Screeningen af mindre organiske forbindelser kaldet fragmenter ved hjælp af røntgenkrystallografi er en effektiv metode til at identificere molekyler, der er udgangspunkter for lægemiddelforskning eller biokemisk værktøjsforbindelsesudvikling. Krystallografisk fragmentscreening afslørede ikke kun identiteten, men også hvor og hvordan fragmenterne binder sig på overfladen af det undersøgte protein. Denne teknik kan bruges på alle biokemiske eller medicinsk relevante proteinmål, for hvilke der kan dyrkes egnede proteinkrystaller.
Kvaliteten af resultaterne er tæt forbundet med kvaliteten af prøvehåndteringen. Vi mener, at følgende visuelle demonstration vil hjælpe forskere med at udføre eksperimenter af høj kvalitet. Demonstration af proceduren vil være Tatjana Barthel, en ph.d.-forsker og ph.d.-studerende i mit laboratorium.
Til at begynde med skal du skære posen på screeningspladen forvarmet til stuetemperatur og derefter fjerne låget og folien fra screeningspladen. Dekanter den fem milliliter iblødsætningsopløsning i reagensbeholderen. Fyld derefter hvert af pladens 96 reservoirer med 40 mikroliter blødgøringsopløsning ved hjælp af en 12-kanals pipette.
Placer den nemme adgangsramme oven på screeningspladen, og fastgør den med de medfølgende klemmer ved at skubbe dem på venstre og højre side af enheden. Placer screening plade og nem adgang ramme under mikroskopet og skub åbne den første brønd ved at flytte de respektive akryl glas flise af rammen. Der tilsættes 0,4 mikroliter blødgøringsopløsning fra reservoiret til fragmentet, der indeholder godt ved hjælp af en frisk pipettespids.
Sørg for, at dråben dækker det tørrede fragment. Placer krystalliseringspladen, der indeholder de største krystaller under det andet mikroskop, og skær tætningsfolien op ved en af brøndene. Ved hjælp af en passende størrelse sløjfe, overføre en krystal til brønden af screening plade under det første mikroskop.
Vask løkken i den forberedte glaspletplade, og tør den derefter forsigtigt ved at røre ved den til vævet. Gør dette efter hver overførsel for at undgå krydskontaminering. Brug mikroskopet til at sikre, at krystallen er korrekt placeret.
Gentag proceduren for den anden krystal. Gå videre til den næste brønd, og gentag proceduren for alle resterende brønde. Når krystallerne er blevet overført til alle 96 brønde i screeningspladen, skal du fjerne screeningspladen sammen med den nemme adgangsramme under mikroskopet og placere den på bænken eller bordet.
Fjern derefter den nemme adgangsramme fra screeningspladen, forsegl screeningspladen med tætningsfolie, og læg den i krystalliseringsinkubatoren eller skabet for at inkubere i den tidligere optimerede blødgøringstid. To timers inkubation er tilstrækkelig, men natten over kan være mere bekvemt. Forbered Unipuck skum Dewar med tre Unipuck låg og halvdelen fylde det med flydende nitrogen, holde det på jorden.
Flyt den halvfyldte Dewar til bænken, og fyld den helt til kanten. Hold den fyldt til den øverste kant under hele eksperimentet, og udskift det flydende nitrogen ofte. Hent screeningspladen fra inkubatoren, og fjern folien.
Placer den nemme adgangsramme på toppen. Skub åbne den første brønd. Høst en krystal fra dråben og flash afkøles det i flydende nitrogen ved at kaste med en hurtig lodret bevægelse.
Sæt prøven i den rigtige puckposition, og tag relevante noter på prøvesporingsarket. Gentag proceduren for den anden krystal. Gå til den næste brønd og gentag placeringen af andre krystaller, indtil alle tre puck er fulde.
Forkøl Unipuck-baserne i flydende nitrogen, og tilsæt dem oven på lågene. Opbevar Unipucks i opbevaringsstativ i en transport Dewar eller opbevaring Dewar. Opbevar dem i flydende nitrogen ved kryogene temperaturer indtil måling.
Gentag den samme procedure for høst og opbevaring af krystallerne i Unipucks for de resterende prøver i screeningspladen. Variabiliteten af krystalmorfologierne efter at have udført fragmentet iblødsætning og krystalhøst er vist her. Selv krystaller, der ser noget forringet ud, blev inkluderet, da de stadig resulterer i nyttige data.
Der blev indsamlet data ved strålelinje 14.1 og 14.2 ved BESSY II-synkrotronen. Der blev udført indsamling af Diffraktion-data for hvert eksempel. Dataene blev analyseret ved hjælp af FragMAXapp med fokus på kombinationen af XDSAPP til behandling, fspipeline til strukturforbedring og PenDA til hitsøgning.
Dette resulterede i 15 hits på AR protein kompleks ved hjælp af en DMSO gratis iblødsætning tilstand. I en tidligere kampagne af F2X indrejse skærmen mod det samme mål, herunder DMSO i blødgøring tilstand, 20 hits blev fundet. Det betyder, at 75% af hits kan identificeres, hvis DMSO er udeladt.
For eksperimentets succes er det afgørende, at krystallerne håndteres korrekt og omhyggeligt under hvert trin i proceduren. Krystallografisk fragmentscreening er modnet til en udbredt teknik, som ofte anvendes i den akademiske verden og i den farmaceutiske industri.