זית נחות הוא החלק הגחוני ביותר של המדולה, ולכן קשה מאוד להגיע לחיה חיה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחשוף את גזע המוח של העכבר הבוגר מהצד הגחוני, ולהשתמש בעדשות GRIN כדי לתעד פעילות עצבית בנוירוני הזית הנחותים המבטאים חיישני סידן. שיטה זו מונעת פגיעה בגזע המוח הקריטי לחיים, ומאפשרת חקירות של דפוסי פעילות מרחבית-זמנית ושילוב קלט בזית הנחות.
מאז הניתוח מבוצע באזור הגרון המורכב עם מבנים חיוניים רבים, זה חיוני כי הוא מנוהל על ידי חוקר עם מיומנויות כירורגיות ברמה גבוהה. הכן צינור אינטובציה על ידי חיתוך 5 עד 6 מילימטר ארוך ו 0.8 מילימטר רחב חריץ מקצה קטטר 20 מד. מכינים מחט קהה ומעוגלת על ידי חיתוך הקצה, חול משטח השבר, לכופף אותו עם הצבת.
זה ישמש כדי לתמוך קנה הנשימה במהלך קנה הנשימה. לדלל 15 מיליגרם לכל קטמין מיליליטר עם מלוחים ל 15%להרכיב כלי ניתוח מתכלים. הגדר כרית חימום ל 38 מעלות צלזיוס.
סובב את האף ב-180 מעלות אופקית במסגרת סטראוטקסית. לשקול את העכבר שהזית הנחות שלו היה חתוך בעבר על ידי GCaMP6s נושא וירוס, ולחשב את כמות קטמין מדולל להזרקה. תיבת אינדוקציה למילוי מראש ב- 5%isoflurane והמרדמה של העכבר.
טען את העכבר במסגרת הסטראוטקסית, בצד הגחוני כלפי מעלה. לגלח את גרונו של העכבר ואת אזור הירך. הסר את השיער שיורית עם קרם להסרת שיער.
למרוח ג'לי קסילוקאין על עור הגרון. נטר את טמפרטורת העכבר באמצעות חיישן תרמי רקטלי. להזריק מיליליטר אחד מראש מחומם מלוחים תוך-פרטנית.
להעריך את עומק ההרדמה על ידי צביטה חזקה על בהונות hindlimb. אין לעורר תגובה הניתנת לגילוי. בצע חתך אנכי בעור הגרון לאורך קו האמצע.
יש להפריד את עור הצוואר מפני הקרביים שמתחתו באמצעות שיטת ניתוח קהה ולחתוך את העור. בלוטות רוק חינם מרקמת חיבור, ולהפוך אותם לרוחב כדי לחשוף את קנה הנשימה מכוסה שרירים sternothyroid. תוך-פרטית להזריק את המנה הראשונה של קטמין מדולל בחמישה מיליליטר לקילוגרם של משקל בעלי חיים.
בזהירות לפצל שריר עצם החזה לאורך קו האמצע עם קצה של מלקחיים בסדר לחשוף קנה הנשימה. נתק קנה הנשימה מכלי הדם והוושט עם מלקחיים בשיטת ניתוח בוטה. להזריק מנה שנייה של קטמין מדולל ב 2.5 מיליליטר לקילוגרם של משקל בעלי חיים.
תכניסו מחט קהה מתחת לקנה הנשימה. הרם קנה הנשימה עם המחט הקהה. הפוך את חוט התפירה ללכת סביב טבעת קנה הנשימה השלישית, caudal בלוטת התריס, עם מחט חצי עיגול.
תעשה ארבעה קשרים על הטבעת הזאת. לנקב את עור החזה עם אותה מחט חצי עיגול ולהוביל את החוט דרך העור. בעדינות להרים את קנה הנשימה עם החוט, לחתוך את קנה הנשימה caudal לבלוטת התריס.
משוך את קנה הנשימה לכיוון עור החזה. הרם את פתיחת קנה הנשימה על ידי הוספת חתיכה קטנה של ספוג כירורגי מתחתיה. הסר כל נוזל שנותר בתוך קצה הפתיחה של קנה הנשימה עם רצועה דקה של רקמת ניקוי.
העבר את זרימת ה- isoflurane מאף סטראוטקסי לצינור הצנרור. הכנס את צינור הצנרור לקנה הנשימה. ודא שחלק מהסיד בצינור נשאר מחוץ לקנה הנשימה כדי לאפשר נשימה.
לתקן את קנה הנשימה לעור החזה של העכבר על ידי ביצוע שלושה עד ארבעה קשרים מכשיר. לקשור את קנה הנשימה עם חוט התפר כדי לאבטח את צינור אינטובציה. חתך את שריר העצם לאורך סיבי השריר עם מלקחיים עדינים.
חותכים את החלק המבודד עם מספריים האביב. בזהירות חינם שאריות קנה הנשימה וגרון מן השריר כדי למזער את הנזק על כלי הדם בשריר. הסר שאריות קנה הנשימה וגרון.
ושט חינם מרקמות מחוברות עם מלקחיים לחתוך אותו עם מספריים באביב. הסר את שריר האורך המכסה את גזע המוח ואת הקשת הגחונית של האטלס. הסר את השריר המכסה את קשת הגחון האטלס ואת פקעת קפם.
חותכים את קשתות הגחון של האטלס עם rongeur. הסר את פקעת האטלס החיצונית. הסר את הדם והנוזל כדי להציג את מגנום פורמן ואת גזע המוח.
הרחב את מגנום המזחלות על ידי הסרת עצם העורף עם הרונגור. הסר את הסחוס, ולקלף בזהירות את השכבה periosteal של דורה מאטר עם מלקחיים עדינים יש תצוגה ברורה של גזע המוח הגחוני. מהדק את חיישן SpO2 על הירך של העכבר כדי לפקח על סימנים חיוניים כגון קצב הלב, רוויית חמצן וקצב נשימה.
הר את עדשת GRIN על מוט ההשתלה. נקה את העדשה בזהירות עם רקמת ניקוי ספוגה באתנול של 70%. לתקן את מוט ההשתלה על מסגרת סטראוטקסית ולהרכיב את המיקרוסקופ המיניאטורי על מוט ההשתלה.
הוסף כמה טיפות של מלוחים באזור גזע המוח לטבילה של עדשת GRIN. התקרב לגזע המוח עם עדשת GRIN. GCaMP6s המבטא נוירוני זית נחותים באזור השטחי ניתן למצוא באזור בצורת מלבן, על 0.5 עד 1.7 מילימטר rostral אטלס הנותרים, ועל 2.6 כדי 1.1 מילימטר לרוחב לקו האמצע.
הפעל את הנורית הכחולה של העירור במיקרוסקופ מיניאטורי כדי לאתר נוירוני זית נחותים של GCaMP6s. הנוירונים מראים עוצמת פלואורסצנטיות בסיסית שונה עקב רמת ביטוי GCaMP6s שונים. השינוי של רמת הסידן של סומטה נוירון זית נחות בעיגול בסרטון בצד שמאל יראה לנו דלתא F מחולק על ידי עקבות F בצד ימין.
למרות העכבר נשמר חם hydrated, זה יהיה בהכרח נחלש על ידי הרדמה ממושכת וניתוח. זה חיוני כדי לשמור על משך הניתוח קצר כך מצב פיזי העכבר יהיה טוב להקלטה. חוקר מיומן יכול לסיים את הניתוח בתוך 70 דקות.
שיטה זו, עם שינויים, ניתן להשתמש כדי ללמוד אזורים סמוכים אחרים של גזע המוח הגחוני.
