Name: air-inflation of murine lungs with vascular perfusion-fixation
Uploaded: 2021-02-02T14:00:00
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Questo lavoro è stato finanziato dal National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) sovvenzioni HL140039 e HL130938. Gli autori desiderano ringraziare Shannon Hott e Jazalle McClendon per la loro competenza tecnica.

Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della National Jewish Health.
NOTA: il protocollo è organizzato in tre componenti. Il primo componente descrive in dettaglio la costruzione del gonfiaggio dell'aria con apparecchiature di perfusione / fissazione. Una seconda sezione descrive come impostare l'attrezzatura per un esperimento. La sezione finale descrive come preparare l'animale ed eseguire l'esperimento.</p...

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	<li>Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Official+Research+Policy+Statement+of+the+American+Thoracic+Society/European+Respiratory+Society:+Standards+for+Quantitative+Assessment+of+Lung+Structure.">An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).</li><li>Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+rapidly+frozen+lungs:+evaluation+on+the+basis+of+standard+criteria.">Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria.</a> Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).</li><li>Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+fixation+of+lungs+for+structure-function+analysis:+credits+and+limitations.">Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations.</a> Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).</li><li>Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+volume-surface+area+relation+in+air-+and+saline-filled+lungs+fixed+by+vascular+perfusion.">Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion.</a> Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).</li><li>Harris, R. 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A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Mechanical+Strain+Characterization+of+Ventilated+ex+vivo+Porcine+and+Murine+Lung+using+Digital+Image+Correlation.">Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation.</a> Frontiers in Physiology. 11, 600492 (2020).</li><li>Braber, S., Verheijden, K. a. T., Henricks, P. a. J., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+fixation+methods+on+lung+morphology+in+a+murine+model+of+emphysema.">A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).</li><li>Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+Macrophages.">Airway Macrophages.</a> American Review of Respiratory Disease. 129 (5), 823-826 (1984).</li><li>Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+Macrophage+Distribution+in+a+Mouse+Model:+The+Importance+of+the+Fixation+Method.">Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method.</a> Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).</li><li>Matulionis, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+deformation+and+macrophage+displacement+in+smoke-exposed+and+normal+mice+(Mus+musculus)+following+different+fixation+procedures.">Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures.</a> Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564 (2012).</li><li>Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+characteristics+of+the+chest+and+lungs+and+the+work+of+breathing+in+different+mammalian+species.">Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species.</a> The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+Methods+of+Immunohistochemistry.">Principles and Methods of Immunohistochemistry.</a> Drug Safety Evaluation: Methods and Protocols. , 115-128 (2017).</li></ol>

Sebbene comunemente usati, i metodi di fissazione intratracheali spostano i leucociti dalle vie aeree e possono alterare la normale architettura polmonare. Il metodo di gonfiaggio dell'aria con fissazione della perfusione vascolare fornito in questo protocollo supera queste insidie e preserva più accuratamente l'anatomia polmonare. Le chiavi per ottenere tessuto di alta qualità dal metodo di perfusione-fissazione vascolare includono un attento monitoraggio delle pressioni di gonfiaggio dell'aria, evitando perdite d'ari...

L'istologia polmonare rappresenta il gold standard per la valutazione dell'architettura polmonare durante la salute e la malattia ed è uno degli strumenti più comunemente usati dai ricercatori polmonari1. Uno degli aspetti più critici di questa tecnica è il corretto isolamento e conservazione del tessuto polmonare, poiché la variabilità in questa fase può portare a una scarsa qualità dei tessuti e risultatierrati 1,2,3. Negli animali viventi, il volume polmonare è determinato dall'equilibrio tra il rinculo elastico verso l'interno del polmone e le forze esterne trasmesse dalla parete toracica e dal diaframma dalla tensione superficiale. Di conseguenza, quando si entra nel torace, le forze esterne vengono perse e il polmone collassa. Le sezioni istologiche preparate da polmoni collassati hanno un aspetto affollato e i confini tra i compartimenti anatomici (cioè spazi aerei, vascolarizzazione e interstizio) possono essere difficili da distinguere. Per aggirare questa sfida, i ricercatori spesso gonfiano i polmoni durante la fissazione chimica in modo da mantenere le dimensioni e l'architettura dello spazio aereo.
I polmoni possono essere gonfiati con aria o liquido. La pressione necessaria per gonfiare i polmoni allo stesso volume differisce tra gonfiaggio dell'aria e del liquido a causa delle forze intermolecolari all'interfaccia aria-liquido. Durante il gonfiaggio dell'aria è necessaria una pressione più elevata (ad esempio,25cmH 2 O) rispetto al gonfiaggio del liquido (ad esempio, 12 cmH2O) per superare la tensione superficiale e aprire gli alveoli collassati4. Una volta che gli alveoli sono stati reclutati, una pressione inferiore può mantenere gli alveoli aperti allo stesso volume dei plateau della curva pressione-volume, e le pressioni si equalizzano in tutto il polmone secondo la legge di Pascal4,5,6,7,8.
Esistono due metodi principali di inflazione e fissazione polmonare per preservare i polmoni murini per l'istologia. Più comunemente, gli spazi aerei sono instillati con liquido - spesso contenente un fissativo. Il vantaggio principale di questo approccio è che è relativamente facile e richiede poca formazione. Mentre l'instillazione intratracheale di fissativo può essere preferita negli studi che si concentrano sulla vascolarizzazione, il liquido che viene instillato attraverso la trachea tende a spingere le cellule prossimali delle vie aeree e le mucina in regioni più distali dello spazio aereo mentre l'inflazione dell'aria non1,3,4,9,10,11. Inoltre, il distacco involontario dei leucociti dall'epitelio durante il gonfiaggio liquido altera la loro morfologia, conferendo loro un aspetto semplice e arrotondato4,10,11,12. Infine, il gonfiaggio dei polmoni con liquido può involontariamente comprimere l'interstizio4,10,11. Insieme, questi fattori possono distorcere la normale anatomia e le distribuzioni cellulari all'interno dei polmoni conservati, limitando così la tecnica.
Un metodo alternativo di conservazione dei tessuti è la perfusione-fissazione vascolare. In questo metodo, il fissativo viene perfuso nella vascolarizzazione polmonare attraverso la vena cava o il ventricolo destro. Questo metodo preserva la posizione e la morfologia delle cellule nel lume dello spazio aereo. Tuttavia, a meno che i polmoni non siano gonfiati durante la fissazione della perfusione, è probabile che il tessuto polmonare collassi.
Il gonfiaggio dell'aria con perfusione-fissazione vascolare sfrutta i punti di forza di ciascuna delle tecniche di fissazione di cui sopra. Qui forniamo un protocollo per questa tecnica. I materiali e le attrezzature necessari sono relativamente economici e possono essere facilmente ottenuti e assemblati. La configurazione completata, mostrata nella Figura 1A,fornisce una pressione costante delle vie aeree ai polmoni attraverso una colonna regolabile e piena di liquido, mentre una pompa peristaltica fornisce fissativo attraverso il ventricolo destro. I polmoni con morfologia preservata possono quindi essere ulteriormente elaborati per analisi struttura-funzione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Mfr # VPB1000050N &#8211; Item # EW-00117-XF</td>
			<td>Stopcock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 60 mL syringe, slip tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309654</td>
			<td>Syringe used to construct the water column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td>Needle for vascular perfusion/fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer</td>
			<td>Nordson Medical</td>
			<td>FTLLBMLRL-1</td>
			<td>Female Luer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td>Heparin solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>427564</td>
			<td>Luer-Stub Adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee</td>
			<td>Nordson Medical</td>
			<td>LT787-9</td>
			<td>Male Luer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>8000-9020</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker</td>
			<td>Permatex</td>
			<td>81724</td>
			<td>Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container</td>
			<td>Sterilite</td>
			<td>0342</td>
			<td>Animal processing container</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

air-inflation of murine lungs with vascular perfusion-fixation

L'istologia polmonare viene spesso utilizzata per studiare i contributi forniti dalle cellule dello spazio aereo durante l'omeostasi polmonare e la patogenesi della malattia. Tuttavia, i metodi di fissazione basati sull'instillazione comunemente usati possono spostare le cellule dello spazio aereo e il muco nelle vie aeree terminali e possono alterare la morfologia dei tessuti. In confronto, le tecniche di perfusione-fissazione vascolare sono superiori nel preservare la posizione e la morfologia delle cellule all'interno degli spazi aerei e del rivestimento della mucosa. Tuttavia, se la pressione positiva delle vie aeree non viene applicata contemporaneamente, le regioni dei polmoni possono collassare e i capillari possono gonfiarsi negli spazi alveolari, portando alla distorsione dell'anatomia polmonare. Qui, descriviamo un metodo economico per l'inflazione dell'aria durante la perfusione-fissazione vascolare per preservare la morfologia e la posizione delle vie aeree e delle cellule alveolari e dell'interstizio nei polmoni murini per gli studi istologici a valle. La pressione costante dell'aria viene erogata ai polmoni attraverso la trachea da una camera sigillata e riempita d'aria che mantiene la pressione attraverso una colonna liquida regolabile mentre il fissativo viene perfuso attraverso il ventricolo destro.

In un torace intatto, i polmoni sono tenuti aperti da forze esterne applicate dalla parete toracica attraverso lo spaziopleurico6,14. Quando il diaframma viene inserito durante la dissezione, l'integrità dello spazio pleurico viene abolita e i polmoni dovrebbero collassare (Figura 2A, 2B). Per ri-espandere i polmoni, viene eseguito il gonfiaggio dell'aria. Come primo passo, vengono applicati 25 cm di pressione dell'...

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Air-Inflation of Murine Lungs with Vascular Perfusion-Fixation

Viene presentato un metodo per il gonfiaggio dell'aria con perfusione-fissazione vascolare dei polmoni che preserva la posizione delle cellule all'interno delle vie aeree, degli alveoli e dell'interstizio per le analisi struttura-funzione. La pressione costante delle vie aeree viene mantenuta con una camera di gonfiaggio dell'aria mentre il fissativo viene perfuso attraverso il ventricolo destro. I polmoni vengono elaborati per studi istologici.

Gonfiaggio dell'aria dei polmoni murini con perfusione-fissazione vascolare

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, ...

Questo è un metodo economico che combina i vantaggi del gonfiaggio dell'aria e della fissazione della perfusione vascolare per preservare i polmoni per analisi strutturali e funzionali. Il principale vantaggio di questa tecnica è la conservazione sia della morfologia cellulare che della posizione all'interno degli spazi aerei del polmone. Prestare attenzione quando si posiziona l'adattatore per l'esca nella trachea e l'ago di perfusione nel ventricolo destro per garantire un gonfiaggio e una fissazione adeguati.Per impostare l'apparato di gonfiaggio dell'aria, posizionare una siringa per la colonna d'acqua in un supporto ad anello e misurare un'altezza verticale di 25 centimetri dalla piattaforma animale a 25 centimetri sulla colonna d'acqua. Fissare all'estremità del tubo della colonna d'acqua al rubinetto sulla camera d'aria e collegare un tubo dall'esca femmina della camera d'aria al rubinetto sul contenitore di lavorazione degli animali. Verificare che il tappo della camera d'aria e il rubinetto all'esterno del contenitore per la lavorazione degli animali siano chiusi e che il rubinetto sul tubo che porta dalla colonna d'acqua alla camera di gonfiaggio dell'aria sia aperto.Quindi riempire la siringa con acqua fino al segno di 25 centimetri. L'acqua scorrerà attraverso la siringa e il tubo nella camera d'aria. Una volta equalizzata la pressione, l'acqua smetterà di scorrere.Per preparare i polmoni all'inflazione fare un'incisione laterale nella parete addominale sotto la gabbia toracica del topo eutanasizzato e una seconda incisione laterale della parete addominale sopra i fianchi. Tagliare lungo la linea mediana dall'incisione interna verso l'incisione superiore e usare forbici smussate per praticare con cura un'incisione nel lato laterale del diaframma. I polmoni dovrebbero collassare non appena il diaframma viene perforato.Tagliare trasversalmente lungo il diaframma per aprire la cavità toracica e tagliare superiormente lungo lo sterno dal processo xifoide alla tacca del giocoliere, e lateralmente sopra la gabbia toracica per esporre completamente il cuore e i polmoni. Fissare i lati della gabbia toracica e fare un'incisione della linea mediana nel collo, sopra la trachea. Rimuovere la pelle, il muscolo, la ghiandola tiroidea e il tessuto connettivo che circonda la trachea e utilizzare una pinna curva per far scorrere due pezzi di sutura sotto la trachea posteriore.Utilizzare un pezzo di sutura per tenere in posizione l'adattatore per l'esca di gonfiaggio e utilizzare un ago da 18 gauge per un pollice per fare un piccolo foro nella trachea. Inserire un adattatore per esca calibro 20 nel foro e legare la sutura attorno alla trachea immediatamente distale nel punto in cui l'adottante dello stub dell'esca entra nel foro. Quindi trasferire l'animale nel contenitore di lavorazione degli animali e collegare l'adattatore per stub dell'esca all'esca femminile all'interno del contenitore di lavorazione degli animali.Per gonfiare i polmoni, posizionare l'ago da 25 gauge per 5/8 di pollice attaccato al tubo dell'apparato di perfusione nel ventricolo destro del cuore e tagliare l'aorta addominale per consentire al sangue di defluire dal cuore e per promuovere il flusso di perfusare attraverso i polmoni. Aprire il rubinetto all'esterno del contenitore di lavorazione degli animali e gonfiare i polmoni a 25 centimetri di acqua per cinque minuti, facendo attenzione che il livello dell'acqua nella siringa non diminuisca troppo rapidamente. Durante l'ultimo minuto di gonfiaggio polmonare, accendere la pompa peristaltica a una portata di 10 millilitri al minuto.La soluzione di eparina dovrebbe fluire dalla bottiglia attraverso il tubo nell'animale. Dopo aver gonfiato i polmoni per cinque minuti, spegnere la pompa e passare il perfusato dall'eparina al fissativo. Abbassare la siringa a colonna d'acqua a 20 centimetri.È normale che le bolle d'aria si muova all'interno della colonna d'acqua al cambio di pressione. Controllare il livello dell'acqua nella siringa. Dovrebbe essere al segno di 25 centimetri.Quindi attendere un minuto per consentire ai polmoni di sgonfiarsi da 25 a 20 centimetri di pressione dell'acqua prima di riavviare la pompa a una portata di 6,5 millilitro al minuto per 10-15 minuti, perfusione fissativa vascolare. Per l'estrazione del tessuto polmonare gonfiato e fisso, legare strettamente il secondo pezzo di filo attorno alla trachea, distale all'adattatore per stub esca e rimuovere l'adattatore per stub esca dalla trachea. Rimuovere l'ago dal cuore e utilizzare forbici smussate per tagliare il tessuto connettivo, posteriore al mediastino, per liberare i polmoni e il cuore dalla cavità toracica avendo cura di evitare di perforare i polmoni.Rimuovere con attenzione il cuore dai polmoni e posizionare i polmoni in 20-25 millilitri di fissativo in un tubo conico da 50 millilitri. Tirare la sutura che tiene la trachea attraverso l'apertura nel tubo conico e fissare la sutura con i fili del cappuccio. Quindi invertire il tubo per garantire che i polmoni galleggianti e gonfiati ad aria rimangano completamente immersi in fissativo ed elaborino i polmoni per studi istologici secondo protocolli standard.Quando il diaframma viene inserito durante la dissezione, l'integrità dello spazio pleurico sarà abolita e i polmoni dovrebbero collassare. Dopo l'applicazione di 25 centimetri di pressione dell'acqua, l'aria entrerà nei polmoni attraverso la trachea e l'inflazione dovrebbe essere facilmente osservata. Una volta che i polmoni si sono completamente espansi, la pressione di gonfiaggio può essere ridotta a 20 centimetri per mantenere i polmoni gonfiati senza sovradistensione.I polmoni devono rimanere gonfiati dopo la legatura tracheale e la rimozione dal torace. La deflazione può verificarsi se i polmoni vengono perforati durante la preparazione dell'animale o l'estrazione polmonare. L'analisi istologica delle sezioni polmonari gonfiate rivela che pochissime cellule immunitarie sono presenti nel lume delle vie aeree dei tessuti fissati utilizzando il tradizionale gonfiaggio a base liquida.Al contrario, le cellule infiammatorie sono conservate all'interno degli spazi aerei dei tessuti fissati tramite perfusione vascolare con gonfiaggio dell'aria. Dopo l'inflazione dell'aria con fissazione della profusione, il tessuto polmonare può essere incorporato nella formalina per il sezionamento del tessuto e la successiva analisi tramite tecniche istologiche, tra cui colorazione, immunoistochimica e imaging immunofluorescente.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

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Ricerca

Neuroscienze

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