Name: generation of induced pluripotent stem cells from turner syndrome (45xo) fetal cells for downstream modelling of neurological deficits associated with the syndrome
Uploaded: 2021-12-04T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome 45XO Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndr

Financiële steun voor het bovenstaande onderzoek werd verstrekt door Manipal Academy of Higher Education. De karakterisering van de lijn werd gedeeltelijk uitgevoerd in het laboratorium van M.M. Panicker bij NCBS. Wij danken Anand Diagnostic Laboratory voor hulp bij karyotypering.

FCV werden verkregen van Manipal Hospital, Bengaluru, onder goedkeuring van de ethische commissie van Manipal Hospitals.
OPMERKING: Zie tabel 1 voor de samenstelling van alle buffers en oplossingen.
1. Isolatie van fibroblasten van foetale chorionvlokken (FCV)
<ol><li>
Monsterverzameling en weefseldesintegratie in collagenase
	<ol>
<li>Fcv verzamelen onder steriele omstandigheden in fosfaat gebufferde zoutoplossin...

<ol>
	<li>Verlinsky, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell+lines+with+genetic+disorders.">Human embryonic stem cell lines with genetic disorders.</a> Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).</li><li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Study+of+Fragile+X+Syndrome+Using+Human+Embryonic+Stem+Cells+Derived+from+Preimplantation+Genetically+Diagnosed+Embryos.">Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos.</a> Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).</li><li>Biancotti, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Embryonic+Stem+Cells+as+Models+for+Aneuploid+Chromosomal+Syndromes.">Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes.</a> STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+abnormal+early+development+with+induced+pluripotent+stem+cells+from+aneuploid+syndromes.">Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes.</a> Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).</li><li>Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turner+syndrome:+mechanisms+and+management.">Turner syndrome: mechanisms and management.</a> Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniparental+disomy+of+the+entire+X+chromosome+in+Turner+syndrome+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Discovery. 1, 15022 (2015).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+from+an+adult+male+with+45,X/46,XY+mosaicism.">Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism.</a> Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).</li><li>Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+from+chorionic+villi+of+a+Turner+syndrome+spontaneous+abortion.">Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion.</a> Stem Cell Research. 19, (2017).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+Disease+Patient-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Viral+Reprogramming+Factors.">Parkinson's Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors.</a> Cell. 136, 964-977 (2009).</li><li>Somers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgene-Free+Lung+Disease-Specific+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+a+Single+Excisable+Lentiviral+Stem+Cell+Cassette.">Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette.</a> STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).</li><li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li><li>Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+Without+Viral+Integration.">Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration.</a> Science. 322, 945-949 (2008).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).</li><li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Reprogramming+to+Pluripotency+and+Directed+Differentiation+of+Human+Cells+with+Synthetic+Modified+mRNA.">Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins.">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Vector+and+Transgene+Sequences.">Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li><li>Mart&#237;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pluripotent+stem+cells.">Characterization of pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).</li><li>Ambartsumyan, G., Clark, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+and+early+human+embryo+development.">Aneuploidy and early human embryo development.</a> Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).</li></ol>

Het genereren van stabiele cellulaire modellen van cytogenetisch abnormaal foetaal weefsel is noodzakelijk voor het bestendigen van een defect fenotype. De iPSC-route is de meest effectieve methode voor celvoorbereiding voor eeuwigdurend behoud van defecte eigenschappen20.
Pluripotente stamcellen (PSC) vertonen eigenschappen van zelfvernieuwing en differentiatie in gespecialiseerde cellen die doen denken aan vroege splitsingsembryo's21. Vandaar d...

Aneuploïdieën leiden tot aangeboren afwijkingen/aangeboren misvormingen en zwangerschapsverlies bij de mens. ~50%-70% van de monsters van zwangerschapsverliezen vertonen cytogenetische afwijkingen. Aneuploïde embryo's die vroeg in de zwangerschap verloren zijn gegaan, kunnen niet gemakkelijk worden verkregen voor experimentele analyse, waardoor de noodzaak ontstaat om andere modellen te ontwikkelen die de menselijke embryogenese nauw weergeven. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) afgeleid van cellen met de diagnose genetische aandoeningen zijn gebruikt om de representatieve genetische onregelmatigheden en hun gevolgen voor de foetale ontwikkeling te modelleren1,2,3,4. Deze iPSC's lijken op epiblastcellen van het zich ontwikkelende embryo en kunnen de vroege gebeurtenissen van embryovorming samenvatten. Ze maken begrip en karakterisering van het ontwikkelingsprogramma van cellijningen en patronen in vroege zoogdierembryo's mogelijk. iPSC's die eerder zijn afgeleid van huidfibroblasten en amniocyten van prenatale diagnostische tests van aneuploïdiesyndromen zoals monosomie X (syndroom van Turner), trisomie 8 (Syndroom van Warkany 2), trisomie 13 (Syndroom van Patau) en partiële trisomie 11; 22 (Emanuel syndroom) hebben waardevolle inzichten opgeleverd met betrekking tot mislukte ontwikkeling4.
Turner syndroom (TS) is een zeldzame aandoening die wordt gekenmerkt door vrouwelijke onvruchtbaarheid, kleine gestalte, endocriene en metabole stoornissen, een verhoogd risico op auto-immuunziekten en een aanleg voor hart- en vaatziekten5. Hoewel het het enige overlevingswaardige monosomiesyndroom is, is het ook dodelijk voor het zich ontwikkelende embryo dat spontane abortussen veroorzaakt6. Overlevende individuen met TS presenteren zich met graden van verandering van X-chromosomaal materiaal in hun cellen. Karyotypen variëren van volledig verlies van één X-chromosoom (45,XO) tot mozaïeken zoals 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, de aanwezigheid van ringchromosomen, de aanwezigheid van Y-chromosomaal materiaal,enz. 5.
Diagnose van het syndroom wordt over het algemeen gedaan door karyotypering van bloed van symptomatische personen en chorion villi sampling (CVS) om vroege aneuploïdie syndromen te detecteren. Aangezien aneuploïdiesyndromen verantwoordelijk zijn voor ~ 30% van de spontane abortussen, is het routine om het product van conceptie (POC) bij een spontane abortus te karyotyperen. Deze foetale cellen, waaronder de chorionvilli die de cytogenetische afwijking bezitten en daarvan afgeleide iPSC's, bieden een waardevolle bron van biologisch materiaal om aneuploïdiesyndromen te bestuderen4,6. TS iPSC's zijn eerder vastgesteld uit amniocyten via retrovirale herprogrammering4, fibroblasten van chorionvlokken (verkregen door prenatale diagnose) via retrovirale herprogrammering6, uit mononucleaire bloedcellen7 via sendaivirusherprogrammering en uit huidfibroblasten van TS-individuen via lentivirale herprogrammering4 . Omdat de primaire focus van ons lab is om ontwikkelingsfalen te begrijpen, hebben we TS iPSC's gegenereerd uit POC, met name de chorionvilli-component van een spontane abortus8. Alle cellen geïsoleerd uit dit foetale weefsel hadden een 45XO karyotype en leverden iPSC's op met hetzelfde karyotype. Deze iPSC's zijn uniek omdat ze de eerste zijn die worden gegenereerd uit een geaborteerde foetus en een waardevolle bron bieden om aneuploïdiegerelateerde zwangerschapsfalen te bestuderen. Dit artikel biedt een gedetailleerde methodologie van het genereren van iPSC's uit deze unieke celbron via episomale herprogrammering.
De vroege methoden van iPSC-generatie gebruikten virale transductie en transposons om de herprogrammeringsfactoren te leveren. Methoden voor het induceren van cellen tot pluripotentie zijn geëvolueerd van het gebruik van integrerende retrovirale vectoren9, excisable lentiviral vectoren10,11 en transposon-gebaseerde methoden12 tot niet-integrerende adenovirale vectoren13 en Sendai virus gebaseerde vectoren14. Retrovirale en lentivirale herprogrammering, hoewel efficiënt, omvat integratie van de herprogrammeringsfactoren in de gastheerchromosomen, waardoor insertiemutaties ontstaan die onvoorziene effecten hebben in de iPSC's. Bovendien voorkomt virale herprogrammering translationele toepassing van iPSC's. RNA-gebaseerde systemen15 en directe eiwitafgifte16 zijn onderzocht om de potentiële risico's in verband met het gebruik van virussen en DNA-transfecties volledig te elimineren. Deze methoden zijn echter inefficiënt gebleken.
In 2011 rapporteerden Okita et al. een verbeterde efficiëntie van herprogrammering door episomale plasmiden aangevuld met TP53-onderdrukking via shRNA. Ze vervingen ook cMYC door niet-transformerende LMYC (kleincellig longcarcinoom geassocieerde MYC) om de veiligheid van de hiPSC's te verbeteren. Deze episomale plasmiden drukken 5 herprogrammeringsfactoren uit: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC en shRNA voor TP5317,18. Deze vectoren worden extra-chromosomaal gehandhaafd en gaan verloren uit de geherprogrammeerde cellen bij continue kweek, waardoor de lijnen transgeenvrij worden binnen 10-15 passages. Nucleofection is een gespecialiseerde vorm van elektroporatie die nucleïnezuren rechtstreeks in de kern van gastheercellen aflevert. Het is een efficiënte methode voor de toediening van de herprogrammeringsplasmiden in verschillende celtypen. Episomale plasmiden zijn kosteneffectief en compenseren de hoge kosten van nucleofection. Deze methode is efficiënt en reproduceerbaar onder geoptimaliseerde omstandigheden en levert stabiele iPSC's op uit een verscheidenheid aan somatische cellen. In dit protocol beschrijven we de methode voor het genereren van iPSC's uit fibroblasten geïsoleerd uit foetaal weefsel door nucleofection van episomale herprogrammeringsplasmiden. Hier zijn de gedetailleerde protocollen voor fibroblastisolatie van foetale chorionvilli, plasmidezuivering, nucleofection, plukken van kolonies uit de herprogrammeringsplaat en vaststelling van stabiele iPSC's.
Het is essentieel om de aanwezigheid van pluripotentiekenmerken in de nieuw gegenereerde iPSC's te bevestigen. Dit omvat het aantonen van pluripotentiegerelateerde factoren (bijv. alkalische fosfatase-expressie, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherine; meestal aangetoond met immunofluorescentie- of genexpressietests), identificatie van de drie kiemlagen door in vitro differentiatietests om hun differentiatiepotentiaal te valideren, karyotypering om het chromosomale gehalte te bepalen, STR-typering om identiteit met oudercellen vast te stellen, verlies van exogene genen te verifiëren, en strengere in vivo testen zoals teratoomvorming en tetraploïde complementatie. Hier beschrijven we karakteriseringsprotocollen van karyotypering, alkalische fosfatasekleuring van levende cellen, detectie van pluripotentiegerelateerde biomarkers door immunofluorescentie, in vitro differentiatietests en methode om verlies van exogene genen aan te tonen19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.15% trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>27250018</td>
			<td>G Banding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;, 6 diamidino-2-phenylindole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3003</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14353</td>
			<td>AP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMAXA Nucleofector II</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>-</td>
			<td>Nucleofection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmnioMAX II complete media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>11269016</td>
			<td>Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC021</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11059</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td>Contamination control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-Cadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nanog</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560109</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OCT3/4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>611202</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX17</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561590</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561469</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SSEA4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560073</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA 1-81</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4381</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Pluripotency medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Morphogenetic Factor 4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3016</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Human Type IV</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354245</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase blend</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8051</td>
			<td>Digestion of foetal chorionic villi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest EcoR1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0274</td>
			<td>Restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2518</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>S011</td>
			<td>G Banding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS001</td>
			<td>Fixative for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution human</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1884</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KR0368</td>
			<td>OriP, EBNA1 PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaryoMAX Colcemid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15210040</td>
			<td>Mitotic arrest for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10829018</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>M1151F</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB113</td>
			<td>Fixative for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin ventricular heavy chain &#945;/&#946;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1552</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHDF Nucleofector Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VAPD-1001</td>
			<td>Nucleofection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Fixing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27077</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hSK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27078</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hUL</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27080</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>&#160; Thermo Fisher Scientific,</td>
			<td>&#160;15070063</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving 
			Storage: Room temperature. 
			PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. 
			Storage: Room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid purification Kit- Midi prep</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12143</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride Solution</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB043</td>
			<td>Hypotonic solution for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Genomic DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Hepatocyte differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM255</td>
			<td>Hypotonic solution for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB031</td>
			<td>Permeabilisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Subculture of &#160;foetal chorionic villi fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB067</td>
			<td>Preparation of PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946; III tubulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of induced pluripotent stem cells from turner syndrome (45xo) fetal cells for downstream modelling of neurological deficits associated with the syndrome

Chromosomale aneuploïden veroorzaken ernstige aangeboren misvormingen, waaronder misvormingen van het centrale zenuwstelsel en foetale sterfte. Prenatale genetische screening is puur diagnostisch en verheldert het ziektemechanisme niet. Hoewel cellen van aneuploïde foetussen waardevol biologisch materiaal zijn met de chromosomale aneuploïdie, zijn deze cellen van korte duur, waardoor hun gebruik voor downstream onderzoeksexperimenten wordt beperkt. Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) modellen is een effectieve methode van celvoorbereiding voor eeuwigdurend behoud van aneuploïde eigenschappen. Ze zijn zelfvernieuwend en differentiëren in gespecialiseerde cellen die doen denken aan de embryonale ontwikkeling. IPSC's dienen dus als uitstekende hulpmiddelen om vroege ontwikkelingsgebeurtenissen te bestuderen. Turner syndroom (TS) is een zeldzame aandoening geassocieerd met een geheel of gedeeltelijk ontbrekend X-chromosoom. Het syndroom wordt gekenmerkt door onvruchtbaarheid, kleine gestalte, endocriene, metabole, auto-immuun- en cardiovasculaire aandoeningen en neurocognitieve defecten. Het volgende protocol beschrijft isolatie en kweek van fibroblasten uit TS (45XO) foetaal weefsel, generatie van integratievrije TSiPSCs door levering van episomale herprogrammeringsplasmiden door nucleofection gevolgd door karakterisering. De herprogrammering van TSiPSC's werden aanvankelijk gescreend door levende cel alkalische fosfatasekleuring gevolgd door uitgebreid onderzoek naar pluripotentie biomarkers. Geselecteerde kolonies werden mechanisch ontleed, meerdere keren gepasseerd en stabiele zelfvernieuwende cellen werden gebruikt voor verdere experimenten. De cellen drukten pluripotentietranscriptiefactoren OCT4, NANOG, SOX2, celoppervlakmarkers SSEA 4 en TRA1-81 uit, typisch voor pluripotente stamcellen. Het oorspronkelijke 45XO karyotype bleef na herprogrammering behouden. De TSiPSCs waren in staat om embryoïde lichamen te vormen en te differentiëren in cellen van endoderm, mesoderm en ectoderm die afstammingsspecifieke biomarkers tot expressie brengen ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). De exogene episomale plasmiden gingen spontaan verloren en werden na passage 15 in cellen niet gedetecteerd. Deze TSiPSC's zijn een waardevolle cellulaire bron voor het modelleren van defecte moleculaire en cellulaire neurologische ontwikkeling die neurocognitieve tekorten veroorzaakt die verband houden met het syndroom van Turner.

Generatie van integratievrije iPSC's van een spontaan geaborteerde foetus met 45XO karyotype We isoleerden fibroblasten uit FCV met een turnersyndroom (TS) specifiek 45XO karyotype en nucleofecteerden ze met episomale herprogrammeringsplasmiden om TSiPSCs te genereren die kunnen worden gebruikt voor downstream modellering van het syndroom, met name de geassocieerde neurologische tekorten (Figuur 1a&b). We gebruikten niet-integrerende episomale vectoren en...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome 45XO Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndr

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome 45XO Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Dit protocol beschrijft het genereren van integratievrije iPSC's uit foetale weefselfibroblasten door toediening van episomale plasmiden door nucleofection gevolgd door een beschrijving van methoden die worden gebruikt voor iPSC-karakterisering en neuronale differentiatie.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van het syndroom van Turner (45XO) foetale cellen voor downstream modellering van neurologische tekorten geassocieerd met het syndroom

Chromosomal aneuploidies cause severe congenital malformations including central nervous system malformations and fetal death. Prenatal genetic screening ...

Het syndroom van Turner is een zeldzame aandoening die gepaard gaat met een geheel of gedeeltelijk ontbrekend X-chromosoom. Het syndroom wordt gekenmerkt door onvruchtbaarheid, kleine gestalte, cardiovasculaire aandoeningen en neurocognitieve defecten. In sommige gevallen veroorzaakt het foetale sterfte.Hoewel somatische cellen van aneuploïde foetussen biologisch waardevol zijn, zijn ze van korte duur, waardoor hun gebruik in onderzoek wordt beperkt. Generatie van iPSC is dus een effectieve methode van celvoorbereiding voor eeuwigdurend behoud van de aneuploïde eigenschappen. Ze zijn zelfvernieuwend en kunnen differentiëren in gespecialiseerde celtypen die doen denken aan de vroege embryonale ontwikkeling.Levering van niet-integrerende episomaal herprogrammeringsplasmiden door middel van nucleaire fictie is een efficiënte en reproduceerbare methode voor het genereren van volledig geherprogrammeerde en stabiele iPSC's. Deze methode kan ook worden gebruikt op cellen die moeilijk te programmeren zijn. In dit protocol beschrijven we regeneratie van iPSC's uit foetaal materiaal met aneupliod.Breng de verzamelde foetale chorionvlokken over in een steriel petrischaaltje. Was het meerdere keren met PBS met 1X antibiotische antimycotische oplossing. Verwijder de PBS volledig door te pipetteren.Voeg 1 ml collagenasemengsel toe aan de villi en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten of totdat het weefsel uiteenvalt. Neutraliseer na incubatie het collagenase door media toe te voegen die 10% foetaal runderserum bevatten. Breng de inhoud van de petrischaal over in een buisje van 15 ml.Centrifugeer de digest om de gedesintegreerde villi en vrijgekomen cellen te verzamelen. Decanteer het bovennatuurlijk voorzichtig. Plaat gedesintegreerde villi samen met vrijgegeven cellen in een T25-kweekkolf en AmnioMAX-media en groeien tot een confluent fibroblastcultuur is verkregen.Breid fibroblasten en cultuur uit om voorraden voor te bereiden voor gebruik in latere transfectie- en karakteriseringsexperimenten. Bereid culturen van alkali voor die de herprogrammeringsplasmiden bevatten. Isoleer de plasmiden met behulp van midi plasmide zuivering kit, volgens de instructies van de fabrikant.Hang elke pallet opnieuw op in een geschikt volume DNAse RNAse-vrij water om een eindconcentratie van 1 microgram per milliliter te verkrijgen. Controleer de plasmiden met behulp van de ECoR1 restrictieverteringskit, volgens de instructies van de fabrikant. Trypsiniseren van de chorion villi fibroblasten.Neutraliseer en centrifugeer om de cellen te verzamelen. Decanteer het supernatant en suspensie de cellen opnieuw in 5 ml OPTI-MEM. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en verwijder 1 miljoen cellen voor nucleofection.Centrifuge om celpallet te verkrijgen. Voer nucleofection uit met Amaxa NHDF Neucleofactor Kit. Bereid neucleofactorreagens door 0,5 ml supplement en 2,25 ml nucleofactoroplossing in de kit te mengen.Verwijder 100 microliter nucleofactoroplossing en voeg er 1 microgram van elk plasmide aan toe. Suspenseer voorzichtig 1 miljoen cellen in deze mix. Breng de cel-DNA-suspensie over in cuvette en zorg ervoor dat het monster de bodem van de cuvette bedekt zonder luchtbellen.Sluit de cuvette af en steek deze in de houder. Selecteer het nucleofactorprogramma D-23 voor hoge efficiëntie en pas het toe. Verwijder cuvette uit de houder en voeg 1 ml AmnioMAX-media toe.Breng de inhoud voorzichtig over in een met weefselkweek behandelde petrischaal met behulp van de pipet in de kit. Incubeer de cellen in een bevochtigde kooldioxide-incubator bij 37 graden Celsius. Houd de cellen gedurende 10 dagen in AmnioMAX-media en schakel vervolgens gedurende 20 dagen over op pluripotentiemedium.Voor iPSC-expansie ontleedt u handmatig de embryonale stamcelachtige kolonies die in de herprogrammeringsschaal zijn gevormd met behulp van een getrokken glazen pipet. Verspreid iPSC's op de juiste manier en masseer om de vijf tot zeven dagen. De iPCSs waren positief voor pluripotentiemarker alkalische fosfatase.Genereer embryoïde lichamen door de iPSC-kolonies in kleine stukjes te snijden en ze in petrischalen met een lage aanhechting in embryoïde lichaamsmedium te platen. Ectodermdifferentiatie wordt geïnduceerd door dag vier embryoïde lichamen te plateren in ectodermdifferentiatiemedium. Evenzo wordt mesodermdifferentiatie geïnduceerd door dag acht embryoïde lichamen in mesodermdifferentiatiemedium te platen.Voor het induceren van endoderm differentiatie, cultuur iPSC's in een monolaag in endoderm differentiatie medium. Morfologische veranderingen in fibroblasten werden gecontroleerd in de loop van de herprogrammering. Ze drukken epitheelcelachtige morfologie uit en vormden compacte kolonies.De cellen hadden ook een hoogte nucleus tot cytoplasmatische verhouding, typisch voor pluripotente cellen in cultuur. De iPSC's bezaten een 45 XO-dragertype en waren positief voor pluripotentiemarkers OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 en E-CADHERIN. De cellen werden gekleurd voor representatieve kiemlaagmarkers.Het syndroom van Turner ontwikkelt dus neurocognitieve tekorten. Neuronen afgeleid van turner syndroom iPSC kunnen een uitstekend model zijn. Dit is gemodelleerd in een petriplaat om de nieuwe lijn van het normale disassociatieve Turner-syndroom te begrijpen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van fibroblast-achtige synoviocyten Geïsoleerd van de gewrichten van patiënten met reumatoïde artritis

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke Melanoom-Tumor-infiltrerende lymfocyten

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Gedefinieerd en Scalable Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Chondrogenische Pelletvorming van Koord Bloed afgeleide geïnduceerde Pluripotente Stamcellen

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van gestandaardiseerde en reproduceerbaar reukkolf-type cerebrale Organoids van mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van menselijke primordiale geslachtscellen-achtige cellen aan de oppervlakte van Embryoid instanties van primer-pluripotent geïnduceerde pluripotente stamcellen

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van 3D huid Organoid van koord bloed afkomstige geïnduceerde pluripotente stamcellen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...