Name: a method to preserve wetland roots and rhizospheres for elemental imaging
Uploaded: 2021-02-15T14:00:00
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Die Autoren würdigen einen gemeinsamen Seed-Grant für Seyfferth und Tappero, um die Zusammenarbeit zwischen der University of Delaware und dem Brookhaven National Laboratory zu unterstützen. Teile dieser Forschung verwendeten die XFM (4-BM) Beamline der National Synchrotron Light Source II, einer U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science User Facility, die für das DOE Office of Science vom Brookhaven National Laboratory unter Vertragsnummer betrieben wird. DE-SC0012704.

1. Herstellung von Slam-Freezing-Geräten
<ol><li>Legen Sie zwei Kupferblöcke (~ 5 cm x 5 cm x 15 cm) horizontal in einen sauberen Kühler, der flüssigen Stickstoff halten kann, und gießen Sie genug flüssigen Stickstoff, um die Blöcke unterzutauchen. Sobald das Sprudeln nachlässt, platzieren Sie zwei Abstandshalter auf einem Kupferblock an jedem Ende. HINWEIS: Die Abstandhalterhöhe bestimmt die Höhe der einzufrierenden Probe. In diesem Beispiel wird ein Abstandshalter von 2 cm verwendet, um Würfel von ca. 3...

Dieses Papier beschreibt ein Protokoll zur Gewinnung von konserviertem Massenboden + Rhizosphären von Feuchtgebietspflanzenwurzeln mit einer Slam-Freezing-Technik, die für elementare Bildgebung und / oder chemische Artbildungskartierung verwendet werden kann.
Es gibt mehrere Vorteile dieser Methode gegenüber bestehenden Methoden. Erstens ermöglicht diese Methode die gleichzeitige Untersuchung von Wurzeln und den umgebenden Rhizosphären. Derzeit gibt es Methoden, um Wurzeln aus ihrer Boden...

Wurzeln und ihre Rhizosphären sind dynamisch, heterogen und von entscheidender Bedeutung für das Verständnis, wie Pflanzen mineralische Nährstoffe und Verunreinigungen erhalten1,2,3. Wurzeln sind der primäre Weg, über den Nährstoffe (z. B. Phosphor) und Verunreinigungen (z. B. Arsen) vom Boden zu den Pflanzen gelangen, und daher hat das Verständnis dieses Prozesses Auswirkungen auf die Quantität und Qualität der Nahrung, die Funktionsweise des Ökosystems und die Phytoremediation. Wurzeln sind jedoch in Raum und Zeit dynamisch und wachsen als Reaktion auf den Nährstoffaufnahmebedarf und variieren oft in Funktion, Durchmesser und Struktur (z. B. Seitenwurzeln, zufällige Wurzeln, Wurzelhaare)2. Die Heterogenität von Wurzelsystemen kann auf räumlichen Skalen von zellulärer bis Ökosystemebene und auf zeitlichen Skalen von stündlich bis dekadisch untersucht werden. Daher stellt die dynamische und heterogene Natur der Wurzeln und ihres umgebenden Bodens oder der Rhizosphäre eine Herausforderung für die Erfassung der Rhizosphärenchemie im Laufe der Zeit dar. Trotz dieser Herausforderung ist es unerlässlich, Wurzeln in ihrer Bodenumgebung zu untersuchen, um diese kritische Pflanzen-Boden-Beziehung zu charakterisieren.
Die Rhizosphärenchemie von Feuchtgebietspflanzen ist aufgrund steiler Sauerstoffgradienten, die vom Massenboden bis zu den Wurzeln bestehen und sich räumisch und zeitweise verändern, besonders schwierig zu untersuchen. Da Wurzeln Sauerstoff zum Atmen benötigen, haben sich Feuchtgebietspflanzen an die sauerstoffarmen Bedingungen von Feuchtgebieten angepasst, indem sie Aerenchym4,5geschaffen haben. Aerenchyme sind ausgehöhlte kortikale Gewebe, die sich von Trieben bis zu Wurzeln erstrecken und die Diffusion von Luft durch die Pflanze in die Wurzeln ermöglichen. Ein Teil dieser Luft tritt jedoch in weniger suberisierten Teilen der Wurzeln in die Rhizosphäre aus, insbesondere in der Nähe von seitlichen Wurzelverbindungen, weniger reifen Wurzelspitzen und Dehnungszonen6,7,8,9. Dieser radiale Sauerstoffverlust erzeugt eine oxidierte Zone in der Rhizosphäre von Feuchtgebietspflanzen, die die Rhizosphäre (Bio-Geo)Chemie beeinflusst und sich von dem reduzierten Massenboden10,11,12unterscheidet. Um das Schicksal und den Transport von Nährstoffen und Schadstoffen in Feuchtgebietsrhizosphären und -wurzeln zu verstehen, ist es wichtig, den chemisch reduzierten Massenboden, die oxidierte Rhizosphäre und die Wurzeln von Feuchtgebietspflanzen für die Analyse zu erhalten. Da der Massenboden jedoch reduzierte Bodenbestandteile enthält, die sauerstoffempfindlich sind, müssen Wurzel- und Bodenerhaltungsmethoden Wurzelstrukturen erhalten und sauerstoffempfindliche Reaktionen minimieren.
Es gibt Methoden, um Pflanzengewebe zu fixieren und die Ultrastruktur für die Bildgebung zu erhalten, aber diese Methoden können nicht angewendet werden, um Wurzeln, die in Feuchtgebieten wachsen, chemisch zu erhalten. Für Untersuchungen, bei denen nur die Elementverteilung innerhalb von Pflanzenzellen erwünscht ist, werden Pflanzen typischerweise hydroponisch gezüchtet und Wurzeln können leicht aus der Lösung entfernt, unter Hochdruckgefrier- und Gefriersubstitution fixiert und für eine Vielzahl von bildgebenden Anwendungen unterteilt werden, einschließlich hochauflösender Sekundärionen-Massenspektrometrie (NanoSIMS), Elektronenmikroskopie und Synchrotron-Röntgenfluoreszenzanalyse (S-RFA)13. 14,15. Um Fe-Plaque an der Außenseite von Feuchtgebietswurzeln zu untersuchen, müssen diese hydroponischen Studien die Fe-Plaque-Bildung in Lösung16künstlich induzieren, was die Heterogenität der Verteilung und Mineralzusammensetzung der Fe-Plaque-Bildung und der zugehörigen Elemente in situ nicht genau darstellt17,18,19,20. Es gibt Methoden, um Feuchtgebiete und zugehörige Mikroorganismen mit Gefrierkernung21zu erhalten, aber es ist schwierig, mit dieser Technik Wurzeln zu erhalten. Aktuelle Methoden zur Visualisierung von Wurzeln, die im Boden wachsen, und ihre rhizosphärische Chemie bestehen aus zwei primären Messtypen: Elementflussen und Gesamtelementkonzentration (und Artbildung). Ersteres wird typischerweise mit diffusiven Gradienten in dünnen Schichten (DGT)22,23,24)gemessen,in denen Erde in Rhizoboxen gelegt wird, um das Pflanzenwachstum in einer Laborumgebung zu unterstützen, und labile Elemente im Boden durch ein Gel in eine Bindungsschicht diffundieren. Diese Bindungsschicht kann dann abgebildet werden, um die labilen Elemente von Interesse zu quantifizieren. Diese Technik kann erfolgreich Beziehungen zwischen Wurzeln und der Rhizosphäre24,25,26,27veranschaulichen, aber Artefakte aus der Wurzelbindung können durch das Wachstum von Pflanzen in Rhizoboxen existieren, und Informationen über das Wurzelinnere werden mit DGT nicht erfasst. Letzteres beinhaltet die Probenahme der Wurzeln und der Rhizosphäre, die Konservierung der Probe und die direkte Analyse der Elementverteilung auf einem Probenabschnitt. Für diese Umweltprobenahme von Feuchtgebietspflanzenwurzeln und ihrer umgebenden Rhizosphäre ist ein sorgfältiger Probenhandling erforderlich, um Artefakte aus der Probenvorbereitung zu vermeiden.
Hier wird ein Protokoll beschrieben, das Wurzelstrukturen und Rhizosphärenchemie von Feuchtgebietspflanzen durch Slam-Freezing und Gefriertrocknung effektiv erhält. Das Schockgefrieren kann die Umwandlung sauerstoffempfindlicher gelöster Stoffe drastisch verlangsamen, kann jedoch die Wurzeln schädigen und eine Mobilisierung verursachen, wenn die Proben austrocknen. Das Slam-Freezing, bei dem die Probe zwischen kupfergekühlten, mit flüssigem Stickstoff vorgekühlten Kupferblöcken eingefroren wird, minimiert jedoch Wurzelschäden und Probenverzerrungen28. Die konservierten Proben werden dann in ein Epoxidharz eingebettet, das die Artbildung20,29 konserviert und für die Abbildung von Wurzeln in ihrem Rhizosphärenboden geschnitten und poliert werden kann. Die Proben in diesem Bericht wurden mittels S-RFA-Bildgebung der chemischen Artbildung nach Dünnschnitt analysiert. Es könnten jedoch auch andere bildgebende Verfahren verwendet werden, darunter Laserablations-induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (LA-ICP-MS), partikelinduzierte Röntgenemission (PIXE), Sekundärionen-Massenspektrometrie (SIMS) und laserinduzierte Durchbruchsspektroskopie (LIBS).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Copper blocks</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>89275K42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond blade</td>
			<td>Buehler</td>
			<td>15 LC, 102 mm x 0.3 mm</td>
			<td>operation speed: 225 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy forms</td>
			<td>Struers</td>
			<td>40300085</td>
			<td>FixiForm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Epotek</td>
			<td>301-2FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin sectioning machine</td>
			<td>Buehler</td>
			<td>PetroThin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet saw</td>
			<td>Buehler</td>
			<td>IsoMet 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to preserve wetland roots and rhizospheres for elemental imaging

Wurzeln interagieren intensiv mit ihrer Bodenumgebung, aber die Visualisierung solcher Wechselwirkungen zwischen Wurzeln und der umgebenden Rhizosphäre ist eine Herausforderung. Die Rhizosphärenchemie von Feuchtgebietspflanzen ist aufgrund steiler Sauerstoffgradienten von den Wurzeln zum Massenboden besonders schwierig einzufangen. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das die Wurzelstruktur und Rhizosphärenchemie von Feuchtgebietspflanzen durch Slam-Freezing und Gefriertrocknung effektiv bewahrt. Slam-Freezing, bei dem die Probe zwischen Kupferblöcken eingefroren wird, die mit flüssigem Stickstoff vorgekühlt sind, minimiert Wurzelschäden und Probenverzerrungen, die beim Schockgefrieren auftreten können, während gleichzeitig chemische Artbildungsänderungen minimiert werden. Während Probenverzerrungen immer noch möglich sind, erhöht die Fähigkeit, mehrere Proben schnell und mit minimalen Kosten zu erhalten, das Potenzial, zufriedenstellende Proben zu erhalten, und optimiert die Bildgebungszeit. Die Daten zeigen, dass diese Methode erfolgreich ist, um reduzierte Arsenarten in Reiswurzeln und Rhizosphären, die mit Eisenplaques assoziiert sind, zu erhalten. Diese Methode kann für Studien von Pflanzen-Boden-Beziehungen in einer Vielzahl von Feuchtgebieten eingesetzt werden, die Konzentrationsbereiche vom Spurenelementkreislauf bis hin zu Phytoremediationsanwendungen umfassen.

Diese Methode ermöglicht die Erhaltung von Wurzeln und chemischen Arten in den Wurzeln und der Rhizosphäre von Feuchtgebietspflanzen und im Massenboden. In dieser Arbeit wurde die Methode verwendet, um As-Artbildung und Co-Lokalisation mit Fe- und Mn-Oxiden und Pflanzennährstoffen in der Rhizosphäre von Reis(Oryza sativa L.) zu bewerten. Reis wurde in der RICE-Anlage an der University of Delaware angebaut, wo 30 Reisfeld-Mesokosmen (2 m x 2 m, jeweils 49 Pflanzen) verwendet werden, um Reis unter verschiedene...

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A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging

Wir beschreiben ein Protokoll zur Probenahme, Erhaltung und Sektionierung intakter Wurzeln und des umgebenden Rhizosphärenbodens aus Feuchtgebieten unter Verwendung von Reis(Oryza sativa L.) als Modellart. Nach der Konservierung kann die Probe mit elementaren bildgebungstechnischen Verfahren wie der chemischen Synchrotron-Röntgenfluoreszenz (RFA) analysiert werden.

Eine Methode zur Erhaltung von Feuchtgebietswurzeln und Rhizosphären für die Elementarbildgebung

Roots extensively interact with their soil environment but visualizing such interactions between roots and the surrounding rhizosphere is challenging. The ...

Diese Methode bietet Forschern eine neue Möglichkeit, Wasserpflanzenwurzeln, die umgebende Rhizosphäre und den Massenboden für elementare Bildgebungsverfahren vorzubereiten. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie relativ schnell und erschwinglich ist und gleichzeitig die Verteilung und Artbildung von elementen von Interesse genau beisetzt. Diese Technik kann verwendet werden, um Fragen zu vielen Elementen und Pflanzensystemen zu beantworten, von Nährstoffen in landwirtschaftlichen Systemen bis hin zu Verbleib und Transport von Schadstoffen in Fesselsystemen.Achten Sie darauf, schnell zu arbeiten und gleichzeitig auf den gewünschten Bereich oder die Bereiche des Wurzelsystems für die Probenahme zu achten. Und nehmen Sie mehrere Proben pro Wurzelsystem. Um die Slam-Gefriergeräte für ein Experiment vorzubereiten, legen Sie zwei, fünf mal fünf mal 15 Zentimeter große Kupferblöcke horizontal in einen sauberen Kühler, der flüssigen Stickstoff halten kann.Und mit der entsprechenden PSA genug flüssigen Stickstoff in den Kühler gießen, um die Blöcke zu tauchen. Sobald das Sprudeln nachlässt, platzieren Sie einen Abstandhalter an jedem Ende eines Kupferblocks. Dann, mit zangen und kryogenen Handschuhen, stellen Sie den anderen Kupferblog an seinem Ende, um die Rückholung zu erleichtern, wenn die Probe an Ort und Stelle ist.Um die Probe zu sammeln, verwenden Sie entweder eine Topfpflanze oder verwenden Sie eine Schaufel, um die gewünschte Pflanze und Rhizosphäre aus dem nassen Boden zu extrahieren, wobei Sie darauf achten, dass das gegrabene Loch viel größer ist als das gewünschte Wurzelvolumen. Verwenden Sie eine Stahlklinge, um überschüssigen Boden wegzuschneiden, und achten Sie darauf, den Boden innerhalb des gewünschten Bereichs nicht zu stören. Wenn die gewünschten Bereiche erreicht sind, schneiden Sie einen etwa drei mal drei mal zwei Zentimeter großen Wurzelwürfel und setzen Sie den Würfel sofort zwischen die beiden Abstandshalter auf den horizontalen Kupferblock.Für ein Slam-Einfrieren der Probe wurden die kryogenen Handschuhe verwendet, um den vertikalen Kupferblock für etwa fünf Minuten auf die Abstandshalter zu legen. Wenn das Sprudeln nachlässt, wird die gefrorene Rhizosphärenwürfelprobe in ein Stück vorbeschriftetes Aluminiumfolienquadrat übertragen. Um die Bodenwürfel gefrieren zu trocknen, wenn der Gefriertrockner den richtigen Vakuumdruck und die richtige Temperatur erreicht hat, legen Sie eine gefrorene Rhizosphärenwürfelprobe für sauberes und säuregewaschenes 50-Milliliter-Rohr oder direkt in den Gefriertrockner und verwenden Sie ein sauberes Einwegtuch, um zu verhindern, dass Staub in die Vakuumpumpe gelangt.Legen Sie die Proben mindestens einige Tage in das Gefriertrocknergefäß, bis sie trocken sind. Wenn die Gewebe gefriergetrocknet wurden, verwenden Sie eine Stahlklinge, um die Bodenwürfel auf eine für die Analyse geeignete Größe zu trocknen, bevor Sie die Würfel in etikettierte Formen in einem Vakuumausscheider legen. Nachdem Sie Epoxid gemäß den Anweisungen des Herstellers zubereitet haben, verwenden Sie einen Tropfer, um der Form auf einer Seite des Bodens langsam Epoxid hinzuzufügen, bis das Epoxid die Probe vollständig bedeckt.Der Boden verdunkelt sich in der Farbe, wenn das Epoxid den Boden benetzt. Sobald die Formen mit Epoxidharz gefüllt sind, schließen Sie den Austrocknungsmittel und schalten Sie das Vakuum ein. Überprüfen Sie den Epoxidgehalt alle 30 bis 90 Minuten für die ersten ein bis vier Stunden und fügen Sie bei Bedarf zusätzliches Epoxid hinzu.Sobald das Epoxidharz ausgehärtet ist, entfernen Sie die Probe. Verwenden Sie nach dem Einbetten eine Diamantklingen-Präzisions-Nasssäge, um die Probe zu schneiden. Schneiden Sie die Probe in eine andere Richtung, wenn im vorherigen Schnitt keine Wurzeln erhalten wurden.Nach dem Trimmen die Schnittseite jeder Probe manuell mit zunehmend feinerem Schleifpapier für 30 Sekunden pro Körnungsgröße abschleifen. In dieser Abbildung können mehrere Wurzeldurchmesser innerhalb der Bodenmatrix als Querschnitte beobachtet werden. Die Wurzeln können unterschiedliche Qualitätsniveaus aufweisen.In diesem Bild können beispielsweise eine gut erhaltene Wurzel, eine durch den Gefriertrocknungsprozess verzerrte Wurzel und eine Wurzel, die während des Dünnschnittprozesses herausgezogen wurde, beobachtet werden. Die Analyse dieses Wurzeltransversalschnitts mit einer lateralen Wurzel im Längsschnitt mittels Synchrotron-Röntgenfluoreszenzbildgebung, wie gezeigt, ermöglicht den Nachweis von Eisen, Mangan und Arsen. Das Vorhandensein von Eisen im Boden und um die Wurzel in der Eisenplatte ist auch in den Lichtmikroskopischen Bildern sichtbar.Mangan ist einzigartig im Kortex der lateralen Wurzel vorhanden, ko-lokalisiert sich aber auch mit Eisen in einigen Bereichen innerhalb der Eisenplaque als grün-blauer Farbton. Arsen wird hauptsächlich im Gefäßsystem der seitenseitigen Wurzel gefunden, die in das Gefäßsystem der Primärwurzel überführt. Die chemische Artbildung zeigt eine Variabilität in der Lokalisation der Arsenspezies.Wie in diesem dreifarbigen Diagramm beobachtet, sind Arsenit und Arseniterglutathion eng im Gefäßsystem verbunden, während Arsenat hauptsächlich in der Außenseite der Wurzel lokalisiert ist, die mit der Eisenplaque verbunden ist. Bestimmen Sie vor der Probenentnahme den gewünschten Teil des Wurzelsystems für die Elementarbildgebung. Dadurch wird die Positionsausrichtung des entfernten Stammschlüssels bestimmt.Nach diesem Protokoll können Proben im Mikrometerbereich oder gröber mit einer Vielzahl von Techniken abgebildet werden, abhängig von den spezifischen Forschungsfragen, elementen des Interesses oder der verfügbaren Instrumentierung.

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