In vivo Calcium beeldvorming in muis inferieure olijf

Inferieure olijf is het meest ventrale deel van de medulla en is dus extreem moeilijk te bereiken bij een levend dier. Hier introduceren we een protocol om de volwassen muishersenen aan de ventrale kant bloot te leggen en gebruiken we GRIN-lenzen om neuronale activiteit in de inferieure olijfneuronen op te nemen die calciumsensoren uitdrukken. Deze methode voorkomt schade aan levenskritische hersenstam en maakt onderzoek mogelijk naar ruimtelijk-temporele activiteitspatronen en inputintegratie in de inferieure olijf.

Omdat de operatie wordt uitgevoerd in het complexe keelgebied met veel vitale structuren, is het essentieel dat het wordt uitgevoerd door een onderzoeker met chirurgische vaardigheden op hoog niveau. Bereid een intubatiebuis voor door een 5 tot 6 millimeter lange en 0,8 millimeter brede spleet vanaf de punt van een katheter van 20 gauge te snijden. Bereid een stompe en gebogen naald voor door de punt af te snijden, het breukoppervlak te schuren en te buigen met de tang.

Dit wordt gebruikt om een luchtpijp te ondersteunen tijdens de tracheotomie. Verdun 15 milligram per milliliter ketamine met zoutoplossing tot 15%Assembleer operatiegereedschappen en verbruiksartikelen. Stel het verwarmingskussen in op 38 graden Celsius.

Draai de nosecone 180 graden horizontaal in stereotaxic frame. Weeg de muis waarvan de inferieure olijf eerder werd getransfecteerd door virusdragende GCaMP6's en bereken de hoeveelheid verdunde ketamine voor injectie. Vul de inductiebox voor met 5%isofluraan en verdoof de muis.

Monteer de muis in het stereotaxic frame, ventrale kant naar boven. Scheer de keel en het dijbeen van de muis. Verwijder het resterende haar met ontharingscrème.

Breng xylocaïnegelei aan op de keelhuid. Bewaak de muistemperatuur met een rectale thermische sensor. Injecteer een milliliter voorverwarmde zoutoplossing intraperitoneaal.

Beoordeel de diepte van anesthesie door sterk knijpen op achterhand tenen. Er mag geen detecteerbare reactie worden opgeroepen. Maak een verticale incisie in de keelhuid langs de middellijn.

Scheid de nekhuid van de ingewanden eronder met behulp van een stompe dissectiemethode en snijd de huid af. Bevrijd speekselklieren uit bindweefsel en draai ze zijdelings om om de met sternothyroidspier bedekte luchtpijp bloot te leggen. Injecteer intraperitoneaal de eerste dosis verdunde ketamine met vijf milliliter per kilogram dierlijk gewicht.

Splits de sternothyroid spier voorzichtig langs de middellijn met de punt van een fijne tang om de luchtpijp bloot te leggen. Maak de luchtpijp los van bloedvaten en slokdarm met een tang met behulp van een stompe dissectiemethode. Injecteer een tweede dosis verdunde ketamine met 2,5 milliliter per kilogram dierlijk gewicht.

Steek kruislings een stompe naald onder de luchtpijp. Til de luchtpijp op met de stompe naald. Laat de hechtdraad rond de derde luchtpijpring gaan, de schildklier caudale, met een halve cirkelnaald.

Maak vier instrumentbanden op deze ring. Doorboor de borsthuid met dezelfde halve cirkelnaald en leid de draad door de huid. Til de luchtpijp voorzichtig op met de draad en snijd de luchtpijp cauaudaal naar de schildklier.

Trek de luchtpijp naar de borsthuid. Verhoog de opening van de luchtpijp door er een klein stukje chirurgische spons onder toe te voegen. Verwijder de resterende vloeistof in de openingstip van de luchtpijp met een dunne strook reinigingsweefsel.

Schakel de isofluraanstroom van stereotaxic nosecone naar de intubatiebuis. Steek de intubatiebuis in de luchtpijp. Zorg ervoor dat een deel van de spleet in de buis buiten de luchtpijp blijft om te ademen.

Bevestig de luchtpijp aan de borsthuid van de muis door drie tot vier instrumentbanden te maken. Bind de luchtpijp vast met de hechtdraad om de intubatiebuis vast te maken. Snijd de sternothyroid spier langs de spiervezels met de fijne tang.

Knip het geïsoleerde deel af met de veerschaar. Bevrijd zorgvuldig overgebleven luchtpijp en strottenhoofd van de spier om de schade aan bloedvaten in de spier te minimaliseren. Verwijder overgebleven luchtpijp en strottenhoofd.

Bevrijd de slokdarm van bevestigd weefsel met een tang en snijd deze af met een veerschaar. Verwijder de longitudinale spier die de hersenstam en de ventrale boog van de atlas bedekt. Verwijder de spier die de atlasventerale boog en de voorste knol bedekt.

Knip de ventrale bogen van atlas met de rongeur. Verwijder de voorste knol van de atlas. Verwijder het bloed en de vloeistof om het foramen magnum en de hersenstam te bekijken.

Breid het foramen magnum uit door het achterhoofdsbeen te verwijderen met de rongeur. Verwijder het kraakbeen en pel voorzichtig de periosteale laag van de dura mater met de fijne tang om een duidelijk zicht op de ventrale hersenstam te hebben. Klem de SpO2-sensor op de dij van de muis om vitale functies zoals hartslag, zuurstofverzadiging en ademfrequentie te controleren.

Monteer de GRIN-lens op de implantatiestaaf. Reinig de lens zorgvuldig met 70% met ethanol doordrenkt reinigingsweefsel. Bevestig de implantatiestaaf op het stereotaxic frame en monteer de miniatuurmicroscoop op de implantatiestaaf.

Voeg enkele druppels zoutoplossing toe in het hersenstamgebied voor onderdompeling van de GRIN-lens. Benader de hersenstam met de GRIN lens. GCaMP6's die inferieure olijfneuronen in het oppervlakkige gebied uitdrukken, zijn te vinden in een rechthoekvormig gebied, ongeveer 0,5 tot 1,7 millimeter rostral tot de resterende atlas en ongeveer 2,6 tot 1,1 millimeter lateraal tot de middellijn.

Schakel de excitatie blauwe LED in miniatuurmicroscoop in om GCaMP6s getransfecteerde inferieure olijfneuronen te lokaliseren. De neuronen vertonen verschillende basislijn fluorescentie intensiteit als gevolg van verschillende GCaMP6s expressie niveau. De verandering van het calciumgehalte van omcirkelde inferieure olijfneuron somata in de video aan de linkerkant zal ons delta F laten zien, gedeeld door F-sporen aan de rechterkant.

Hoewel de muis warm en gehydrateerd wordt gehouden, zal deze onvermijdelijk worden verzwakt door langdurige anesthesie en chirurgie. Het is essentieel om de duur van de operatie kort te houden, zodat de fysieke conditie van de muis goed is voor het opnemen. Een ervaren onderzoeker kan de operatie in 70 minuten afmaken.

Deze methode, met modificaties, kan worden gebruikt om andere aangrenzende gebieden van de ventrale hersenstam te bestuderen.