Name: multiplexed analysis of retinal gene expression and chromatin accessibility using scrna-seq and scatac-seq
Uploaded: 2021-03-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq at JoVE.com

Vi takker Linda Orzolek fra Johns Hopkins Transcriptomics og Deep Sequencing Core for hjelp til å sekvensere de produserte bibliotekene og Lizhi Jiang for å utføre ex vivo retinale eksplanter.

Bruken av dyr til disse studiene ble utført ved hjelp av protokoller godkjent av Johns Hopkins Animal Care and Use Committee, i samsvar med ARRIVE-retningslinjene, og ble utført i samsvar med relevante retningslinjer og forskrifter.
1. Multi-seq
<ol><li>Media forberedelse
	<ol><li>Klargjør og likevekt ovomucoidhemmer, 10 mg ovomucoidhemmer og 10 mg albumin per ml Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), i 30 minutter før bruk13. Likevekt med 95% O<s...

<ol>
	<li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration.">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370, (2020).</li><li>Nagalakshmi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcriptional+Landscape+of+the+Yeast+Genome+Defined+by+RNA+Sequencing.">The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing.</a> Science. 320, 1344-1349 (2008).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines.">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50, 96 (2018).</li><li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions,+technologies,+and+species.">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).</li><li>McGinnis, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MULTI-seq:+sample+multiplexing+for+single-cell+RNA+sequencing+using+lipid-tagged+indices.">MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices.</a> Nature Methods. 16, 619-626 (2019).</li><li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics.">Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19, 224 (2018).</li><li>Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+robust+method+for+single+cell+chromatin+accessibility+profiling.">A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling.</a> Nature Communications. 9, 5345 (2018).</li><li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration.">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. , 8598 (2020).</li><li>Clark, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Analysis+of+Retinal+Development+Identifies+NFI+Factors+as+Regulating+Mitotic+Exit+and+Late-Born+Cell+Specification.">Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification.</a> Neuron. 102, 1111-1126 (2019).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+circulating+immune+cell+landscape+in+aging+and+COVID-19.">A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19.</a> Protein Cell. 11, 740-770 (2020).</li><li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+chromatin+landscapes+of+human+immune+cell+development+and+intratumoral+T+cell+exhaustion.">Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion.</a> Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).</li><li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).</li><li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).</li><li>Agilent. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).</li><li>ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qubit+dsDNA+HS+Assay+Kits.">Qubit dsDNA HS Assay Kits.</a> ThermoFisher Scientific. , (2015).</li><li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).</li><li>Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+retinal+neurogenesis+by+somatostatin+signaling.">Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells.">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14, 865-868 (2017).</li><li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics.">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10, 2907 (2019).</li><li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+Potential+Identified+by+Shared+Single-Cell+Profiling+of+RNA+and+Chromatin.">Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin.</a> Cell. , (2020).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Single-Cell+Analysis+Maps+the+Continuous+Regulatory+Landscape+of+Human+Hematopoietic+Differentiation.">Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation.</a> Cell. 173, 1535-1548 (2018).</li><li>Pliner, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cicero+Predicts+cis-Regulatory+DNA+Interactions+from+Single-Cell+Chromatin+Accessibility+Data.">Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data.</a> Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).</li><li>Granja, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ArchR:+An+integrative+and+scalable+software+package+for+single-cell+chromatin+accessibility+analysis.">ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data.">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177, 1888-1902 (2019).</li><li>METABRIC Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+and+transcriptomic+architecture+of+2,000+breast+tumours+reveals+novel+subgroups.">The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups.</a> Nature. 486, 346-352 (2012).</li><li>Izadi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Connectivity+in+Colorectal+Cancer+Gene+Expression+Network.">Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network.</a> Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).</li></ol>

Kraften til MULTI-seq stammer fra sømløs integrering av data fra flere eksperimentelle forhold eller modeller og den enorme fordelen når det gjelder kostnader og begrensende batcheffekter. Utnytte MULTI-seq tilbyr et laboratorium enestående fenotyping dybde. Ikke-genetiske multipleksingsmetoder som cellehasjing eller kjernehasjing åpnet døren for multipleksede prøver ved bruk av strekkodede antistoffer 7,19,20. Dette er i...

Å forstå hvordan gener kan påvirke celle skjebne spiller en nøkkelrolle i å undersøke prosesser som sykdom og embryonal progresjon. De komplekse forholdene mellom transkripsjonsfaktorer og deres målgener kan grupperes i genregulerende nettverk. Montering av bevis plasserer disse genregulerende nettverkene i sentrum av både sykdom og utvikling på tvers av evolusjonære linjer1. Mens tidligere teknikker som qRT-PCR fokuserte på et enkelt gen eller sett med gener, tillater anvendelsen av sekvenseringsteknologi med høy gjennomstrømning profilering av komplette cellulære transkriptomer.
RNA-seq gir et glimt inn i storskala transkriptomikk 2,3. Enkeltcellet RNA-sekvensering (scRNA-seq) gir etterforskere muligheten til ikke bare å profilere transkriptomer, men koble spesifikke celletyper med genuttrykksprofiler4. Dette oppnås bioinformatisk ved å mate individuelle celleprofiler inn i sorteringsalgoritmer ved hjelp av kjente genmarkører5. Multipleksing ved hjelp av lipidmerkede indekser sekvensering (MULTI-seq) gir enestående mangfold i antall scRNA-Seq profiler som kan samles6. Denne lipidbaserte teknikken skiller seg fra andre prøveindekseringsteknikker som celle-hashing som er avhengig av tilstedeværelsen av overflateantigener og antistoffer med høy affinitet i stedet for plasmamembranintegrasjon7. Ikke bare er det nå mulig å profilere genuttrykksprofiler i celletyper, men forskjellige eksperimenter kan kombineres til et enkelt sekvenseringsbibliotek, noe som dramatisk reduserer kostnadene for et individuelt scRNA-seq-eksperiment6. Kostnaden for scRNA-seq kan virke uoverkommelig for bruk i fenotypingseksperimenter der mange forskjellige genotyper, tilstander eller pasientprøver analyseres, men multipleksing tillater kombinasjon av opptil 96 prøver i et enkelt bibliotek6.
Profilering av genuttrykk via scRNA-seq har ikke vært den eneste sekvenseringsbaserte teknikken med høy gjennomstrømning for å revolusjonere den nåværende forståelsen av hvordan molekylære mekanismer dikterer celleskjebne. Mens forståelse av hvilke gentransskripter som er tilstede i en celle, gjør det mulig å identifisere celletype, er like viktig å forstå hvordan genomisk organisasjon regulerer utvikling og sykdomsprogresjon. Tidlige studier baserte seg på å oppdage DNase-mediert spaltning av sekvenser som ikke var bundet til histoner, etterfulgt av sekvensering av de resulterende DNA-fragmentene for å identifisere regioner med åpen kromatin. I motsetning til dette tillater enkeltcelleanalyse for transposontilgjengelig kromatinsekvensering (scATAC-seq) forskere å undersøke DNA med et domestisert transposon for lett å profilere åpent kromatin på enkeltnukleotidnivå8. Dette har gått gjennom en lignende skalering til scRNA-seq, og nå kan etterforskere identifisere individuelle celletyper og profilere fenotyper på tvers av tusenvis av individuelle genomer8.
Sammenkoblingen av scRNA-seq og scATAC-seq har gitt forskere muligheten til å profilere tusenvis av celler for å bestemme cellepopulasjoner, genomisk organisasjon og genregulerende nettverk i sykdomsmodeller og utviklingsprosesser 9,10,11,12. Her skisserer forfatterne hvordan man først kan bruke MULTI-seq til å kondensere fenotyping av et mylder av dyremodeller og bruke parret scRNA-seq og scATAC-seq for å få en bedre forståelse av kromatinlandskapet og regulatoriske nettverk i disse dyremodellene.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L pipette filter tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1662404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M Barcode Solution</td>
			<td>Request from Gartner lab</td>
			<td>https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP 
			rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&#38;edit_requested 
			=true</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Methanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>322415-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chip Holder</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chromium controller &#38; Accessory Kit</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-120263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>P886-229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m FlowMi Cell Strainer</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>H13680-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;M Anchor Solution</td>
			<td>Sigma or request from Gartner lab</td>
			<td>https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP 
			rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&#38;edit_requested 
			=true</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;M Co-Anchor Solution</td>
			<td>Sigma or request from Gartner lab</td>
			<td>https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP 
			rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&#38;edit_requested 
			=true</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5200 Fragment Analyzer system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>M5310AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 um FlowMi cell strainer</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>H13680-0070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-12R Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BK392302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip G</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip H</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; GEM, Library &#38; Gel Bead Kit v3.1</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BN2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVA Foam Ice Pan</td>
			<td>Tequipment</td>
			<td>04393-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA 12-Capillary Array Short, 33 cm</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>A2300-1250-3355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Isotemp Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-460-20Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma CO2 Water Jacketed Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol 50% Aqueous solution</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3290-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina NextSeq or NovaSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa Hifi Hotstart ReadyMix</td>
			<td>HiFi</td>
			<td>7958927001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low TE Buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-324-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Solution 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator Rack for 200 &#181;L tubes</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>NC1469069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULTI-seq Primer</td>
			<td>Sigma or IDT</td>
			<td>See sequence list</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyFuge Mini Centrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 Substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Buffer EB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refridgerated Centrifuge 5424 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Disposable Pellet Pestles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-141-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPI primer</td>
			<td>Sigma or IDT</td>
			<td>See sequence list</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Index Kit N, Set A</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Index Kit T Set A</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride Solution 5 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRIselect Reagent Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B23318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Disposable Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempAssure PCR 8-tube strip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-4700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal I5 primer</td>
			<td>Sigma or IDT</td>
			<td>See sequence list</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed analysis of retinal gene expression and chromatin accessibility using scrna-seq and scatac-seq

Kraftige neste generasjons sekvenseringsteknikker tilbyr robust og omfattende analyse for å undersøke hvordan retinale genregulerende nettverk fungerer under utvikling og i sykdomstilstander. Enkeltcellet RNA-sekvensering gjør det mulig for oss å profilere genuttrykksendringer observert i retinal utvikling og sykdom på mobilnivå, mens enkeltcellet ATAC-Seq tillater analyse av kromatintilgjengelighet og transkripsjonsfaktorbinding som skal profileres ved lignende oppløsning. Her beskrives bruken av disse teknikkene i den utviklende netthinnen, og MULTI-Seq demonstreres, hvor individuelle prøver er merket med et modifisert oligonukleotid-lipidkompleks, slik at forskere både kan øke omfanget av individuelle eksperimenter og redusere kostnadene betydelig.

Denne arbeidsflyten legger ut en strategi for undersøkelse av utviklingsfenotyper og regulatoriske prosesser ved hjelp av enkeltcellesekvensering. MULTI-seq prøvemultipleksing muliggjør en innledende lavkost fenotypingsanalyse, mens parret innsamling og fiksering av prøver for scRNA-seq og scATAC-seq gir mulighet for mer grundig undersøkelse (figur 1).
MULTI-seq-strekkoding muliggjør kombinert sekvensering av flere prøver og deres påfølgende beregningsmes...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq at JoVE.com

Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq

Her viser forfatterne nytten av MULTI-seq for fenotyping og påfølgende parret scRNA-seq og scATAC-seq ved karakterisering av transkriptomiske og kromatin tilgjengelighetsprofiler i netthinnen.

Multiplekset analyse av retinal genuttrykk og kromatin tilgjengelighet ved hjelp av scRNA-Seq og scATAC-Seq

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during ...

Denne protokollen vil muliggjøre bruk av encellet RNA-seq for innledende fenotyping. Og når det er parret med encellet ATAC-seq, rekonstruksjonen av genregulerende nettverk. Bruken av MULTI-seq holder kostnadene lave for innledende undersøkelser, og fiksering av parede prøver for encellet RNA-seq og encellet ATAC-seq muliggjør tidsforløpanalyse av genreguleringsnettverk.Forskere kan bruke denne protokollen til å forstå de genetiske nettverkene som styrer utvikling og sykdomsprogresjon. For å begynne, tilsett 20 mikroliter ankerstrekkodeløsning til hver prøve og pipette den for å blande. Inkuber den på is i fem minutter.Tilsett deretter 20 mikroliter medankerløsning til hver prøve, og inkuber på is i ytterligere fem minutter. Tilsett en milliliter iskald 1% BSA og PBS til hver prøve og sentrifuger cellene ved 300 x g i fem minutter ved fire grader Celsius. Fjern supernatanten uten å forstyrre cellepelleten.Tilsett deretter 400 mikroliter iskald 1% BSA og PBS. Sentrifuge ved 300 x g i fem minutter ved fire grader Celsius. Bestem konsentrasjonen av celler for hver prøve ved hjelp av et hemocytometer, og beregne totalt antall celler og volum som kreves for Gel Bead-in-Emulsion eller GEM.Kombiner de beregnede volumene fra hver prøve i et nytt sterilt 1,5 milliliter rør, og bestem den endelige cellekonsentrasjonen av de kombinerte prøvene. Etter GEM-generering og strekkoding, utfør genuttrykk cDNA-opprydding ved hjelp av størrelsesvalg, og sørg for ikke å kaste supernatanten fra den første seleksjonsrunden, som inneholder prøvestrekkoden. Overfør supernatanten til et nytt sterilt 1,5 milliliter mikrosentrifugerør og oppbevar det på is.Vortex det paramagnetiske perlebaserte størrelsesvalgreagenset, og tilsett 260 mikroliter av reagenset og 180 mikroliter 100% isopropanol til supernatanten. Pipette blandingen 10 ganger og inkuber ved romtemperatur i fem minutter. Plasser røret på et magnetisk stativ og vent til løsningen ryddes.Når oppløsningen er klar, fjern og kast supernatanten. Tilsett 500 mikroliter 80% etanol til perlene i 30 sekunder, og kast deretter supernatanten. Gjenta dette i totalt to vasker.Sentrifuger forsiktig perlene og returner dem til magnetstativet. Still timeren på to minutter. Fjern deretter gjenværende etanol med en P10-pipette, og lufttørk perlene på magnetstativet i de resterende to minuttene.Fjern perlene fra magnetstativet og resuspender dem i 100 mikroliter elueringsbuffer. Pipette grundig å resuspendere, og inkubere ved romtemperatur i to minutter, deretter returnere perlene til magnetstativet og vente på løsningen for å fjerne. Overfør supernatanten til et friskt 1,5 milliliter mikrosentrifugerør.Gjenta oppryddingen som vist, ved å bruke halvparten av volumet av elueringsbuffer. For prøvene som er bestemt for scATAC-sekvens, fjern væske fra mikrosentrifugerøret ved hjelp av en P200-pipette, og frys prøvene i etanoltørris. For å dissosiere cellene i prøvene som er bestemt for scRNA-sekvensering, utfør dissosiasjonstrinnene ved hjelp av papain, som beskrevet i tekstmanuskriptet.Sentrifuge cellene ved 300 x g i tre minutter ved romtemperatur, og fjern supernatanten uten å forstyrre cellepelleten. Tilsett en milliliter kjølt PBS, og bland 10 ganger eller til cellene er helt suspendert. Igjen, sentrifuger ved 300 x g i fem minutter ved fire grader Celsius, og gjenta vasken med PBS to ganger.Begynn å vortexing røret ved laveste hastighetsinnstilling og tilsett 900 mikroliter kjølt metanol, dråpe for dråpe, mens du fortsetter å forsiktig vortex røret for å forhindre at cellene klumper seg. Inkuber cellene på is i 15 minutter. Bestem konsentrasjonen av de faste cellene ved hjelp av et hemocytometer, og vurder effekten av fikseringstrinnet ved hjelp av trypanblå.Oppbevar det frosne vevet og faste celler ved minus 80 grader Celsius. MULTI-sekvensstrekkoding muliggjør kombinert sekvensering av flere prøver og deres påfølgende beregningsmessige dekonvolusjon. Opprinnelsesprøven kan bestemmes for hver celle basert på strekkodeuttrykket.Disse kombinerte prøvene kan analyseres som et enkelt datasett med henblikk på celleklynger og celletypeidentifikasjon. Fordi hver celle er strekkodet før GEM-generering, vil celledubletter ha stor sannsynlighet for å vise uttrykk for flere MULTI-sekvensstrekkoder, og et flertall av dubletter kan derfor identifiseres og fjernes før klynger og celletypeidentifikasjon. Enkeltcellet ATAC-sekvensering kan brukes til å generere et datasett med celletyper for å matche de som finnes ved encellet RNA-sekvensering.Sammenkoblingen av enkeltcellet RNA-sekvenseringsgenuttrykk og enkeltcellet ATAC-sekvensering av DNA-tilgjengelighetsinformasjon muliggjør rekonstruksjon av genregulerende nettverk. Når du prøver protokollen, må du huske at to-minutters timing av etnolfordampningen er avgjørende for sekvensinnhenting i de påfølgende elueringstrinnene. Rekonstruksjon av genregulerende nettverk ved hjelp av parret enkeltcellet RNA-seq og encellet ATAC-seq produserer mål for genoveruttrykk og knockoutstudier.MULTI-seq kan brukes på dette stadiet for å identifisere celletypespesifikke effekter.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Høy oppløsning Live-Imaging of Cell Behavior i utviklingsland Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Optimalisert Analyse av DNA-metylering og Gene Expression fra små, anatomisk definerte områder i hjernen

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering og genetisk manipulering av dendritter og pigger i Mus hjernebarken og hippocampus hjelp<em&gt; I fosterlivet</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Disseksjon, kultur, og analyse av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonic Retinal Tissue

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Capture mikrodisseksjon av anriket Bestander av neuroner eller Enslige nevroner for genekspresjonsanalyse etter traumatisk hjerneskade

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Mikromanipulasjonsprosedyre av Gene Expression i voksen sebrafisk Brain hjelp Cerebroventricular Mikroinjeksjon av morpholino Oligonukleotider

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq Analyse av Differential Gene Expression i elektroporerte Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Analyse av genuttrykk Endringer i Rat Hippocampus Etter dyp hjernestimulering av fremre talamiske Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...