Name: multiplexed analysis of retinal gene expression and chromatin accessibility using scrna-seq and scatac-seq
Uploaded: 2021-03-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq at JoVE.com

نشكر ليندا أورزوليك من مركز جونز هوبكنز للنسخ و Deep Sequencing Core للمساعدة في تسلسل المكتبات المنتجة و Lizhi Jiang على أداء عمليات استئصال الشبكية خارج الجسم الحي .

تم استخدام الحيوانات في هذه الدراسات باستخدام بروتوكولات معتمدة من قبل لجنة جونز هوبكنز لرعاية واستخدام الحيوانات ، وفقا لإرشادات REACH ، وتم تنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة.
1. متعدد المقاييس
<ol><li>الإعداد الإعلامي
	<ol><li>تحضير وموازنة مثبط البويضا...

<ol>
	<li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration.">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370, (2020).</li><li>Nagalakshmi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcriptional+Landscape+of+the+Yeast+Genome+Defined+by+RNA+Sequencing.">The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing.</a> Science. 320, 1344-1349 (2008).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines.">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50, 96 (2018).</li><li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions,+technologies,+and+species.">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).</li><li>McGinnis, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MULTI-seq:+sample+multiplexing+for+single-cell+RNA+sequencing+using+lipid-tagged+indices.">MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices.</a> Nature Methods. 16, 619-626 (2019).</li><li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics.">Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19, 224 (2018).</li><li>Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+robust+method+for+single+cell+chromatin+accessibility+profiling.">A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling.</a> Nature Communications. 9, 5345 (2018).</li><li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration.">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. , 8598 (2020).</li><li>Clark, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Analysis+of+Retinal+Development+Identifies+NFI+Factors+as+Regulating+Mitotic+Exit+and+Late-Born+Cell+Specification.">Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification.</a> Neuron. 102, 1111-1126 (2019).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+circulating+immune+cell+landscape+in+aging+and+COVID-19.">A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19.</a> Protein Cell. 11, 740-770 (2020).</li><li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+chromatin+landscapes+of+human+immune+cell+development+and+intratumoral+T+cell+exhaustion.">Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion.</a> Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).</li><li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).</li><li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).</li><li>Agilent. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).</li><li>ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qubit+dsDNA+HS+Assay+Kits.">Qubit dsDNA HS Assay Kits.</a> ThermoFisher Scientific. , (2015).</li><li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).</li><li>Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+retinal+neurogenesis+by+somatostatin+signaling.">Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells.">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14, 865-868 (2017).</li><li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics.">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10, 2907 (2019).</li><li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+Potential+Identified+by+Shared+Single-Cell+Profiling+of+RNA+and+Chromatin.">Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin.</a> Cell. , (2020).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Single-Cell+Analysis+Maps+the+Continuous+Regulatory+Landscape+of+Human+Hematopoietic+Differentiation.">Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation.</a> Cell. 173, 1535-1548 (2018).</li><li>Pliner, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cicero+Predicts+cis-Regulatory+DNA+Interactions+from+Single-Cell+Chromatin+Accessibility+Data.">Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data.</a> Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).</li><li>Granja, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ArchR:+An+integrative+and+scalable+software+package+for+single-cell+chromatin+accessibility+analysis.">ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data.">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177, 1888-1902 (2019).</li><li>METABRIC Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+and+transcriptomic+architecture+of+2,000+breast+tumours+reveals+novel+subgroups.">The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups.</a> Nature. 486, 346-352 (2012).</li><li>Izadi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Connectivity+in+Colorectal+Cancer+Gene+Expression+Network.">Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network.</a> Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).</li></ol>

تنبع قوة MULTI-seq من التكامل السلس للبيانات من ظروف أو نماذج تجريبية متعددة والفائدة الهائلة من حيث التكلفة والحد من تأثيرات الدفعات. يوفر استخدام MULTI-seq عمقا غير مسبوق للتنميط الظاهري في المختبر. طرق الإرسال المتعدد غير الجينية مثل تجزئة الخلايا أو تجزئة النوى فتحت الباب أمام عينات متعددة ال...

يلعب فهم كيف يمكن للجينات التأثير على مصير الخلية دورا رئيسيا في استجواب العمليات مثل المرض والتطور الجنيني. يمكن تجميع العلاقات المعقدة بين عوامل النسخ والجينات المستهدفة في شبكات تنظيم الجينات. تضع الأدلة المتزايدة هذه الشبكات التنظيمية الجينية في مركز كل من المرض والتطور عبر السلالات التطورية1. في حين أن التقنيات السابقة مثل qRT-PCR ركزت على جين واحد أو مجموعة من الجينات ، فإن تطبيق تقنية التسلسل عالية الإنتاجية يسمح بتنميط النسخ الخلوي الكامل.
يقدم RNA-seq لمحة عن النسخ على نطاق واسع 2,3. يمنح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) الباحثين القدرة ليس فقط على تحديد خصائص النسخ ولكن أيضا ربط أنواع معينة من الخلايا بملفات تعريف التعبير الجيني4. يتم تحقيق ذلك من الناحية المعلوماتية الحيوية عن طريق تغذية ملفات تعريف الخلايا الفردية في خوارزميات الفرز باستخدام علامات الجينات المعروفة5. يوفر الإرسال المتعدد باستخدام تسلسل المؤشرات الموسومة بالدهون (MULTI-seq) تنوعا غير مسبوق في عدد ملفات تعريف scRNA-Seq التي يمكن جمعها6. تختلف هذه التقنية القائمة على الدهون عن تقنيات فهرسة العينات الأخرى مثل تجزئة الخلايا التي تعتمد على وجود مستضدات سطحية وأجسام مضادة عالية التقارب بدلا من تكامل غشاء البلازما7. ليس فقط من الممكن الآن تحديد ملامح التعبير الجيني في أنواع الخلايا ولكن يمكن دمج تجارب مختلفة في مكتبة تسلسل واحدة ، مما يقلل بشكل كبير من تكلفة تجربة scRNA-seq الفردية6. قد تبدو تكلفة scRNA-seq باهظة للاستخدام في تجارب التنميط الظاهري حيث يتم تحليل العديد من الأنماط الجينية أو الظروف أو عينات المرضى المختلفة ، ولكن تعدد الإرسال يسمح بالجمع بين ما يصل إلى 96 عينة في مكتبة واحدة6.
لم يكن تنميط التعبير الجيني عبر scRNA-seq هو التقنية الوحيدة القائمة على التسلسل عالي الإنتاجية لإحداث ثورة في الفهم الحالي لكيفية إملاء الآليات الجزيئية مصير الخلية. في حين أن فهم النصوص الجينية الموجودة في الخلية يمكن من تحديد نوع الخلية ، إلا أنه من المهم بنفس القدر فهم كيفية تنظيم الجينوم الذي ينظم التطور وتطور المرض. اعتمدت الدراسات المبكرة على الكشف عن الانقسام بوساطة الحمض النووي للتسلسلات غير المرتبطة بالهيستونات، تليها تسلسل شظايا الحمض النووي الناتجة لتحديد مناطق الكروماتين المفتوح. وعلى النقيض من ذلك، فإن فحص الخلية الواحدة لتسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه من قبل الترانسبوزون (scATAC-seq) يسمح للباحثين بفحص الحمض النووي باستخدام ترانسبوزون مستأنس لتحديد ملامح الكروماتين المفتوح بسهولة على مستوى النيوكليوتيد الواحد8. وقد مر هذا من خلال تحجيم مماثل ل scRNA-seq والآن يمكن للباحثين تحديد أنواع الخلايا الفردية والأنماط الظاهرية الشخصية عبر الآلاف من الجينومات الفردية8.
وقد سمح الاقتران بين scRNA-seq و scATAC-seq للباحثين بالقدرة على تحديد ملامح الآلاف من الخلايا لتحديد مجموعات الخلايا والتنظيم الجيني والشبكات التنظيمية الجينية في نماذج الأمراض والعمليات التنموية9،10،11،12. هنا يحدد المؤلفون كيفية استخدام MULTI-seq لأول مرة لتكثيف التنميط الظاهري لعدد لا يحصى من النماذج الحيوانية واستخدام scRNA-seq و scATAC-seq المقترنين للحصول على فهم أفضل لمشهد الكروماتين والشبكات التنظيمية في هذه النماذج الحيوانية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L pipette filter tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1662404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M Barcode Solution</td>
			<td>Request from Gartner lab</td>
			<td>https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP 
			rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&#38;edit_requested 
			=true</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Methanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>322415-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chip Holder</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chromium controller &#38; Accessory Kit</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-120263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>P886-229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m FlowMi Cell Strainer</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>H13680-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;M Anchor Solution</td>
			<td>Sigma or request from Gartner lab</td>
			<td>https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP 
			rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&#38;edit_requested 
			=true</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;M Co-Anchor Solution</td>
			<td>Sigma or request from Gartner lab</td>
			<td>https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP 
			rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&#38;edit_requested 
			=true</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5200 Fragment Analyzer system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>M5310AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 um FlowMi cell strainer</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>H13680-0070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-12R Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BK392302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip G</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip H</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; GEM, Library &#38; Gel Bead Kit v3.1</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BN2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVA Foam Ice Pan</td>
			<td>Tequipment</td>
			<td>04393-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA 12-Capillary Array Short, 33 cm</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>A2300-1250-3355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Isotemp Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-460-20Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma CO2 Water Jacketed Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol 50% Aqueous solution</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3290-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina NextSeq or NovaSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa Hifi Hotstart ReadyMix</td>
			<td>HiFi</td>
			<td>7958927001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low TE Buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-324-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Solution 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator Rack for 200 &#181;L tubes</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>NC1469069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULTI-seq Primer</td>
			<td>Sigma or IDT</td>
			<td>See sequence list</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyFuge Mini Centrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 Substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Buffer EB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refridgerated Centrifuge 5424 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Disposable Pellet Pestles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-141-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPI primer</td>
			<td>Sigma or IDT</td>
			<td>See sequence list</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Index Kit N, Set A</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Index Kit T Set A</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride Solution 5 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRIselect Reagent Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B23318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Disposable Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempAssure PCR 8-tube strip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-4700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal I5 primer</td>
			<td>Sigma or IDT</td>
			<td>See sequence list</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed analysis of retinal gene expression and chromatin accessibility using scrna-seq and scatac-seq

توفر تقنيات تسلسل الجيل التالي القوية تحليلا قويا وشاملا للتحقيق في كيفية عمل الشبكات التنظيمية لجينات الشبكية أثناء التطور وفي الحالات المرضية. يسمح لنا تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية بتحديد ملامح شاملة لتغيرات التعبير الجيني التي لوحظت في تطور الشبكية والمرض على المستوى الخلوي ، في حين يسمح ATAC-Seq أحادي الخلية بتحليل إمكانية الوصول إلى الكروماتين وربط عامل النسخ ليتم توصيفه بدقة مماثلة. هنا يتم وصف استخدام هذه التقنيات في شبكية العين النامية ، ويتم توضيح MULTI-Seq ، حيث يتم تصنيف العينات الفردية بمركب أوليغونوكليوتيد دهني معدل ، مما يمكن الباحثين من زيادة نطاق التجارب الفردية وتقليل التكاليف بشكل كبير.

يضع سير العمل هذا استراتيجية للتحقيق في الأنماط الظاهرية التنموية والعمليات التنظيمية باستخدام تسلسل الخلية الواحدة. يتيح تعدد الإرسال المتعدد للعينات MULTI-seq إجراء فحص أولي منخفض التكلفة للتنميط الظاهري بينما يسمح الجمع المقترن وتثبيت العينات ل scRNA-seq و scATAC-seq بإجراء تحقيق أكثر تعمقا (<strong...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq at JoVE.com

Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq

هنا ، يعرض المؤلفون فائدة MULTI-seq للتنميط الظاهري وما تلاه من scRNA-seq و scATAC-seq في توصيف ملفات تعريف إمكانية الوصول إلى النسخ والكروماتين في شبكية العين.

تحليل متعدد الإرسال للتعبير الجيني للشبكية وإمكانية الوصول إلى الكروماتين باستخدام scRNA-Seq و scATAC-Seq

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during ...

سيمكن هذا البروتوكول من استخدام الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتحديد النمط الظاهري الأولي. وعندما يقترن ب ATAC-seq أحادي الخلية ، فإن إعادة بناء الشبكات التنظيمية الجينية. إن استخدام MULTI-seq يبقي التكاليف منخفضة للتحقيق الأولي ، ويسمح تحديد العينات المقترنة ل RNA-seq أحادي الخلية و ATAC-seq أحادي الخلية بتحليل المسار الزمني للشبكات التنظيمية الجينية.يمكن للمحققين استخدام هذا البروتوكول لفهم الشبكات الجينية التي تتحكم في التطور وتطور المرض. للبدء ، أضف 20 ميكرولتر من محلول الباركود المرساة إلى كل عينة وماصة لمزجها. احتضنه على الجليد لمدة خمس دقائق.ثم أضف 20 ميكرولتر من محلول الإرساء المشترك إلى كل عينة، واحتضنها على الثلج لمدة خمس دقائق أخرى. أضف ملليلتر واحد من الثلج البارد 1٪ BSA و PBS إلى كل عينة وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × g لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. إزالة supernatant دون إزعاج بيليه الخلية.ثم أضف 400 ميكرولتر من الثلج البارد 1٪ BSA و PBS. جهاز طرد مركزي عند 300 × g لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تحديد تركيز الخلايا لكل عينة باستخدام مقياس الدم ، وحساب العدد الإجمالي للخلايا والحجم المطلوب لمستحلب جل الخرزة أو GEM.اجمع الأحجام المحسوبة من كل عينة في أنبوب جديد معقم بسعة 1.5 ملليلتر، وحدد تركيز الخلية النهائي للعينات المدمجة. بعد توليد GEM والترميز الشريطي ، قم بإجراء تنظيف cDNA للتعبير الجيني باستخدام تحديد الحجم ، مع التأكد من عدم التخلص من supernatant من الجولة الأولى من الاختيار ، والتي تحتوي على الباركود العينة. انقل السوبرنات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد معقم 1.5 ملليلتر وقم بتخزينه على الجليد.دوامة كاشف اختيار الحجم القائم على الخرز شبه المغناطيسي ، وإضافة 260 ميكرولتر من الكاشف و 180 ميكرولتر من 100٪ Isopropanol إلى supernatant. ماصة المزيج 10 مرات وحضانت في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ضع الأنبوب على رف مغناطيسي وانتظر حتى يمسح الحل.بمجرد أن يصبح الحل واضحا ، قم بإزالة وتجاهل supernatant. أضف 500 ميكرولتر من 80٪ من الإيثانول إلى الخرز لمدة 30 ثانية ، ثم تخلص من supernatant. كرر هذا لما مجموعه غسلتين.الطرد المركزي لفترة وجيزة الخرز وإعادتها إلى الرف المغناطيسي. اضبط المؤقت على دقيقتين. ثم قم بإزالة الإيثانول المتبقي باستخدام ماصة P10 ، وجفف الخرز في الهواء على الرف المغناطيسي لمدة دقيقتين متبقيتين.قم بإزالة الخرز من الرف المغناطيسي وأعد تعليقه في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت. ماصة تماما للإنعاش ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين ، ثم إعادة الخرز إلى الرف المغناطيسي وانتظر حتى يزول المحلول. انقل السوبرنات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر.كرر التنظيف كما هو موضح ، باستخدام نصف حجم المخزن المؤقت للاستخراج. بالنسبة للعينات الموجهة لتسلسل scATAC ، قم بإزالة أي سائل من أنبوب الطرد المركزي الدقيق باستخدام ماصة P200 ، وقم بتجميد العينات في الثلج الجاف للإيثانول. لفصل الخلايا في العينات المخصصة لتسلسل scRNA ، قم بتنفيذ خطوات التفكك باستخدام غراء ، كما هو موضح في مخطوطة النص.قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × g لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة supernatant دون تعطيل بيليه الخلية. أضف ملليلتر واحد من PBS المبرد ، واخلطه 10 مرات أو حتى يتم تعليق الخلايا تماما. مرة أخرى ، جهاز طرد مركزي عند 300 × g لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، وكرر الغسيل مع PBS مرتين.ابدأ في دوامة الأنبوب عند إعداد أدنى سرعة وأضف 900 ميكرولتر من الميثانول المبرد ، قطرة قطرة ، مع الاستمرار في دوامة الأنبوب بلطف لمنع الخلايا من التكتل. احتضن الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة. تحديد تركيز الخلايا الثابتة باستخدام مقياس الدم ، وتقييم فعالية خطوة التثبيت باستخدام التربان الأزرق.تخزين الأنسجة المجمدة والخلايا الثابتة في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. يتيح الترميز الشريطي لتسلسل MULTI التسلسل المشترك لعينات متعددة وفك الالتفاف الحسابي اللاحق. يمكن تحديد عينة المنشأ لكل خلية بناء على تعبير الباركود الخاص بها.يمكن تحليل هذه العينات المدمجة كمجموعة بيانات واحدة لأغراض تجميع الخلايا وتحديد نوع الخلية. نظرا لأن كل خلية يتم ترميزها بالباركود قبل إنشاء GEM ، سيكون لثنائيات الخلايا احتمال كبير لإظهار التعبير عن الرموز الشريطية متعددة تسلسل MULTI ، وبالتالي يمكن تحديد غالبية الثنائيات وإزالتها قبل التجميع وتحديد نوع الخلية. يمكن استخدام تسلسل ATAC أحادي الخلية لإنشاء مجموعة بيانات مع أنواع الخلايا لمطابقة تلك الموجودة بواسطة تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.إن الاقتران بين التعبير الجيني لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ومعلومات الوصول إلى الحمض النووي لتسلسل ATAC أحادي الخلية يتيح إعادة بناء الشبكات التنظيمية الجينية. عند محاولة البروتوكول ، ضع في اعتبارك أن توقيت التبخر العرقي لمدة دقيقتين أمر بالغ الأهمية لاسترجاع التسلسل في خطوات الاستخلاص اللاحقة. إن إعادة بناء الشبكات التنظيمية الجينية باستخدام الحمض النووي الريبي أحادي الخلية المقترن و ATAC-seq أحادي الخلية ينتج أهدافا للتعبير المفرط عن الجينات ودراسات الضربة القاضية.يمكن استخدام MULTI-seq في هذه المرحلة لتحديد التأثيرات الخاصة بنوع الخلية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

الحبل الشوكي الكهربية ثانيا : خارج الخلية التصنيع الكهربائي شفط

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

عزل الخلايا الجذعية الأنف الشم من القوارض أو البشر

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

عالية الدقة التصوير لايف من سلوك خلية في الظهارة العصبية النامية

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

الأمثل تحليل الحامض النووي والتعبير الجيني من المناطق، الصغيرة تشريحيا المعرفة من الدماغ

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

تشريح والثقافة، وتحليل<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأنسجة الجنينية الشبكية

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

تسليخ مجهري ليزر لقطة من السكان المخصب من الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية واحدة لتحليل التعبير الجيني بعد إصابات في الدماغ

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

المجهرية من التعبير الجيني في الدماغ اسماك الزرد الكبار عن طريق حقن مكروي Cerebroventricular [أليغنوكليوتيد] Morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA تسلسل تحليل التفاضلية التعبير الجيني في Electroporated الفرخ الجنينية الحبل الشوكي

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

تحليل التغييرات التعبير الجيني في الفئران الحصين بعد ديب تحفيز الدماغ الأمامي من مهادي نواة

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...