Name: generation of induced pluripotent stem cells from turner syndrome (45xo) fetal cells for downstream modelling of neurological deficits associated with the syndrome
Uploaded: 2021-12-04T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome 45XO Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndr

Le soutien financier pour la recherche ci-dessus a été fourni par Manipal Academy of Higher Education. La caractérisation de la lignée a été réalisée en partie dans le laboratoire de M.M. Panicker au NCBS. Nous remercions Anand Diagnostic Laboratory pour son aide avec le caryotypage.

Les FCV ont été obtenus de l’hôpital Manipal, à Bangalore, sous l’approbation du comité d’éthique des hôpitaux Manipal.
REMARQUE : Voir le tableau 1 pour la composition de tous les tampons et solutions.
1. Isolement des fibroblastes des villosités chorioniques fœtales (FCV)
<ol><li>
Prélèvement d’échantillons et désintégration tissulaire dans la collagénase
	<ol>
<li>Recueillir le FCV dans d...

<ol>
	<li>Verlinsky, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell+lines+with+genetic+disorders.">Human embryonic stem cell lines with genetic disorders.</a> Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).</li><li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Study+of+Fragile+X+Syndrome+Using+Human+Embryonic+Stem+Cells+Derived+from+Preimplantation+Genetically+Diagnosed+Embryos.">Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos.</a> Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).</li><li>Biancotti, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Embryonic+Stem+Cells+as+Models+for+Aneuploid+Chromosomal+Syndromes.">Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes.</a> STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+abnormal+early+development+with+induced+pluripotent+stem+cells+from+aneuploid+syndromes.">Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes.</a> Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).</li><li>Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turner+syndrome:+mechanisms+and+management.">Turner syndrome: mechanisms and management.</a> Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniparental+disomy+of+the+entire+X+chromosome+in+Turner+syndrome+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Discovery. 1, 15022 (2015).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+from+an+adult+male+with+45,X/46,XY+mosaicism.">Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism.</a> Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).</li><li>Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. 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href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+Disease+Patient-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Viral+Reprogramming+Factors.">Parkinson's Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors.</a> Cell. 136, 964-977 (2009).</li><li>Somers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgene-Free+Lung+Disease-Specific+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+a+Single+Excisable+Lentiviral+Stem+Cell+Cassette.">Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette.</a> STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).</li><li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li><li>Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+Without+Viral+Integration.">Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration.</a> Science. 322, 945-949 (2008).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).</li><li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Reprogramming+to+Pluripotency+and+Directed+Differentiation+of+Human+Cells+with+Synthetic+Modified+mRNA.">Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins.">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Vector+and+Transgene+Sequences.">Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li><li>Mart&#237;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pluripotent+stem+cells.">Characterization of pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).</li><li>Ambartsumyan, G., Clark, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+and+early+human+embryo+development.">Aneuploidy and early human embryo development.</a> Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).</li></ol>

La génération de modèles cellulaires stables de tissu fœtal cytogénétiquement anormal est nécessaire pour perpétuer un phénotype défectueux. La voie iPSC est la méthode la plus efficace de préparation cellulaire pour la conservation perpétuelle des propriétés défectueuses20.
Les cellules souches pluripotentes (CSE) présentent des propriétés d’auto-renouvellement et de différenciation en cellules spécialisées qui rappellent les embryons de clivage...

Les aneuploïdiens entraînent des malformations congénitales et des pertes de grossesse chez l’homme. ~ 50% à 70% des échantillons de pertes de grossesse présentent des anomalies cytogénétiques. Les embryons aneuploïdes perdus au début de la grossesse ne peuvent pas être facilement obtenus pour une analyse expérimentale, ce qui soulève la nécessité de développer d’autres modèles représentant étroitement l’embryogenèse humaine. Des cellules souches pluripotentes induites (CSI) dérivées de cellules diagnostiquées avec des troubles génétiques ont été utilisées pour modéliser les irrégularités génétiques représentatives et leurs conséquences sur le développement du fœtus1,2,3,4. Ces CSPi ressemblent à des cellules épiblastiques de l’embryon en développement et peuvent récapituler les événements précoces de la formation de l’embryon. Ils permettent de comprendre et de caractériser le programme de développement des lignées cellulaires et des modèles chez les embryons de mammifères précoces. CSPi dérivées précédemment de fibroblastes cutanés et d’amniocytes provenant de tests de diagnostic prénatal de syndromes d’aneuploïdie comme la monosomie X (syndrome de Turner), la trisomie 8 (syndrome de Warkany 2), la trisomie 13 (syndrome de Patau) et la trisomie partielle 11; 22 (syndrome d’Emanuel) ont fourni des informations précieuses concernant l’échec du développement4.
Le syndrome de Turner (TS) est une maladie rare caractérisée par l’infertilité féminine, la petite taille, des troubles endocriniens et métaboliques, un risque accru de maladie auto-immune et une prédisposition aux maladiescardiovasculaires 5. Bien qu’il s’agit du seul syndrome de monosomie survivable, il est également mortel pour l’embryon en développement provoquant des avortements spontanés6. Les individus survivants atteints de TS présentent des degrés d’altération du matériel chromosomique X dans leurs cellules. Les caryotypes vont de la perte complète d’un chromosome X (45,XO) à des mosaïques comme 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, la présence de chromosomes annulaires, la présence de matériel chromosomique Y,etc. 5.
Le diagnostic du syndrome se fait généralement par caryotypage du sang des individus symptomatiques et prélèvement de villosités chorioniques (CVS) pour détecter les syndromes d’aneuploïdie précoce. Étant donné que les syndromes d’aneuploïdie représentent environ 30% des avortements spontanés, il est courant de caryotyper le produit de la conception (POC) lors d’un avortement spontané. Ces cellules fœtales, y compris les villosités chorioniques possédant l’anomalie cytogénétique et les CSPi qui en sont dérivées, constituent une source précieuse de matériel biologique pour étudier les syndromes d’aneuploïdie4,6. Les CSI TS ont déjà été établies à partir d’amniocytes via la reprogrammation rétrovirale4,de fibroblastes de villosités chorioniques (obtenus par diagnostic prénatal) via une reprogrammation rétrovirale6,de cellules mononucléaires sanguines7 via la reprogrammation du virus Sendai et de fibroblastes cutanés d’individus TS via une reprogrammation lentivirale4 . Étant donné que l’objectif principal de notre laboratoire est de comprendre l’échec du développement, nous avons généré des CST iPSC à partir de POC, en particulier la composante des villosités chorioniques d’un avortement spontané8. Toutes les cellules isolées de ce tissu fœtal avaient un caryotype 45XO et produisaient des CS IPC avec le même caryotype. Ces CSPe sont uniques car elles sont les premières à être générées à partir d’un fœtus avorté et constituent une ressource précieuse pour étudier les échecs de grossesse liés à l’aneuploïdie. Cet article fournit une méthodologie détaillée de la génération de CSPic à partir de cette source cellulaire unique via la reprogrammation épisomique.
Les premières méthodes de génération d’iPSC utilisaient la transduction virale et les transposons pour fournir les facteurs de reprogrammation. Les méthodes d’induction des cellules à la pluripotence ont évolué de l’intégration des vecteurs rétroviraux9,des vecteurs lentiviraux excisables10,11 et des méthodes basées sur les transposons12 aux vecteurs adénoviraux non intégrateurs13 et aux vecteurs à base du virus Sendai14. La reprogrammation rétrovirale et lentivirale, bien qu’efficace, implique l’intégration des facteurs de reprogrammation dans les chromosomes de l’hôte, provoquant des mutations d’insertion qui ont des effets imprévus dans les CSI. De plus, la reprogrammation virale empêche l’application translationnelle des CSI. Les systèmes à base d’ARN15 et d’administration directe de protéines16 ont été explorés pour éliminer complètement les risques potentiels associés à l’utilisation de virus et de transfections d’ADN. Cependant, ces méthodes se sont avérées inefficaces.
En 2011, Okita et al. ont rapporté une amélioration de l’efficacité de la reprogrammation par des plasmides épisomiques augmentés par la suppression de TP53 via shRNA. Ils ont également remplacé le cMYC par un LMYC (MYC associé au carcinome pulmonaire à petites cellules) non transformant pour améliorer la sécurité des hiPSC. Ces plasmides épisomiques expriment 5 facteurs de reprogrammation : OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC et shRNA pour TP5317,18. Ces vecteurs sont maintenus extra-chromosomiquement et perdus des cellules reprogrammées lors d’une culture continue, rendant ainsi les lignes sans transgène dans 10-15 passages. La nucléofection est une forme spécialisée d’électroporation qui délivre des acides nucléiques directement dans le noyau des cellules hôtes. C’est une méthode efficace pour l’administration des plasmides de reprogrammation dans divers types de cellules. Les plasmides épisomiques sont rentables et compensent les coûts élevés de la nucléofection. Cette méthode est efficace et reproductible dans des conditions optimisées, produisant des CSP stables à partir d’une variété de cellules somatiques. Dans ce protocole, nous décrivons la méthode de génération de CSI i à partir de fibroblastes isolés du tissu fœtal par nucléofection de plasmides de reprogrammation épisomique. Voici les protocoles détaillés pour l’isolement des fibroblastes des villosités chorioniques fœtales, la purification des plasmides, la nucléofection, la cueillette des colonies à partir de la plaque de reprogrammation et l’établissement de CSI stables.
Il est essentiel de confirmer la présence de traits de pluripotence dans les IPSC nouvellement générés. Cela comprend la démonstration de facteurs liés à la pluripotence (par exemple, expression de la phosphatase alcaline, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadhérine; généralement montré avec des tests d’immunofluorescence ou d’expression génique), l’identification des trois couches germinales par des tests de différenciation in vitro pour valider leurs potentiels de différenciation, le caryotypage pour déterminer le contenu chromosomique, le typage STR pour établir l’identité avec les cellules mères, vérifier la perte de gènes exogènes, et des essais in vivo plus rigoureux tels que la formation de tératome et la complémentation tétraploïde. Nous décrivons ici les protocoles de caractérisation du caryotypage, la coloration de la phosphatase alcaline des cellules vivantes, la détection de biomarqueurs liés à la pluripotence par immunofluorescence, les tests de différenciation in vitro et la méthode pour démontrer la perte de gènes exogènes19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.15% trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>27250018</td>
			<td>G Banding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;, 6 diamidino-2-phenylindole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3003</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14353</td>
			<td>AP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMAXA Nucleofector II</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>-</td>
			<td>Nucleofection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmnioMAX II complete media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>11269016</td>
			<td>Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC021</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11059</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td>Contamination control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-Cadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nanog</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560109</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OCT3/4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>611202</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX17</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561590</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561469</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SSEA4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560073</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA 1-81</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4381</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Pluripotency medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Morphogenetic Factor 4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3016</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Human Type IV</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354245</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase blend</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8051</td>
			<td>Digestion of foetal chorionic villi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest EcoR1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0274</td>
			<td>Restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2518</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>S011</td>
			<td>G Banding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS001</td>
			<td>Fixative for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution human</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1884</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KR0368</td>
			<td>OriP, EBNA1 PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaryoMAX Colcemid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15210040</td>
			<td>Mitotic arrest for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10829018</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>M1151F</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB113</td>
			<td>Fixative for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin ventricular heavy chain &#945;/&#946;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1552</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHDF Nucleofector Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VAPD-1001</td>
			<td>Nucleofection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Fixing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27077</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hSK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27078</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hUL</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27080</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>&#160; Thermo Fisher Scientific,</td>
			<td>&#160;15070063</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving 
			Storage: Room temperature. 
			PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. 
			Storage: Room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid purification Kit- Midi prep</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12143</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride Solution</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB043</td>
			<td>Hypotonic solution for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Genomic DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Hepatocyte differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM255</td>
			<td>Hypotonic solution for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB031</td>
			<td>Permeabilisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Subculture of &#160;foetal chorionic villi fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB067</td>
			<td>Preparation of PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946; III tubulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of induced pluripotent stem cells from turner syndrome (45xo) fetal cells for downstream modelling of neurological deficits associated with the syndrome

Les aneuploïdies chromosomiques provoquent de graves malformations congénitales, notamment des malformations du système nerveux central et la mort fœtale. Le dépistage génétique prénatal est purement diagnostique et n’élucide pas le mécanisme de la maladie. Bien que les cellules des fœtus aneuploïdes soient du matériel biologique précieux portant l’aneuploïdie chromosomique, ces cellules sont de courte durée, ce qui limite leur utilisation pour les expériences de recherche en aval. La génération de modèles de cellules souches pluripotentes induites (CSIp) est une méthode efficace de préparation cellulaire pour la conservation perpétuelle des caractères aneuploïdes. Ils se renouvellent d’eux-mêmes et se différencient en cellules spécialisées qui rappellent le développement embryonnaire. Ainsi, les CSPe constituent d’excellents outils pour étudier les événements de développement précoces. Le syndrome de Turner (TS) est une affection rare associée à un chromosome X complètement ou partiellement manquant. Le syndrome est caractérisé par l’infertilité, la petite taille, les troubles endocriniens, métaboliques, auto-immuns et cardiovasculaires et les défauts neurocognitifs. Le protocole suivant décrit l’isolement et la culture de fibroblastes à partir de tissu fœtal TS (45XO), la génération de TSiPSC sans intégration par l’administration de plasmides de reprogrammation épisomique par nucléofection suivie d’une caractérisation. Les TSiPSC de reprogrammation ont d’abord été examinés par coloration de la phosphatase alcaline des cellules vivantes, suivie d’un sondage approfondi pour les biomarqueurs de pluripotence. Les colonies sélectionnées ont été disséquées mécaniquement, ont été croisées plusieurs fois et des cellules stables auto-renouvelées ont été utilisées pour d’autres expériences. Les cellules ont exprimé les facteurs de transcription de pluripotence OCT4, NANOG, SOX2, les marqueurs de surface cellulaire SSEA 4 et TRA1-81 typiques des cellules souches pluripotentes. Le caryotype 45XO original a été conservé après la reprogrammation. Les TSiPSC ont pu former des corps embryoïdes et se différencier en cellules d’endoderme, de mésoderme et d’ectoderme exprimant des biomarqueurs spécifiques à la lignée ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). Les plasmides épisomiques exogènes ont été perdus spontanément et non détectés après le passage 15 dans les cellules. Ces TSiPSC sont une ressource cellulaire précieuse pour modéliser le neurodéveloppement moléculaire et cellulaire défectueux provoquant des déficits neurocognitifs associés au syndrome de Turner.

Génération de CSPe sans intégration à partir d’un fœtus avorté spontanément avec un caryotype 45XO Nous avons isolé des fibroblastes de FCV avec un caryotype 45XO spécifique du syndrome de Turner (TS) et les avons nucléofectés avec des plasmides de reprogrammation épisomique pour générer des TSiPSC qui peuvent être utilisés pour la modélisation en aval du syndrome, en particulier les déficits neurologiques associés(Figure 1a& b). Nous...

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Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome 45XO Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Ce protocole décrit la génération de CSI sans intégration à partir de fibroblastes de tissu fœtal par administration de plasmides épisomiques par nucléofection suivie d’une description des méthodes utilisées pour la caractérisation de l’iPSC et la différenciation neuronale.

Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules fœtales du syndrome de Turner (45XO) pour la modélisation en aval des déficits neurologiques associés au syndrome

Chromosomal aneuploidies cause severe congenital malformations including central nervous system malformations and fetal death. Prenatal genetic screening ...

Le syndrome de Turner est une maladie rare associée à un chromosome X complètement ou partiellement manquant. Le syndrome est caractérisé par l’infertilité, la petite taille, les troubles cardiovasculaires et les défauts neurocognitifs. Dans certains cas, il provoque la mort fœtale.Bien que les cellules somatiques des fœtus aneuploïdes soient biologiquement précieuses, elles sont de courte durée, limitant ainsi leur utilisation dans la recherche. La génération d’iPSC est donc une méthode efficace de préparation cellulaire pour la conservation perpétuelle des caractères aneuploïdes. Ils se renouvellent automatiquement et peuvent se différencier en types cellulaires spécialisés qui rappellent le développement embryonnaire précoce.L’administration de plasmides de reprogrammation épisomique non intégrateurs par fiction nucléaire est une méthode efficace et reproductible pour générer des IPSC complètement reprogrammés et stables. Cette méthode peut également être utilisée sur des cellules difficiles à programmer. Dans ce protocole, nous décrivons la régénération des CSPe à partir de matériel fœtal avec anéliod.Transférer les villosités chorioniques fœtales collectées dans une boîte de Petri stérile. Lavez-le plusieurs fois avec du PBS contenant 1X solution antibiotique antimycotique. Retirez complètement le PBS par pipetage.Ajouter 1 ml de mélange de collagénase aux villosités et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que le tissu se désintègre. Après incubation, neutraliser la collagénase en ajoutant un milieu contenant 10% de sérum bovin fœtal. Transférer le contenu de la boîte de Petri dans un tube de 15 ml.Centrifugez le digest pour recueillir les villosités désintégrées et les cellules libérées. Décantez soigneusement le surnageant. Les villosités désintégrées sur plaque ainsi que les cellules libérées dans une fiole de culture T25 et un milieu AmnioMAX et se développent jusqu’à l’obtention d’une culture de fibroblastes confluents.Développer les fibroblastes et la culture pour préparer les stocks en pour une utilisation dans des expériences ultérieures de transfection et de caractérisation. Préparer des cultures d’alcalis contenant les plasmides de reprogrammation. Isolez les plasmides à l’aide du kit de purification du plasmide Midi, conformément aux instructions du fabricant.Re-suspendez chaque palette dans un volume approprié d’eau sans ARNi de DNAse pour obtenir une concentration finale de 1 microgramme par millilitre. Vérifiez les plasmides à l’aide du kit de digestion de restriction ECoR1, en suivant les instructions du fabricant. Trypsiniser les fibroblastes de villosités chorioniques.Neutraliser et centrifuger pour collecter les cellules. Décantez le surnageant et re-suspendez les cellules dans 5 ml d’OPTI-MEM. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et retirez 1 million de cellules pour la nucléofection.Centrifugeuse pour obtenir une palette de cellules. Effectuez une nucléofection à l’aide du kit Amaxa NHDF Neucleofactor. Préparer le réactif neucléofactoriel en mélangeant un supplément de 0,5 mL et une solution de nucléofacteur de 2,25 mL fournis dans le kit.Retirez 100 microlitres de solution de nucléofacteur et ajoutez-y 1 microgramme de chaque plasmide. Re-suspendez doucement 1 million de cellules dans ce mélange. Transférer la suspension d’ADN cellulaire dans la cuvette, en s’assurant que l’échantillon recouvre le fond de la cuvette sans bulles d’air.Coiffez la cuvette et insérez-la dans le support. Sélectionnez le programme de nucléofacteur D-23 pour une efficacité élevée et appliquez. Retirez la cuvette du support et ajoutez 1 mL de support AmnioMAX.Transférer doucement le contenu dans une boîte de Petri traitée par culture tissulaire, à l’aide de la pipette fournie dans le kit. Incuber les cellules dans un incubateur à dioxyde de carbone humidifié à 37 degrés Celsius. Maintenez les cellules dans le milieu AmnioMAX pendant 10 jours, puis passez au milieu de pluripotence pendant 20 jours.Pour l’expansion de l’iPSC, disséquez manuellement les colonies embryonnaires ressemblant à des cellules souches formées dans la boîte de reprogrammation à l’aide d’une pipette en verre tirée. Propager les CSPe de manière appropriée et masser tous les cinq à sept jours. Les iPCS étaient positifs pour la phosphatase alcaline marqueur de pluripotence.Générer des corps embryonnaires en coupant les colonies d’iPSC en petits morceaux et en les plaquant dans des boîtes de Petri à faible attachement dans un milieu de corps embryoïde. La différenciation ectodermique est induite par le jour de placage de quatre corps embryoïdés dans un milieu de différenciation ectodermique. De même, la différenciation du mésoderme est induite par le placage des corps embryonnaires du jour huit dans le milieu de différenciation du mésoderme.Pour induire la différenciation endodermique, culture des CS IPC dans une monocouche dans un milieu de différenciation endodermique. Les changements morphologiques dans les fibroblastes ont été surveillés au cours de la reprogrammation. Ils expriment une morphologie semblable à celle des cellules épithéliales et forment des colonies compactes.Les cellules avaient également un rapport noyau / cytoplasmique en hauteur, typique des cellules pluripotentes en culture. Les iPSC possédaient un type de porteuse 45 XO et étaient positifs pour les marqueurs de pluripotence OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 et E-CADHERIN. Les cellules ont été colorées pour obtenir des marqueurs représentatifs de la couche germinale.Le syndrome de Turner développe ainsi des déficits neurocognitifs. Les neurones dérivés du syndrome de Turner iPSC peuvent être un excellent modèle. Ceci est modélisé dans une plaque de Pétri pour comprendre la nouvelle ligne du syndrome de Turner dissociatif normal.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Frozen Buffy Manteaux en utilisant non-intégration épisomique plasmides

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Recherche

Biologie du développement

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Génération de cellules souches induites pluripotentes Utilisation synoviocytes fibroblaste Isolé Joints de la polyarthrite rhumatoïde Les patients

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Génération de Induced cellules souches pluripotentes à partir de mélanome humain Lymphocytes tumorales infiltrant

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Induite cellules souches pluripotentes génération de cellules sanguines utilisant Sendai Virus et Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Génération d&#39;Intégration-libres induits des cellules souches pluripotentes à partir de cellules mononucléaires sang périphérique humain utilisant épisomique Vecteurs

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Définition et génération évolutive des cellules hépatocytes-like de pluripotentes humaines Cellules souches

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Formation de granulés chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites par sang de cordon

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Génération de type prosencéphale standardisées et reproductibles organoïdes cérébrale de l’homme induites par les cellules souches pluripotentes

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Génération de cellules humaines de ressemblant cellules germinales primordiales à la Surface du corps embryoïdes de pluripotence amorcée induite par les cellules souches pluripotentes

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Génération de peau 3D Organoïde de dérivés du sang de cordon induite par les cellules souches pluripotentes

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...