		<li>I ett BMBL-laboratorium, ersätt transfectionmediet från HEK 293T-celler med 12 ml färsk komplett DMEM som innehåller FBS och penicillin/streptomycin. Inkubera cellerna i 24 timmar.</li>
		<li>Samla upp och filtrera mediet med en 20 ml spruta och ett filter på 0,45 μm. Överför det konditionerade mediet till ett 15 ml polypropylenrör.</li>
		<li>Tillsätt 12 ml färsk komplett DMEM som innehåller FBS och penicillin/streptomycin till HEK 293T kulturrätt och kultur i ytterligare 24 timmar.</li>
		<li>Samla upp och filtrera mediet med en 20 ml spruta och ett filter på 0,45 μm. Överför det konditionerade mediet till ett 15 ml polypropylenrör. Förvara mediet som innehåller lentivirala partiklar som 1 ml alikvoter vid -80 °C för vidare användning.</li>
	</ol></li>
	<li>Infektera MS-1 celler med pLV-Cas9 virus.<ol>
<li>Frö 1 x 105 MS-1 celler per brunn i en 6-brunnsplatta i 24 timmar före lentivirusinfektion.</li>
		<li>Tina de frysta alikvoterna av pLV-Cas9-virus i ett 37 °C vattenbad.</li>
		<li>Blanda 1 ml virusmedium med 1 ml färskt DMEM-medium som innehåller FBS och penicillin/streptomycin. Tillsätt polybren till mediet (slutlig koncentration som 10 μg/ml) för att öka infektionseffektiviteten.</li>
		<li>Ta bort mediet från 6-brunnsplattan och ersätt det med virus/ polybrenblandningsmediet och odla cellerna i en inkubator i 24 timmar. OBS: Håll alltid en oinfekterad brunn som en kontrollgrupp.</li>
		<li>Aspirera mediet från den infekterade gruppen och kontrollgruppen och ersätt det med DMEM medium med 4 μg/ml blasticidin.</li>
		<li>Sätt tillbaka plattan på en inkubator på 37 °C och odla cellerna i 1 vecka. Oinfekterade celler kommer att dö på grund av effekten av blasticidin. Dela de överlevande cellerna när de når 80% cellkonfluens och fortsätt med blasticidinval.</li>
		<li>Bekräfta uttrycket av Cas9 i MS-1 celler genom western blotting med hjälp av en antikropp mot Cas9 (molekylvikten i Cas9 är cirka 160 kDa).</li>
	</ol></li>
	<li>Infektera pLV-Cas9 MS-1 celler separat med två oberoende gRNA lentivirus.<ol>
<li>Frö 1 x 105 pLV-Cas9 MS-1 celler per brunn i en 6-brunnsplatta i 24 timmar före infektion.</li>
		<li>Följ samma protokoll som beskrivs i 4.2 för att separat infektera celler med två gRNA lentivirus.</li>
		<li>Efter 24 h infektion med gRNA-viruset, uppdatera mediet och odla cellerna i ytterligare 24 h.</li>
		<li>Ersätt mediet med DMEM med 1 μg/ml puromycin. Sätt tillbaka plattan på en inkubator på 37 °C och odla cellerna i 1 vecka. Se till att de oinfekterade cellerna är helt döda. Dela cellerna när de når 80% confluency och fortsätt puromycin markering.</li>
		<li>Bekräfta knockouten av Snail i MS-1 celler genom western blotting med en antikropp mot Snail (snigelns molekylvikt är ungefär 35 kDa).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Ma, J., Sanchez-Duffhues, G., Goumans, M. -. J., Ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;-induced+endothelial+to+mesenchymal+transition+in+disease+and+tissue+engineering.">TGF-&#946;-induced endothelial to mesenchymal transition in disease and tissue engineering.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).</li><li>Piera-Velazquez, S., Jimenez, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+to+mesenchymal+transition:+role+in+physiology+and+in+the+pathogenesis+of+human+diseases.">Endothelial to mesenchymal transition: role in physiology and in the pathogenesis of human diseases.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1281-1324 (2019).</li><li>S&#225;nchez-Duffhues, G., de Vinuesa, G. A., ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cardiovascular+diseases:+developmental+signaling+pathways+gone+awry.">Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: developmental signaling pathways gone awry.</a> Developmental Dynamics. 247 (3), 492-508 (2018).</li><li>Evrard, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+to+mesenchymal+transition+is+common+in+atherosclerotic+lesions+and+is+associated+with+plaque+instability.">Endothelial to mesenchymal transition is common in atherosclerotic lesions and is associated with plaque instability.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-16 (2016).</li><li>Qiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fate+mapping+in+mice+with+pulmonary+hypertension.">Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension.</a> Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).</li><li>Zeisberg, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial-to-mesenchymal+transition+contributes+to+cardiac+fibrosis.">Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis.</a> Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).</li><li>Clere, N., Renault, S., Corre, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cancer.">Endothelial-to-mesenchymal transition in cancer.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).</li><li>Saito, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT+and+EndMT:+regulated+in+similar+ways.">EMT and EndMT: regulated in similar ways.</a> The Journal of Biochemistry. 153 (6), 493-495 (2013).</li><li>Bol&#243;s, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Slug+represses+E-cadherin+expression+and+induces+epithelial+to+mesenchymal+transitions:+a+comparison+with+Snail+and+E47+repressors.">The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors.</a> Journal of Cell Science. 116 (3), 499-511 (2003).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), 006429 (2012).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+definitions+for+research+on+epithelial-mesenchymal+transition.">Guidelines and definitions for research on epithelial-mesenchymal transition.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-12 (2020).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), (2014).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li><li>Arbiser, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+H-ras+stimulates+tumor+angiogenesis+by+two+distinct+pathways.">Oncogenic H-ras stimulates tumor angiogenesis by two distinct pathways.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 94 (3), 861-866 (1997).</li><li>MA, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-?-induced+endothelial+to+mesenchymal+transition+results+from+a+balance+between+SNAIL+and+ID+factors.">TGF-?-induced endothelial to mesenchymal transition results from a balance between SNAIL and ID factors.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 182 (9), (2021).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+impact+of+chromatin+conformation+on+genome+editing+tools.">Probing the impact of chromatin conformation on genome editing tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (13), 6482-6492 (2016).</li><li>Hunter, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+CRISPR+and+shRNA+screens+identify+involvement+of+mitochondrial+electron+transport+in+the+activation+of+evofosfamide.">Functional CRISPR and shRNA screens identify involvement of mitochondrial electron transport in the activation of evofosfamide.</a> Molecular Pharmacology. 95 (6), 638-651 (2019).</li><li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+mediate+long-term+and+high+efficiency+transgene+expression+in+HEK+293T+cells.">Lentiviral vectors mediate long-term and high efficiency transgene expression in HEK 293T cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 12 (5), 407 (2015).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deubiquitinase+activity+profiling+identifies+UCHL1+as+a+candidate+oncoprotein+that+promotes+TGF&#946;-induced+breast+cancer+metastasis.">Deubiquitinase activity profiling identifies UCHL1 as a candidate oncoprotein that promotes TGF&#946;-induced breast cancer metastasis.</a> Clinical Cancer Research. 26 (6), 1460-1473 (2020).</li><li>Medici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+vascular+endothelial+cells+into+multipotent+stem-like+cells.">Conversion of vascular endothelial cells into multipotent stem-like cells.</a> Nature Medicine. 16 (12), 1400 (2010).</li><li>Kokudo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snail+is+required+for+TGF&#946;-induced+endothelial-mesenchymal+transition+of+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells.">Snail is required for TGF&#946;-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells.</a> Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).</li><li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+analysis+unveils+a+prevalent+epithelial/mesenchymal+hybrid+state+during+mouse+organogenesis.">Single-cell RNA-seq analysis unveils a prevalent epithelial/mesenchymal hybrid state during mouse organogenesis.</a> Genome Biology. 19 (1), 1-20 (2018).</li><li>Oatley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+identifies+CD44+as+a+marker+and+regulator+of+endothelial+to+haematopoietic+transition.">Single-cell transcriptomics identifies CD44 as a marker and regulator of endothelial to haematopoietic transition.</a> Nature communications. 11 (1), 1-18 (2020).</li><li>Halaidych, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+responses+and+barrier+function+of+endothelial+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Inflammatory responses and barrier function of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1642-1656 (2018).</li><li>Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessing+endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cardiovascular+diseases.">Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases.</a> Nature Reviews Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Grav, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+triple+knockout+CHO+cell+lines+using+CRISPR/Cas9+and+fluorescent+enrichment.">One-step generation of triple knockout CHO cell lines using CRISPR/Cas9 and fluorescent enrichment.</a> Biotechnology Journal. 10 (9), 1446-1456 (2015).</li><li>Abudayyeh, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+targeting+with+CRISPR-Cas13.">RNA targeting with CRISPR-Cas13.</a> Nature. 550 (7675), 280-284 (2017).</li><li>Paddison, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+short+hairpin+RNAs+for+gene+knockdown+in+mammalian+cells.">Cloning of short hairpin RNAs for gene knockdown in mammalian cells.</a> Nature Methods. 1 (2), 163-167 (2004).</li><li>Reynolds, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+siRNA+design+for+RNA+interference.">Rational siRNA design for RNA interference.</a> Nature Biotechnology. 22 (3), 326-330 (2004).</li><li>Louren&#231;o, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP&#593;+is+crucial+determinant+of+epithelial+maintenance+by+preventing+epithelial-to-mesenchymal+transition.">C/EBP&#593; is crucial determinant of epithelial maintenance by preventing epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-18 (2020).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Att förstå mekanismen för EndMT är avgörande för att modulera denna process och rikta in sig på EndMT-relaterade sjukdomar. Här beskrev vi metoder för att utföra en TGF-β-inducerad EndMT-analys och förhöra rollen som EndMT-TF Snail i TGF-β-utlöst EndMT, genom att utföra CRISPR/ Cas9-medierad stabil genutarmning av snigel från celler. Utarmningen av snigel med CRISPR/Cas9-metoden har framgångsrikt upphävat TGF-β2-driven EndMT i MS-1-celler(figur 3C). För att studera effekterna av cytokiner, som TGF-β, på EndMT, exponerades ECs för cytokiner och sedan bedömdes förekomsten av EndMT enligt morfologiska förändringar och endotel- och mesenchymala marköruttrycksförändringar i celler. TGF-β2 starkt inducerad EndMT i MS-1 celler åtföljd av en stark ökning av uttrycket av transkription faktorn snigel. EndMT-TFs framkallas av TGF-β kan skilja sig åt beroende på arten eller vävnadsspecifika endotel celltyp. Till exempel observerade vi att Snail men inte Slug var signifikant uppreglerad av TGF-β i MS-1 celler, medan i mänskliga navelceller (HUVECs), både snigel och snigel ökas efter exponering för TGF-β20.
Vi bedömde omfattningen av EndMT-processen på två sätt genom att undersöka cellmorfologiförändringar och sedan genom att undersöka förändringar i EndMT-relaterade markörer uttryck. Efter TGF-β exponering i 3 dagar genomgick cellerna EndMT med konsekvent morfologiska variationer och förändringar i uttrycket av EndMT-relaterade markörer. Förutom immunofluorescensfärgningen vi utförde här, kan markörvariationer också övervakas genom western blotting på proteinuttrycksnivå eller av qRT-PCR (Realtid Quantitative Reverse Transcription PCR) på gennivåerna21. Utöver dessa två tids- och kostnadsbesparande metoder som vi visade i detta protokoll finns det andra metoder för att undersöka EndMT. Till exempel kan transkriptions- och mesenkymalrelaterade gener mellan behandlade och kontrollceller exakt bedöma EndMT22,23. Dessutom innebär EndMT ofta stabil förlust av barriärfunktion, vilket kan bedömas med impedansspektroskopi24. Dessutom kan ytterligare bevis på att EndMT-härledda celler har inlämnat stamcellsliknande egenskaper undersökas. Till exempel, under specifika odlingsförhållanden, EndMT mesenchymal-liknande celler kan ytterligare differentieras till osteoblaster, kondrocyter, adipocyter eller (myo)fibroblaster. Därför är ytterligare analys för att bekräfta differentiering i olika celltyper som tillhör mesoderm härstamningen (dvs. genuttryck och matrisfärgning) användbar för att visa den multipotenta karaktären hos EndMT-härledda celler. Slutligen är EndMT-bedömningsmetoderna inte begränsade till in vitro-studier, men kan extrapoleras för att undersöka sambandet mellan EndMT och vissa sjukdomar in vivo eller i ex vivo-organ. I den meningen utvidgas användningen av endotelspecifika härstamningsstrategier i stort sett till EndMT-relaterad forskning25.
För att undersöka rollen som Snail under EndMT användes i denna studie CRISPR/ Cas9 genredigering för att slå ut denna gen. Uppgifterna visade att TGF-β2 misslyckades med att medla EndMT i Snigelbrist MS-1 celler. Denna iakttagelse visade att snigel är avgörande för TGF-β2 inducerad EndMT i MS-1 celler. Vi använde en oberoende U6-driven sgRNA uttryck kassett för att införa specifika sgRNAs för Cas9 att rikta snigel. Utöver denna metod beskrev Ran et al.26 en annan strategi för kloning av sgRNA-oligossekvensen i Cas9-ställningen för att generera en konstruktion som innehåller både Cas9 och gRNAs. Nya nya tillvägagångssätt gör det möjligt för CRISPR/Cas att införliva ytterligare funktioner. Till exempel kan dubbla eller tredubbla knockouts uppnås genom att leverera fler sgRNAs till celler som uttrycker Cas927. Det konstruerade Cas13-proteinet riktar in sig på och smälter RNA-molekyler utan att störa endogent DNA28. Förutom att slå ut gener med CRISPR/Cas kan korta hårnåls-RNAs (shRNAs) användas som alternativ för att stabilt slå ner riktade genuttryck29. För alla CRISPR/Cas-genredigeringsmetoder bör klyvning utanför målet alltid beaktas. Dessutom tystar små störande RNAs (siRNAs) övergående genuttryck och siRNA-koncentrationen späds ut med celldelning30. Båda dessa metoder undertrycker delvis riktade genuttryck. Däremot används utomkvedshavandeskap också för att verifiera genfunktionen under EndMT/EMT31. Detta tillvägagångssätt kan avgöra om uppregleringen av en gen är tillräcklig för att framkalla ett EndMT-svar. Därför finns det för närvarande en mängd tekniska strategier som kan användas för att identifiera och verifiera potentiella tillsynsmyndigheter för EndMT. Dessutom kan transkriptionsanalys vara ett bra alternativ i identifiering och omfattande analys av EndMT-relaterade tillsynsmyndigheter. Vi rekommenderar att du använder olika kompletterande metoder för att undersöka modulering av EndMT.
Sammanfattningsvis introducerade vi ett arbetsflöde för att identifiera faktorer som kan spela funktionella roller under TGF-β-inducerad EndMT. Denna metod kan också användas för att studera om andra stimuli (dvs cytokiner, tillväxtfaktorer, mekaniska stimuli, cellcellsinteraktioner) kan modulera EndMT och samspelet mellan TGF-β med andra stimuli. Dessutom lyfte vi fram ett tillvägagångssätt med CRIPSR/Cas genredigering för att klargöra om en viss gen krävs för TGF-β-inducerad EndMT. För att illustrera denna metod använde vi den starka EndMT-induceraren TGF-β2 i MS-1-celler, men protokollen kan anpassas till andra cytokiner och andra celltyper. Vi förväntar oss att detta detaljerade protokoll som beskrivs kommer att fungera som en språngbräda för framtida EndMT-relaterade studier.

Endotel till mesenchymal övergång (EndMT) är ett multistep och dynamiskt biologiskt fenomen som har kopplats till olika fysiologiska och patologiskaprocesser 1,2. På EndMT endotelceller förlorar gradvis sina endotel egenskaper, samtidigt förvärva mesenchymala egenskaper3; således, tätt komprimerade och välorganiserade endotel celler skiljer sig åt i långsträckta mesenchymala-liknande celler. Morfologiska förändringar i EndMT sammanfaller med förändringar i uttrycket av vissa gener och proteiner. I allmänhet minskar uttrycket av proteiner som upprätthåller endotelegenskaper, inklusive vaskulär endotel (VE)-cadherin, trombocyt/EG vidhäftningsmolekyl-1 (CD31/Pecam-1). Samtidigt ackumuleras proteiner relaterade till mesenkymala funktioner, såsom α-glatt muskelaktin (α-Sma) och glatt muskelprotein 22α (Sm22α). Framväxande resultat har visat att postnatal EndMT bidrar till utvecklingen av mänskliga sjukdomar, såsom cancer, hjärtfibros, pulmonell arteriell hypertoni (PAH), åderförkalkning (AS), organfibros, etc2,4,5,6,7. En djupare förståelse för de underliggande mekanismerna i EndMT och hur man styr EndMT-processen kommer att ge nya terapeutiska metoder för EndMT-relaterade sjukdomar och regenerativ medicin.
TGF-β är en av de viktigaste EndMT-inducerarna, och andra kända involverade faktorer inkluderar Wnt / β-catenin, Notch och några inflammatoriska cytokiner1. Eftersom cellulära sammanhang är nyckeln för svar som utlöses av TGF-β, samspelet mellan TGF-β med andra EndMT främja signaler är relevant för TGF-β att framkalla en EndMT svar. Vid aktivering av TGF-β cell yta typ I och typ II serin/treonin kinas receptorer aktiveras den intracellulära kanoniska Smad-vägen. TGF-β receptormedierade fosforylerade Smad2/3 bildar heteromeriska komplex med Smad4 som flyttar in i kärnan, där de uppreglerar uttrycket av EndMT-relaterade transkriptionsfaktorer. I likhet med epitelial-mesenchymal övergång (EMT), transkription faktorer såsom snigel, snigel, twist, zeb1 och zeb2 induceras av TGF-β signalering och bidra till gen omprogrammering i EndMT8.
Snigel har ofta identifierats som en nyckelfaktor i EndMT. Snigel binder till promotorn av gener som kodar cellcells vidhäftningsproteiner och undertrycker deras transkription, vilket balanseras av förbättringen av uttrycket av mesenkymala proteiner9. Endotelceller utgör en mycket heterogen population och den relativa påverkan av olika extracellulära stimuli på EndMT kan skilja sig mellan endotel cellulära sammanhang eller celltyper10. På grund av dess likheter med EMT är vissa metoder användbara för att undersöka båda mekanismerna EMT och EndMT8. I detta avseende betonar EMT International Association (TEMTIA) starkt behovet av kompletterande tekniker för att i slutändan visa förekomsten av EMT/EndMT11.
Här beskriver vi en metod för att övervaka och visualisera TGF-β-inducerad EndMT-process. Immunofluorescensfärgning ger grundläggande information om uttrycksförändringar i riktade proteiner/markörer, som används som indikatorer på om EndMT-processen inträffar. Dessutom kan immunofluorescensfärgningen visualisera lokaliseringen av proteiner/markörer och cellmorfologi. För att studera den potentiella aktiviteten hos specifika TFs (eller andra uppströms eller nedströms regulatorer) som är involverade i TGF-β medierade EndMT, beskriver vi ett protokoll med grupperade regelbundet interspaced korta palindromic repetitioner (CRISPR) / CRISPR-associerade protein 9 (Cas9) genredigering för att tömma specifika gener från celler, med TF Snail som exempel. Cas9 är en dubbel RNA-guidad DNA-endonukleas som känner igen och klyver sekvenser som kompletterar CRISPR-sekvenser i bakterier12. CRISPR/Cas9-systemet används för närvarande i stor utsträckning eftersom det underlättar genteknik in vitro och in vivo13. Regisserad av en enda guide RNA (sgRNA), extopiskt uttryckt Cas9 genererar en dubbel strandbrytning vid en förvald inriktningssekvens i en specifik genlok. Icke-homolog end joining (NHEJ) äger rum för att reparera Cas9-inducerade strandbrytningar, via slumpmässiga nukleotidinfogningar eller borttagningar som därmed leder till störningar och inaktivering av den riktade genen. Vi beskriver i detalj metoder för att utforma selektiva sgRNAs och generera lentiviral-kompatibla vektorer som innehåller de utformade sgRNAs. Som ett resultat kan stabila gen-utarmade endotelceller genereras på ett effektivt och tillförlitligt sätt.
I denna studie använde vi murin bukspottskörteln microvascular endotelceller (MS-1)14 som ett modellsystem för att undersöka TGF-β2-inducerad EndMT processen. Vår tidigare studie visade att Snail är den viktigaste transkriptionsfaktorn som ökats av TGF-β2, genom vilken EndMT induceras i MS-1 celler15. På CRISPR/Cas9 genredigering för att upphäva snigel uttryck i MS-1 celler, TGF-β2 misslyckades med att medla EndMT. Detta arbetsflöde kan tillämpas för att studera andra (misstänkta) EndMT-relaterade gener.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter</td>
			<td>Pall Corporation, USA</td>
			<td>4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215; T4 DNA ligase buffer</td>
			<td>Thermofisher Scientific, USA</td>
			<td>B69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm round glass slice</td>
			<td>Knittel Glass,Germany</td>
			<td>VD10012Y1A.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>BD Eclipse, USA</td>
			<td>300629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Vector Laboratories, USA</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>VECTASHIELD Antifade&#160;Mounting Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AA19_PLKO vector</td>
			<td>Dr. M Gon&#231;alves, Leiden University Medical Center, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Serva Electrophoresis, USA</td>
			<td>1339903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG</td>
			<td>GE Healthcare, USA</td>
			<td>NA931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Cell signaling, USA</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11388991001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer O (10X)</td>
			<td>Thermofisher Scientific, USA</td>
			<td>BO5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BveI (Bspm1)</td>
			<td>Thermofisher Scientific, USA</td>
			<td>ER 1741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>&#160;Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat Alexa 488</td>
			<td>&#160;Invitrogen, USA</td>
			<td>A21208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>&#160;Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>&#160;Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa 594</td>
			<td>&#160;Invitrogen,USA</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabNed Plasmid kit</td>
			<td>LabNed, USA</td>
			<td>LN2400004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-1 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>HEMA, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Transparent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam-1 antibody</td>
			<td>&#160;Becton Dickinson,USA</td>
			<td>553370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences, USA</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLV-Cas9 plasmid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>Cas9BST-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>P9620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen, Germany</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sm22a antibody</td>
			<td>&#160;Abcam, UK</td>
			<td>ab14106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snail</td>
			<td>Cell signaling, USA</td>
			<td>3879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermofisher Scientific, USA</td>
			<td>EL 0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TGF-&#946;2</td>
			<td>Joachim Nickel, University of Wurzburg</td>
			<td>Gift</td>
			<td>Other commercial recommendation: 302-B2, R&#38;D systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>1086031000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris Bioscience, UK</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11814273001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tgf-&#946;-mediated endothelial to mesenchymal transition (endmt) and the functional assessment of endmt effectors using crispr/cas9 gene editing

Som svar på specifika externa signaler och aktivering av vissa transkriptionsfaktorer kan endotelceller differentiera sig till en mesenkymalliknande fenotyp, en process som kallas endotel till mesenkymal övergång (EndMT). Framväxande resultat har föreslagit att EndMT är kausally kopplat till flera mänskliga sjukdomar, såsom fibros och cancer. Dessutom kan endotel-härledda mesenchymala celler appliceras i vävnad regenerering förfaranden, eftersom de kan differentieras ytterligare i olika celltyper (t.ex. osteoblaster och kondrocyter). Således kan selektiv manipulation av EndMT ha klinisk potential. Liksom epitelial-mesenchymal övergång (EMT), EndMT kan starkt induceras av den utsöndrade cytokin omvandla tillväxtfaktor-beta (TGF-β), som stimulerar uttrycket av så kallade EndMT transkription faktorer (EndMT-TFs), inklusive snigel och snigel. Dessa EndMT-TFs sedan upp- och nedreglera nivåerna av mesenchymala respektive endotelproteiner. Här beskriver vi metoder för att undersöka TGF-β-inducerad EndMT in vitro, inklusive ett protokoll för att studera rollen av vissa TFs i TGF-β-inducerad EndMT. Med hjälp av dessa tekniker, vi ger bevis för att TGF-β2 stimulerar EndMT i murin bukspottskörteln microvascular endotelceller (MS-1 celler), och att den genetiska utarmningen av snigel med hjälp av grupperade regelbundet förhörda korta palindromiska repetitioner (CRISPR)/CRISPR-associerade protein 9 (Cas9)-medierad genredigering, abrogerar detta fenomen. Detta tillvägagångssätt kan fungera som en modell för att förhöra potentiella modulatorer av endotelbiologi, och kan användas för att utföra genetiska eller farmakologiska skärmar för att identifiera nya regulatorer av EndMT, med potentiell tillämpning vid mänsklig sjukdom.

TGF-β2 inducerar EndMT och stimulerar snigeluttryck i MS-1 endotelceller TGF-β är en av cytokinerna med störst potential att inducera EndMT. Efter behandling av MS-1 celler med TGF-β2 (1 ng/mL) i 3 dagar förlorar endotel MS-1 celler sin kullerstensliknande struktur och differentierar sig till spindelformade mesenchymala celler (Figur 1A)15. För att ytterligare verifiera rollen av TGF-β2 i inducera cell fenotypiska förändringar, vi förbehandlade cellerna med den lilla molekylen aktivin receptor-liknande kinas (ALK)4/ALK5/ALK7 hämmare SB431542 före TGF-β2 stimulering19. SB431542 helt avbrutna TGF-β2-inducerad cellmorfologi förändringar (Figur 1A). Den TGF-β2 inducerade EndMT-processen undersöktes ytterligare genom att studera förändringar i uttrycket av EndMT-relaterade markörer. Som visas i figur 1Bminskade det endotelprotein pecam-1 kraftigt efter TGF-β2 stimulering, medan mesenkymal faktor Sm22α var djupt uppreglerad av TGF-β215. Dessa data överensstämmer med uppfattningen att TGF-β2 utlöste EndMT i MS-1 celler. Därefter undersökte vi effekterna av TGF-β2 på snigel och snigel uttryck. Som visas i figur 1C,Snigel var markant uppreglerad av TGF-β2, medan Slug uttryck påverkades inte av TGF-β2 i MS-1 celler15. Kvantifieringen av snigeluttryck från tre oberoende experiment visas i figur 1D.
Utarmning av snigel genom CRISPR/Cas9 i MS-1 endotelceller Eftersom Snail inducerades av TGF-β2 och sannolikt deltar i TGF-β2-medierad EndMT, utförde vi CRISPR/Cas9 genredigering för att genetiskt utarma snigel uttryck i MS-1 celler. Vi antog att utarmning av snigel skulle vara tillräckligt för att hämma TGF-β2-inducerad EndMT. Som visas i figur 2A genereradevi snigel knockout celler i två steg. För det första uttrycktes Cas9 ectopically genom att infektera MS-1 celler med en Cas9 uttrycker lentivirus. Eftersom det finns en blasticidinresistenskassett i pLV-Cas9-konstruktionen kontrollerade vi uttrycket av Cas9 genom västerländsk fläckanalys i blasticidinresistenta celler (Figur 2D). Därefter introducerade vi sgRNAs som specifikt riktade snigel för att störa dess proteinuttryck. Detta förfarande utfördes också av infektion med lentivirala partiklar som bär AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA konstruktion, som innehåller en puromycin uttryck kassett. Cas9-uttrycka celler var igen infekterade med gRNA som innehåller lentivirus och vidare utvalda med puromycin. Två kompletterande sgRNA-oligos riktade mot murin snigel utformades med en förväntad låg off-target aktivitet(figur 2B,C). Efter att ha introducerat två oberoende Snail sgRNAs i Cas9 som uttrycker MS-1 celler, snigelprotein uttryck var abrogerad (Figur 2D)15.
Brist på snigel hämmar TGF-β2-inducerad EndMT i MS-1-celler För att demonstrera funktionen av snigel i TGF-β2-medierad EndMT utförde vi en EndMT-analys i snigel-uttömda celler och jämförde den med föräldrarnas MS-1-celler. Som visas i figur 3Avar knockouten av Snail tillräcklig för att hämma den fibroblastliknande cellmorfologin driven av TGF-β2 i MS-1-celler15. Dessutom blockerades den TGF-β2-medierade nedgången i Pecam-1 och förbättringen av Sm22α helt i snigel-utarmade MS-1 celler. Sammanfattningsvis visade vi att Snail är avgörande för TGF-β2-medierad EndMT i MS-1 celler(Figur 3B)15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62198/62198fig1v2.jpg"> Figur 1. TGF-β2 inducerar EndMT och Snail uttryck i MS-1 celler. A. Effekter av TGF-β2 och/eller TGF-β typ I receptorkina inhibitor SB-431542 på cell morfologi. Brightfield bilder av MS-1 celler vid behandling med TGF-β2 (1 ng/mL) och/eller SB-431542 (SB, 5 μM, administreras 30 min före TGF-β2) i 2 dagar. Skalstången representerar 200 μm. B. Immunofluorescensfärgning av Pecam-1 (grön) och Sm22α (röd) i MS-1-celler odlade i medium som innehåller TGF-β2 (1 ng/ml) i 3 dagar. Atomkärnor visualiseras i blått (DAPI). Skalstång: 50 μm. C. Western blot med helcellslyat av TGF-β2 stimulerade MS-1 celler. Uttrycket av snigel, men inte snigel, förbättrades av TGF-β2 stimulering, som tidigare rapporterats i Ma et al15. D. Jag är inte så bra på Kvantifiering av snigeluttryck genom att integrera resultaten från tre oberoende västerländska fläckar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62198/62198fig1v2large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62198/62198fig2v2.jpg"> Figur 2. Utarmning av snigel genom CRISPR-Cas9 genredigering. A. Schema som visar hur man genererar snigel knockout celler. Bsd: Blasticidin. Puro: Puromycin. B. Jag är inte så bra på Oligonukleotider av två oberoende sgRNAs som riktar sig till Snail med CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) och Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). C. Den förväntade off-target aktiviteten av de två gRNAsna för Snail som använder Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). D. Jag är inte så bra på Cas9 och Snail uttryck i vild typ (WT) och Cas9-överuttryck MS-1 mätt med western blot analys. E. Knockout av Snail med två oberoende gRNAs i MS-1 celler mätt med western blot analys. Vi rapporterade liknande resultat i Ma et al15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62198/62198fig2v2large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62198/62198fig3v2.jpg"> Bild 3. Genetisk utarmning av snigel hämmar TGF-β2-inducerad EndMT i MS-1 celler. A. Brightfield bilder av MS-1 celler vid behandling med TGF-β2 (0,1 ng/mL) i 3 dagar i wildtype (WT, övre panelen) och Snail slog ut (nedre panelen) celler. Skalstång representerar 200 μm. B. Immunofluorescerande färgning för Pecam-1 (grön), Sm22α (röd) och atomkärnor (blå) av MS-1 celler odlade i medium som innehåller TGF-β2 (1 ng/ml) i 3 dagar. Utarmning av snigel abrogerad TGF-β2-inducerad minskning av Pecam-1 och ökning av Sm22α uttryck. Skala bommar för föreställer 50 μm. C. Schematisk framställning av verkställa av Snail knockout på TGF-β-inducerad EndMT i MS-1 celler. TGF-β stimulerar uttrycket av Snail genom Smad väg genom fosforylering Smad2/3 och vidare driver EndMT. Slå ut Snail med CRISPR/ Cas9-baserad genredigering abrogerad TGF-β-medierad EndMT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62198/62198fig3v2large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about TGF-ÃŽÂ²-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing at JoVE.com

TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

Vi beskriver metoder för att undersöka TGF-β2-inducerad EndMT i endotel celler genom att observera cell morfologi förändringar och undersöka uttrycket EndMT-relaterade markör förändringar med hjälp av immunofluorescens färgning. CRISPR/Cas9 genredigering beskrevs och användes för att tömma genkodningen snigel för att undersöka dess roll i TGF-β2-inducerad EndMT.

TGF-β-medierad endotel till mesenkymal övergång (EndMT) och funktionell bedömning av endmt-effektorer med CRISPR / Cas9 Genredigering

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Endotel till mesenchymal övergång är en cellulär process där endotelceller ändrar sin kullersten morfologi till en fibroblast-liknande fenotyp. Och cytokinen TGF-beta, som omvandlar tillväxtfaktor beta, är en viktig drivkraft för denna övergång. Analys av förändringarna i cell morfologi och uttryck nivåer av endotel och mesenchymal markörer gör det möjligt för oss att bedöma förekomsten av endotel till mesenchymal övergång.Framväxande data kopplar den endotel till mesenkymal övergångsprocess till olika sjukdomar inklusive cancer, hjärt-kärlsjukdom och fibros. Och data tyder på att interventionen kan vara till terapeutisk nytta. Genom att stimulera den endotel till mesenchymala övergångsprocessen, som sker under embryogenes och organutveckling, kan vi möjligen regenerera mesenchymal-härledda vävnader som brosk, ben och muskler.För att upptäcka det intracellulära proteinet genom immunflourescensfärgning är cellpermeabilisering med 0,1%Triton X-100 nödvändigt för att antikropparna ska kunna passera genom cellmembranen. Med denna videodemonstration kommer forskare att få ett bra grepp om hur man undersöker cytokinernas roll som TGF-beta i endotel till mesenkymal övergång. Frö 1 x 10^5 spegling bukspottskörtel holme endotel MS1 celler i DMEM kompletteras med 10%FBS och 100 enheter per milliliter penicillin och streptomycin på en 0,1%gelatinbelagd odlingsplatta.Efter inkubation över natten i cellkulturinkubatorn, tvätta cellerna med PBS innan du behandlar med två milliliter på 0,25% trypsin, 0,02% EDTA-lösning i två minuter vid 37 grader Celsius. När cellerna har börjat lossna, släcka reaktionen med fem milliliter komplett odlingsmedium och överför den resulterande cellupphängningen till ett 15 milliliter rör för centrifugering. Återanvänd pelleten i fyra milliliter färskt komplett medium för räkning.Och frö 1 X 10^3 celler per kubikcentimeter till en ny cellkulturbehållare. Efter över natten kultur, behandla två brunnar med fem mikromolar TGF-beta receptor kinashämmare SB-431542 och två brunnar med DMSO lösningsmedel kontroll. Och placera cellerna i cellkulturinkubatorn i 30 minuter.I slutet av inkubationen, behandla två brunnar med fordonsstyrning och två brunnar med TGF-beta 2. Efter tre dagar, använd ett inverterat mikroskop för att undersöka cellmorfologin för varje cellbehandlingsgrupp under brightfield imaging. För att bedöma endMT-relaterade markör förändringar genom immunofluorescent färgning, ta bort cellerna från en lämplig MS1 cell kultur, som visats.Och såd cellerna vid en koncentration på 1,9 X 10^3 celler på 0,1%gelatinbelagda 12 millimeter runda täckglas placerade i enskilda brunnar på en 24-brunnsplatta. Efter över natten kultur, behandla cellerna med en nanogram milliliter TGF-beta 2 i tre dagar. I slutet av inkubationen, tvätta cellerna med PBS och fixa de behandlade kulturerna med 300 mikroliter på 4% formaldehyd per brunn i 10 minuter vid rumstemperatur.I slutet av fixeringen, tvätta cellerna tre gånger med PBS innan du permeabiliserar cellerna med 300 mikroliter på 0,1%Triton X-100 och PBS per brunn i 10 minuter vid rumstemperatur. I slutet av inkubationen, tvätta cellerna tre gånger i PBS och blockera cellerna med 3%BSA i PBS. Efter 45 minuter vid rumstemperatur, märk cellerna med primära PECAM-1- och SM22-alfaantikroppar i 45 minuter vid rumstemperatur, följt av tre tvättar i PBS.Efter den sista tvätten, inkubera cellerna med lämpliga sekundära antikroppar i 45 minuter vid rumstemperatur och tvätta cellerna tre gånger med PBS innan du monterar cellerna med ett DAPI-kompletterat monteringsmedium och en täckspricka. Försegla sedan kanterna på locket med klart nagellack och avbilda cellmarköruttrycket genom fluorescenskonfokal mikroskopi med lämpliga filter enligt standardavbildningsprotokoll. Efter tre dagars behandling med TGF-beta 2 förlorar endotel MS1-celler sin kullerstensliknande struktur och differentierar sig till spindelformade mesenkymala celler.Denna TGF-beta 2 inducerad differentiering undertrycks när cellerna utsätts för TGF-beta receptorn kinashämmare SB-431542. Uttrycket av endotelprotein PECAM-1 minskas kraftigt efter TGF-beta 2 stimulering medan mesenchymal faktor SM-22 alfa är djupt uppreglerad. Dessutom är Snail markant uppreglerad av TGF-beta 2 exponering medan Slug uttryck påverkas inte.Som observerat CRISPR-Cas9 genredigering kan användas för att underlätta införandet av två oberoende Snail single guide RNAs i Cas9-uttrycker MS1 celler för att störa snigel uttryck. Knockout av Snail är tillräcklig för att hämma den fibroblast-liknande cell morfologi drivs av TGF-beta 2 i MS1 celler och att blockera TGF-beta 2 medierad PECAM-1 nedgång och SM-22 alfa förbättring. Bedömningen av förändringar i cell morfologi och uttryck för endotel och mesenchymal markörer av immunofluorescens kan valideras ytterligare genom att mäta uttrycket av dessa markörer på kvantitativ PCR i western blot analys.Denna teknik för att upptäcka endotel till mesenkymal övergång har gjort det möjligt för forskarna att undersöka denna framväxande betydelse som en fysiologisk process som uppstår vid flera sjukdomar.

Research

JoVE Journal

Biology

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

Light/dark Transition Test for Mice

Ljus / mörk Transition Test för möss

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion och Analys av Epithelial till mesenkymala övergång

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Upptäckt av alternativ splits Under Epithelial-Mesenkymala Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Ett protokoll för att använda gen Set-anrikning analys identifiera den lämplig djurmodell för translationell forskning

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Fisk spermier bedömning använder programvara och kylanordningar

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Signaling

Molekylär analys av Endothelial-mesenkymala övergången induceras av Transforming Growth Factor-β signalering

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Dämpning av gnistan: CRISPR/Cas9 genom redigering i svagt elektrisk fisk

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Förbereda och injicera embryon från Culex myggor för att generera nullmutationer med CRISPR / Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Genomteknik för primära mänskliga B-celler med CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal och vuxna injektioner för RNAi och CRISPR Genredigering i Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...