Name: a method to preserve wetland roots and rhizospheres for elemental imaging
Uploaded: 2021-02-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging at JoVE.com

De auteurs erkennen een gezamenlijke zaadbeurs aan Seyfferth en Tappero om de samenwerking tussen de Universiteit van Delaware en het Brookhaven National Laboratory te ondersteunen. Delen van dit onderzoek maakten gebruik van de XFM (4-BM) Beamline van de National Synchrotron Light Source II, een Amerikaanse Office of Science User Facility van het Amerikaanse Department of Energy (DOE) die in het kader van contractnr. DE-SC0012704.

1. Voorbereiding van slam-freezing apparatuur
<ol><li>Plaats twee koperen blokken (~ 5 cm x 5 cm x 15 cm) horizontaal in een schone koeler die vloeibare stikstof kan vasthouden en giet voldoende vloeibare stikstof om de blokken onder te dompelen. Zodra het borrelen afneemt, plaatst u twee afstandhouders bovenop één koperen blok aan elk uiteinde. OPMERKING: De hoogte van de afstandsbalk bepaalt de hoogte van het te vriezen monster; in dit voorbeeld wordt een afstand van 2 cm gebruikt om kubussen van ongeveer 3 cm x...

Dit artikel beschrijft een protocol voor het verkrijgen van geconserveerde bulkgrond + rhizobolletjes van natlandplantwortels met behulp van een slam-freezing-techniek die kan worden gebruikt voor elementaire beeldvorming en / of chemische speciatiemapping.
Er zijn verschillende voordelen van deze methode ten opzichte van bestaande methoden. Ten eerste maakt deze methode het gelijktijdige onderzoek van wortels en de omliggende rhizosfeer mogelijk. Momenteel bestaan er methoden om wortels uit h...

Wortels en hun rhizosfeer zijn dynamisch, heterogeen en van cruciaal belang om te begrijpen hoe planten minerale voedingsstoffen en verontreinigingen verkrijgen1,2,3. Wortels zijn de primaire route waarmee nutriënten (bijv. fosfor) en verontreinigingen (bijv. arseen) van de bodem naar planten gaan en dus heeft het begrijpen van dit proces implicaties voor de voedselhoeveelheid en -kwaliteit, de werking van het ecosysteem en fytoremediatie. Wortels zijn echter dynamisch in ruimte en tijd die groeien als reactie op behoeften om voedingsstoffen te verkrijgen en ze variëren vaak in functie, diameter en structuur (bijv. zijwortels, onvoorziene wortels, wortelharen)2. Heterogeniteit van wortelsystemen kan worden bestudeerd op ruimtelijke schalen van cellulair tot ecosysteemniveau en op temporele schalen van elk uur tot decadal. De dynamische en heterogene aard van wortels en hun omringende bodem, of rhizosfeer, vormt dus uitdagingen voor het vastleggen van rhizosfeerchemie in de loop van de tijd. Ondanks deze uitdaging is het noodzakelijk om wortels in hun bodemomgeving te bestuderen om deze kritische plant-bodemrelatie te karakteriseren.
De rhizosfeerchemie van wetlandplanten is bijzonder uitdagend om te onderzoeken vanwege steile zuurstofgradiënten die bestaan van bulkgrond naar de wortels, die veranderen in ruimte en tijd. Omdat wortels zuurstof nodig hebben om te respire, hebben wetlandplanten zich aangepast aan de zuurstofarme omstandigheden van wetlandgronden door aerenchym4,5te creëren. Aerenchym zijn uitgeholde corticale weefsels die zich uitstrekken van scheuten tot wortels, waardoor de verspreiding van lucht door de plant in de wortels mogelijk is. Een deel van deze lucht lekt echter in de rhizosfeer in minder gesuberiseerde delen van de wortels, met name in de buurt van laterale wortelverbindingen, minder volwassen wortelpunten en rekzones6,7,8,9. Dit radiale zuurstofverlies creëert een geoxideerde zone in de rhizosfeer van wetlandplanten die de rhizosfeer (bio-geo)chemie beïnvloedt en verschilt van de gereduceerde bulkgrond10,11,12. Om het lot en transport van voedingsstoffen en verontreinigingen in wetland rhizospheres en wortels te begrijpen, is het van cruciaal belang om de chemisch gereduceerde bulkgrond, de geoxideerde rhizosfeer en wortels van wetlandplanten te behouden voor analyse. Omdat de bulkgrond echter verminderde bodembestanddelen bevat die zuurstofgevoelig zijn, moeten wortel- en bodemconserveringsmethoden wortelstructuren behouden en zuurstofgevoelige reacties minimaliseren.
Er bestaan methoden om plantenweefsels te fixeren en de ultrastructuur te behouden voor beeldvorming, maar deze methoden kunnen niet worden toegepast om wortels die in wetlandgrond groeien chemisch te behouden. Voor onderzoeken waarbij alleen de elementaire verdeling binnen plantencellen gewenst is, worden planten doorgaans hydroponisch gekweekt en kunnen wortels gemakkelijk uit de oplossing worden verwijderd, worden bevestigd onder hogedrukbevriezing en vriessubstitutie en worden gesectied voor een verscheidenheid aan beeldvormingstoepassingen, waaronder secundaire ionenmassaspectrometrie met hoge resolutie (nanoSIMS), elektronenmicroscopie en synchrotron x-ray fluorescentie (S-XRF) analyse13, 14,15. Om Fe-plaque aan de buitenkant van wetlandwortels te onderzoeken, moeten deze hydrocultuurstudies kunstmatig fe plaquevorming induceren in oplossing16, die niet nauwkeurig de heterogeniteit van de distributie en minerale samenstelling van Fe-plaquevorming en bijbehorende elementen in situ17,18,19,20 weergeeft. Er bestaan methoden om wetlandgrond en bijbehorende micro-organismen te behouden met vriescoring21, maar het is moeilijk om wortels te verkrijgen met deze techniek. De huidige methoden om wortels in de bodem en hun rhizosferische chemie te visualiseren bestaan uit twee primaire meettypen: elementaire fluxen en totale elementaire concentratie (en speciatie). De eerste wordt meestal gemeten met behulp van diffusieve gradiënten in dunne films (DGT)22,23,24, waarbij grond in rhizoboxen wordt geplaatst om de plantengroei in een laboratoriumomgeving te ondersteunen en labiele elementen in de grond diffuus door een gel in een bindingslaag. Deze bindingslaag kan vervolgens worden afgebeeld om de labiele elementen van belang te kwantificeren. Deze techniek kan met succes relaties tussen wortels en de rhizosfeer24,25,26,27illustreren , maar artefacten van wortelgebonden kunnen bestaan door planten in rhizoboxen te kweken, en informatie over het wortelinterieur wordt niet vastgelegd met DGT. Dit laatste omvat het bemonsteren van de wortels en de rhizosfeer, het behoud van het monster en het direct analyseren van de elementaire verdeling op een monstersectie. Voor deze milieubemonstering van de wortels van wetlandplanten en hun omringende rhizosfeer is een zorgvuldige monsterbehandeling vereist om artefacten van monstervoorbereiding te voorkomen.
Hier wordt een protocol beschreven dat wortelstructuren en rhizosfeerchemie van wetlandplanten effectief behoudt door invriezen en vriesdrogen. Flash-freezing kan de transformaties van zuurstofgevoelige oplossingen drastisch vertragen, maar kan wortels beschadigen en mobilisatie veroorzaken wanneer monsters uitdrogen. Slam-freezing waarbij het monster wordt ingevroren tussen koperblokken die voorgekoeld zijn met vloeibare stikstof, minimaliseert echter wortelschade en monstervervorming28. De geconserveerde monsters worden vervolgens ingebed in een epoxyhars die As speciation20,29 behoudt en kan worden gesneden en gepolijst voor beeldvorming van wortels in hun rhizosfeergrond. De monsters in dit rapport werden geanalyseerd door S-XRF chemische speciatie beeldvorming na dunne doorsnede. Er kunnen echter ook andere beeldvormingstechnieken worden gebruikt, waaronder laserablatie-inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (LA-ICP-MS), deeltjesgeïnduceerde röntgenemissie (PIXE), secundaire ionenmassaspectrometrie (SIMS) en laser geïnduceerde breakdown spectroscopie (LIBS) beeldvorming.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Copper blocks</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>89275K42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond blade</td>
			<td>Buehler</td>
			<td>15 LC, 102 mm x 0.3 mm</td>
			<td>operation speed: 225 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy forms</td>
			<td>Struers</td>
			<td>40300085</td>
			<td>FixiForm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Epotek</td>
			<td>301-2FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin sectioning machine</td>
			<td>Buehler</td>
			<td>PetroThin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet saw</td>
			<td>Buehler</td>
			<td>IsoMet 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to preserve wetland roots and rhizospheres for elemental imaging

Wortels werken veel samen met hun bodemomgeving, maar het visualiseren van dergelijke interacties tussen wortels en de omringende rhizosfeer is een uitdaging. De rhizosfeerchemie van wetlandplanten is bijzonder uitdagend om vast te leggen vanwege steile zuurstofgradiënten van de wortels naar de bulkgrond. Hier wordt een protocol beschreven dat de wortelstructuur en rhizosfeerchemie van wetlandplanten effectief behoudt door invriezen en vriesdrogen. Slam-freezing, waarbij het monster wordt ingevroren tussen koperblokken voorgekoeld met vloeibare stikstof, minimaliseert wortelschade en monstervervorming die kan optreden bij flitsvriezen terwijl chemische speciatieveranderingen nog steeds worden geminimaliseerd. Hoewel monstervervorming nog steeds mogelijk is, verhoogt de mogelijkheid om snel en met minimale kosten meerdere monsters te verkrijgen het potentieel om bevredigende monsters te verkrijgen en optimaliseert het de beeldvormingstijd. De gegevens tonen aan dat deze methode succesvol is in het behoud van gereduceerde arseensoorten in rijstwortels en rhizobolletjes geassocieerd met ijzerplaques. Deze methode kan worden toegepast voor studies van plant-bodemrelaties in een breed scala aan wetlandomgevingen die de concentratie omvatten, variërend van sporen-element fietsen tot fytoremediatietoepassingen.

Deze methode maakt het mogelijk om wortels en chemische soorten te behouden in de wortels en rhizosfeer van wetlandplanten en in de bulkgrond. In dit werk werd de methode gebruikt om as speciatie en co-lokalisatie met Fe- en Mn-oxiden en plantaardige voedingsstoffen in de rhizosfeer van rijst(Oryza sativa L.) te evalueren. Rijst werd geteeld in de RICE Facility van de Universiteit van Delaware, waar 30 rijstvelden (elk 2 m x 2 m, 49 planten) worden gebruikt om rijst te verbouwen onder verschillende bodem- en wat...

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging at JoVE.com

A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging

We beschrijven een protocol om intacte wortels en de omliggende rhizosfeergrond uit wetlandomgevingen te bemonsteren, te behouden en te doorsnijden met rijst(Oryza sativa L.) als modelsoort. Eenmaal bewaard, kan het monster worden geanalyseerd met behulp van elementaire beeldvormingstechnieken, zoals synchrotron x-ray fluorescentie (XRF) chemische speciatie beeldvorming.

Een methode om wetlandwortels en rhizosfeer te behouden voor elementaire beeldvorming

Roots extensively interact with their soil environment but visualizing such interactions between roots and the surrounding rhizosphere is challenging. The ...

Deze methode biedt onderzoekers een nieuwe manier om waterplantenwortels, de omringende rhizosfeer en bulkgrond voor te bereiden op elementaire beeldvormingstechnieken. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het relatief snel en betaalbaar is, terwijl het ook de distributie en speciatie van elementen van belang nauwkeurig behoudt. Deze techniek kan worden gebruikt om vragen te beantwoorden over veel elementen en plantensystemen, van nutriënten in landbouwsystemen tot het lot en transport van verontreinigingen in fettermiatiesystemen.Zorg ervoor dat u snel werkt, terwijl u ook rekening houdt met het gewenste gebied of de gebieden van het wortelstelsel voor bemonstering. En neem meerdere monsters per wortelstelsel. Om de slam-vriesapparatuur voor te bereiden op een experiment, plaatst u twee, vijf bij vijf bij 15 centimeter koperblokken horizontaal in een schone koeler die vloeibare stikstof kan vasthouden.En met de juiste PBM giet je voldoende vloeibare stikstof in de koeler om de blokken onder te dompelen. Zodra het borrelen afneemt, plaatst u één afstandsbalk op elk uiteinde van één koperen blok. Vervolgens, met behulp van tangen en cryogene handschoenen, zet de andere koperen blog aan het einde om het ophalen gemakkelijker te maken wanneer het monster op zijn plaats is.Om het monster te verzamelen, gebruikt u een potplant of gebruikt u een schop om de gewenste plant en rhizosfeer uit de natte grond te extraheren, waarbij u ervoor zorgt dat het gegraven gat veel groter is dan het gewenste wortelvolume. Gebruik een stalen mes om overtollige grond weg te snijden en zorg ervoor dat de grond binnen het gewenste gebied niet wordt verstoord. Wanneer de gewenste gebieden reiken, snijdt u een wortelkubus van ongeveer drie bij drie bij twee centimeter en plaatst u de kubus onmiddellijk tussen de twee afstandhouders op het horizontale koperen blok.Voor een slam bevriezing van het monster, gebruikte de cryogene handschoenen om het verticale koperen blok ongeveer vijf minuten op de afstandhouders te plaatsen. Wanneer de borrelende bodems het slam bevroren rhizosfeerkubusmonster overbrengen in een stuk voorgelabeld aluminiumfolievierkant. Om de grondblokjes in te vriezen, wanneer de vriesdroger de juiste vacuümdruk en temperatuur heeft bereikt, plaatst u een bevroren rhizosfeerkubusmonster voor schone en zuur gewassen buis van 50 milliliter of rechtstreeks in de vriesdroger en gebruikt u een schoon wegwerpdoekje om te voorkomen dat stof in de vacuümpomp komt.Plaats de monsters ten minste enkele dagen in het vriesdrogervat tot ze droog zijn. Wanneer de weefsels zijn gevriesdroogd, gebruikt u een stalen mes om grondblokjes op een geschikte grootte voor de analyse te drogen voordat u de kubussen in gelabelde vormen in een vacuümdesiccator plaatst. Na het bereiden van epoxy volgens de instructies van de fabrikant, gebruikt u een druppelaar om langzaam epoxy toe te voegen aan de vorm aan één kant van de grond, totdat de epoxy het monster volledig bedekt.De grond wordt donkerder naarmate de epoxy de grond nat maakt. Zodra de vormen zijn gevuld met epoxy, sluit u de desiccator en schakelt u het vacuüm in. Controleer het niveau van een epoxy elke 30 tot 90 minuten gedurende de eerste 1 tot 4 uur en voeg indien nodig extra epoxy toe.Zodra de epoxy is uitgehard, verwijdert u het monster. Gebruik na het insluiten een diamantblad precisie natte zaag om het monster te zagen. Snijd het monster in een andere richting als er bij de vorige snede geen wortels zijn verkregen.Schuur na het trimmen de gesneden kant van elk monster handmatig met progressief fijner schuurpapier gedurende 30 seconden per korrelgrootte. In deze figuur kunnen verschillende worteldiameters in de bodemmatrix worden waargenomen als dwarsdoorsneden. De wortels kunnen verschillende kwaliteitsniveaus vertonen.In deze afbeelding kan bijvoorbeeld een goed bewaarde wortel, een wortel vervormd door het vriesdroogproces en een wortel die tijdens het dunne doorsnedeproces is uitgetrokken, worden waargenomen. Analyse van deze wortel dwarsdoorsnede met een laterale wortel in longitudinale sectie door synchrotron x-ray fluorescentie beeldvorming zoals aangetoond maakt de detectie van ijzer, mangaan en arseen mogelijk. De aanwezigheid van ijzer in de grond en rond de wortel in de ijzerplaquette is ook zichtbaar in de lichtmicrograafbeelden.Mangaan is uniek aanwezig in de cortex van de laterale wortel, maar lokaliseert ook met ijzer in sommige gebieden binnen de ijzerplaque als een groenblauwe tint. Arseen wordt meestal gevonden in de vasculatuur van de laterale wortel die samensmelt in de vasculatuur van de primaire wortel. Chemische speciatie beeldvorming onthult een variabiliteit in de lokalisatie van de arseensoort.Zoals waargenomen in deze driekleurige plot, zijn arsenite en arsenite glutathion nauw verbonden in de vasculatuur, terwijl arseen voornamelijk lokaliseert binnen de buitenkant van de wortel, geassocieerd met de ijzerplaque. Bepaal voorafgaand aan de monsterverzameling het gewenste deel van het wortelstelsel voor elementaire beeldvorming. Dit bepaalt de locatierichting van de verwijderde hoofdsleutel.Volgens dit protocol kunnen monsters op micronschaal of grover worden afgebeeld met behulp van verschillende technieken, afhankelijk van de specifieke onderzoeksvragen, elementen van het belang of beschikbare instrumentatie.

Research

JoVE Journal

Environment

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

Een snelle en efficiënte methode voor het beoordelen van pathogeniteit van Ustilago maydis op maïs- en teosintelijnen

Maize is a major cereal crop worldwide. However, susceptibility to biotrophic pathogens is the primary constraint to increasing productivity. U. maydis is ...

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

Een eenvoudige methode voor Automated Solid Phase Extraction van watermonsters voor immunologische Analyse van Kleine verontreinigende stoffen

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

Reliable Method for Assessing Seed Germination, Dormancy, and Mortality under Field Conditions

Betrouwbare methode voor het beoordelen van zaadkieming, zaadrust en Sterfte onder veldomstandigheden

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester ...

A Method for Evaluating Insecticide Efficacy against Bed Bug, Cimex lectularius, Eggs and First Instars

A Method for Evaluating Insecticide Efficacy against Bed Bug,  Cimex lectularius, Eggs and First Instars

Een methode voor het evalueren van Insecticide werkzaamheid tegen Bed Bug,<em&gt; Cimex lectularius</em&gt;, Eieren en First stadia

Standard toxicity evaluations of insecticides against insect pests are primarily conducted on adult insects. Evaluations are based on a dose-response or ...

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Ecotoxicologische methode met mariene bacteriën<em&gt; Vibrio anguillarum</em&gt; De acute toxiciteit van milieuverontreinigende stoffen beoordelen

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Meten en in kaart brengen van patronen van bodemerosie en afzetting aan de bodem carbonaat concentraties onder beheer van de landbouw gerelateerde

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

RGB- en spectrale Root Imaging voor Plant fenotypering en fysiologisch onderzoek: experimentele opzet en Imaging protocollen

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

A Novel Method for the Pentosan Analysis Present in Jute Biomass and Its Conversion into Sugar Monomers Using Acidic Ionic Liquid

Een nieuwe methode voor de analyse van de Pentosan aanwezig in Jute biomassa en de omzetting in suiker monomeren met zure Ionische vloeistof

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, ...

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Oogsten van Venom toxines uit Assassin insecten en andere Heteropteran insecten

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Isolatie en analyse van microbiële gemeenschappen in bodem, rhizosfeer en wortels in de overblijvende gras experimenten

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...