Screening av mindre organiske forbindelser kalt fragmenter ved hjelp av røntgenkrystallografi er en effektiv metode for å identifisere molekyler som er utgangspunkt for legemiddeloppdagelse eller biokjemisk verktøyforbindelsesutvikling. Krystallografisk fragmentscreening avslørte ikke bare identiteten, men også hvor og hvordan fragmentene binder seg på overflaten av proteinet som studeres. Denne teknikken kan brukes på alle biokjemisk eller medisinsk relevante proteinmål som egnede proteinkrystaller kan dyrkes for.
Kvaliteten på resultatene er nært knyttet til kvaliteten på prøvehåndteringen. Vi tror at følgende visuelle demonstrasjon vil hjelpe forskere med å utføre eksperimenter av høy kvalitet. Å demonstrere prosedyren vil være Tatjana Barthel, doktorgradsforsker og stipendiat i laboratoriet mitt.
Til å begynne med, kutt opp posen på screeningplaten forvarmet til romtemperatur, fjern deretter lokket og folien fra screeningplaten. Dekanter den fem milliliter soaking løsningen i reagensbeholderen. Fyll deretter hvert av de 96 reservoarene på platen med 40 mikroliter soaking løsning ved hjelp av en 12 kanals pipette.
Plasser den enkle tilgangsrammen på toppen av screeningplaten og fest den med de medfølgende klemmene ved å skyve dem på venstre og høyre side av enheten. Plasser screeningplaten og den enkle tilgangsrammen under mikroskopet og skyv den første brønnen opp ved å flytte den respektive akrylglassflisen på rammen. Tilsett 0,4 mikroliter soaking løsning fra reservoaret til fragmentet som inneholder godt ved hjelp av en frisk pipettespiss.
Pass på at dråpen dekker det tørkede fragmentet. Plasser krystalliseringsplaten som inneholder de største krystallene under det andre mikroskopet, og kutt opp tetningsfolien ved en av brønnene. Bruk en sløyfe i riktig størrelse, overfør en krystall til brønnen på screeningplaten under det første mikroskopet.
Vask løkken i den forberedte glassflekkplaten, og tørk den deretter ved å berøre den forsiktig til vevet. Gjør dette etter hver overføring for å unngå krysskontaminering. Bruk mikroskopet for å sikre at krystallen er riktig plassert.
Gjenta prosedyren for den andre krystallen. Gå videre til neste brønn, og gjenta prosedyren for alle gjenværende brønner. Etter at krystaller er overført til alle de 96 brønnene i screeningplaten, fjern screeningplaten sammen med den enkle tilgangsrammen fra under mikroskopet og plasser den på benken eller bordet.
Fjern deretter den enkle tilgangsrammen fra screeningplaten, forsegle screeningplaten med tetningsfolie, og legg den i krystalliseringsinkubatoren eller skapet for å inkubere for den tidligere optimaliserte bløtleggingstiden. To timer inkubasjon er tilstrekkelig, men over natten kan være mer praktisk. Forbered Unipuck skum Dewar med tre Unipuck lokk og halv fylle den med flytende nitrogen, holde den på bakken.
Flytt den halvfylte Dewar til benken, og fyll den helt til kanten. Hold den fylt til øvre kant under hele eksperimentet, og bytt ut det flytende nitrogenet ofte. Hent screeningplaten fra inkubatoren og fjern folien.
Plasser den enkle tilgangsrammen på toppen. Skyv den første brønnen opp. Høst en krystall fra dråpen og blits avkjøl den i flytende nitrogen ved å stupe med en rask vertikal bevegelse.
Sett inn prøven i riktig puckposisjon, og ta relevante notater på prøvesporingsarket. Gjenta prosedyren for den andre krystallen. Gå til neste brønn og gjenta plasseringen av andre krystaller til alle tre puckene er fulle.
Forkjøl Unipuck-basene i flytende nitrogen, og legg dem på toppen av lokkene. Oppbevar Unipucks i oppbevaringsstativet i en dewar-transport eller lagring Dewar. Hold dem i flytende nitrogen ved kryogeniske temperaturer til måling.
Gjenta den samme prosedyren for høsting og lagring av krystallene i Unipucks for de resterende prøvene i screeningplaten. Variasjonen av krystallmorfologiene etter å ha utført fragmentet soaking og krystallhøsting er vist her. Selv krystaller som ser noe forverret ut, ble inkludert, da de fortsatt resulterer i nyttige data.
Data ble samlet inn ved bjelkelinjene 14.1 og 14.2 ved BESSY II-synkrotronen. Innsamling av diffraksjonsdata ble utført for hvert utvalg. Dataene ble analysert ved hjelp av FragMAXapp, med fokus på kombinasjonen av XDSAPP for behandling, fspipeline for strukturforbedring og PenDA for trefffunn.
Dette resulterte i 15 treff på AR-proteinkomplekset ved hjelp av en DMSO-fri bløtleggingstilstand. I en tidligere kampanje på F2X-inngangsskjermen mot samme mål, inkludert DMSO i bløtleggingstilstand, ble det funnet 20 treff. Dette betyr at 75% av treffene kan identifiseres hvis DMSO utelates.
For å lykkes med eksperimentet er det avgjørende at krystallene håndteres riktig og nøye under hvert trinn i prosedyren. Krystallografisk fragmentscreening har modnet til en mye brukt teknikk, som ofte brukes i akademia og i farmasøytisk industri.