Name: generation of induced pluripotent stem cells from turner syndrome (45xo) fetal cells for downstream modelling of neurological deficits associated with the syndrome
Uploaded: 2021-12-04T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome 45XO Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndr

Il sostegno finanziario per la ricerca di cui sopra è stato fornito da Manipal Academy of Higher Education. La caratterizzazione della linea è stata condotta parzialmente nel laboratorio di M.M. Panicker presso NCBS. Ringraziamo Anand Diagnostic Laboratory per l'assistenza con il cariotipo.

FCV sono stati ottenuti dal Manipal Hospital, Bengaluru, sotto l'approvazione del Comitato Etico degli Ospedali Manipal.
NOTA: vedere la Tabella 1 per la composizione di tutti i buffer e le soluzioni.
1. Isolamento dei fibroblasti dai villi corionici fetali (FCV)
<ol><li>
Raccolta del campione e disintegrazione dei tessuti nella collagenasi
	<ol>
<li>Raccogliere FCV in condizioni sterili in soluzione salina tampon...

<ol>
	<li>Verlinsky, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell+lines+with+genetic+disorders.">Human embryonic stem cell lines with genetic disorders.</a> Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).</li><li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Study+of+Fragile+X+Syndrome+Using+Human+Embryonic+Stem+Cells+Derived+from+Preimplantation+Genetically+Diagnosed+Embryos.">Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos.</a> Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).</li><li>Biancotti, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Embryonic+Stem+Cells+as+Models+for+Aneuploid+Chromosomal+Syndromes.">Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes.</a> STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+abnormal+early+development+with+induced+pluripotent+stem+cells+from+aneuploid+syndromes.">Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes.</a> Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).</li><li>Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turner+syndrome:+mechanisms+and+management.">Turner syndrome: mechanisms and management.</a> Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniparental+disomy+of+the+entire+X+chromosome+in+Turner+syndrome+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Discovery. 1, 15022 (2015).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+from+an+adult+male+with+45,X/46,XY+mosaicism.">Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism.</a> Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).</li><li>Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. 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href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+Disease+Patient-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Viral+Reprogramming+Factors.">Parkinson's Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors.</a> Cell. 136, 964-977 (2009).</li><li>Somers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgene-Free+Lung+Disease-Specific+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+a+Single+Excisable+Lentiviral+Stem+Cell+Cassette.">Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette.</a> STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).</li><li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li><li>Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+Without+Viral+Integration.">Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration.</a> Science. 322, 945-949 (2008).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).</li><li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Reprogramming+to+Pluripotency+and+Directed+Differentiation+of+Human+Cells+with+Synthetic+Modified+mRNA.">Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins.">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Vector+and+Transgene+Sequences.">Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li><li>Mart&#237;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pluripotent+stem+cells.">Characterization of pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).</li><li>Ambartsumyan, G., Clark, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+and+early+human+embryo+development.">Aneuploidy and early human embryo development.</a> Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).</li></ol>

La generazione di modelli cellulari stabili di tessuto fetale citogeneticamente anormale è necessaria per perpetuare il fenotipo difettoso. La via iPSC è il metodo più efficace di preparazione cellulare per la conservazione perpetua delle proprietà difettose20.
Le cellule staminali pluripotenti (PSC) mostrano proprietà di auto-rinnovamento e differenziazione in cellule specializzate che ricordano gli embrioni di scissione precoce21. Quindi, ...

Le aneuploidie portano a difetti alla nascita / malformazioni congenite e perdita di gravidanza negli esseri umani. ~ 50% -70% dei campioni da perdite di gravidanza mostrano anomalie citogenetiche. Gli embrioni aneuploidi persi all'inizio della gravidanza non possono essere facilmente ottenuti per l'analisi sperimentale, sollevando la necessità di sviluppare altri modelli che rappresentino da vicino l'embriogenesi umana. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da cellule con diagnosi di disturbi genetici sono state utilizzate per modellare le irregolarità genetiche rappresentative e le loro conseguenze sullo sviluppo fetale1,2,3,4. Queste iPSC assomigliano alle cellule epiblastiche dell'embrione in via di sviluppo e possono ricapitolare i primi eventi di formazione dell'embrione. Consentono la comprensione e la caratterizzazione del programma di sviluppo dei lignaggi cellulari e il patterning nei primi embrioni di mammiferi. iPSC derivate in precedenza da fibroblasti cutanei e amniociti da test diagnostici prenatali di sindromi aneuploidiche come la monosomia X (sindrome di Turner), la trisomia 8 (sindrome di Warkany 2), la trisomia 13 (sindrome di Patau) e la trisomia parziale 11; 22 (sindrome di Emanuel) hanno fornito preziose informazioni sullo sviluppo fallito4.
La sindrome di Turner (TS) è una condizione rara caratterizzata da infertilità femminile, bassa statura, disturbi endocrini e metabolici, aumento del rischio di malattie autoimmuni e predisposizione alle malattie cardiovascolari5. Sebbene sia l'unica sindrome da monosomia sopravvissuta, è anche letale per l'embrione in via di sviluppo causando aborti spontanei6. Gli individui sopravvissuti con TS presentano gradi di alterazione del materiale cromosomico X nelle loro cellule. I cariotipi vanno dalla perdita completa di un cromosoma X (45,XO) a mosaici come 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, la presenza di cromosomi ad anello, la presenza di materiale cromosomico Y, ecc5.
La diagnosi della sindrome viene generalmente effettuata mediante cariotipizzazione del sangue di individui sintomatici e campionamento dei villi coriali (CVS) per rilevare le sindromi da aneuploidia precoce. Poiché le sindromi aneuploidiche rappresentano circa il 30% degli aborti spontanei, è di routine cariotipizzare il prodotto del concepimento (POC) su un aborto spontaneo. Queste cellule fetali tra cui i villi coriali che possiedono l'anomalia citogenetica e le iPSC da esse derivate forniscono una preziosa fonte di materiale biologico per studiare le sindromi da aneuploidia4,6. Le iPSC TS sono state precedentemente stabilite da amniociti tramite riprogrammazione retrovirale4, fibroblasti di villi coriali (ottenuti attraverso diagnosi prenatale) tramite riprogrammazione retrovirale6, da cellule mononucleate del sangue7 tramite riprogrammazione del virus Sendai e da fibroblasti cutanei di individui TS tramite riprogrammazione lentivirale4 . Poiché l'obiettivo principale del nostro laboratorio è comprendere il fallimento dello sviluppo, abbiamo generato iPSC TS da POC, in particolare la componente villi corionica di un aborto spontaneo8. Tutte le cellule isolate da questo tessuto fetale avevano un cariotipo 45XO e producevano iPSC con lo stesso cariotipo. Queste iPSC sono uniche in quanto sono le prime ad essere generate da un feto abortito e forniscono una risorsa preziosa per studiare i fallimenti della gravidanza legati all'aneuploidia. Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata della generazione di iPSC da questa fonte cellulare unica tramite riprogrammazione episomiale.
I primi metodi di generazione di iPSC utilizzavano la trasduzione virale e i trasposoni per fornire i fattori di riprogrammazione. I metodi per indurre le cellule alla pluripotenza si sono evoluti dall'uso di vettori retroviraliintegranti 9,vettori lentivirali escissibili10,11 e metodi basati su trasposoni12 a vettori adenovirali non integranti13 e vettori basati sul virus Sendai14. La riprogrammazione retrovirale e lentivirale, sebbene efficiente, comporta l'integrazione dei fattori di riprogrammazione nei cromosomi dell'ospite, causando mutazioni di inserzione che hanno effetti imprevisti nelle iPSC. Inoltre, la riprogrammazione virale impedisce l'applicazione traslazionale delle iPSC. Sono stati esplorati i sistemi basati sull'RNA15 e il rilascio diretto di proteine16 per eliminare completamente i potenziali rischi associati all'uso di virus e trasfezioni di DNA. Tuttavia, questi metodi si sono dimostrati inefficienti.
Nel 2011, Okita et al. hanno riportato una migliore efficienza di riprogrammazione da parte dei plasmidi episomiali aumentata con la soppressione di TP53 tramite shRNA. Hanno anche sostituito cMYC con LMYC non trasformante (MYC associato al carcinoma polmonare a piccole cellule) per migliorare la sicurezza delle hiPSC. Questi plasmidi episomiali esprimono 5 fattori di riprogrammazione: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC e shRNA per TP5317,18. Questi vettori vengono mantenuti extra-cromosomicamente e persi dalle cellule riprogrammate su coltura continua, rendendo così le linee prive di transgeni entro 10-15 passaggi. La nucleofezione è una forma specializzata di elettroporazione che fornisce acidi nucleici direttamente nel nucleo delle cellule ospiti. È un metodo efficiente per la consegna dei plasmidi di riprogrammazione in vari tipi di cellule. I plasmidi episomiali sono convenienti e compensano gli alti costi della nucleofezione. Questo metodo è efficiente e riproducibile in condizioni ottimizzate producendo iPSC stabili da una varietà di cellule somatiche. In questo protocollo, descriviamo il metodo per la generazione di iPSC da fibroblasti isolati dal tessuto fetale mediante nucleofezione di plasmidi di riprogrammazione episomiale. Ecco i protocolli dettagliati per l'isolamento dei fibroblasti dai villi corionici fetali, la purificazione dei plasmidi, la nucleofezione, il prelievo di colonie dalla piastra di riprogrammazione e la creazione di iPSC stabili.
È essenziale confermare la presenza di tratti di pluripotenza nelle iPSC appena generate. Ciò include la dimostrazione di fattori correlati alla pluripotenza (ad esempio, espressione di fosfatasi alcalina, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-caderina; di solito mostrata con saggi di immunofluorescenza o espressione genica), identificazione dei tre strati germinali mediante saggi di differenziazione in vitro per convalidare i loro potenziali di differenziazione, cariotipizzazione per determinare il contenuto cromosomico, tipizzazione STR per stabilire l'identità con le cellule genitrici, verificare la perdita di geni esogeni, e saggi in vivo più rigorosi come la formazione di teratomi e la complementazione tetraploide. Qui descriviamo i protocolli di caratterizzazione del cariotipo, la colorazione della fosfatasi alcalina delle cellule vive, il rilevamento di biomarcatori correlati alla pluripotenza mediante immunofluorescenza, saggi di differenziazione in vitro e metodo per dimostrare la perdita di geni esogeni19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.15% trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>27250018</td>
			<td>G Banding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;, 6 diamidino-2-phenylindole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3003</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14353</td>
			<td>AP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMAXA Nucleofector II</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>-</td>
			<td>Nucleofection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmnioMAX II complete media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>11269016</td>
			<td>Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC021</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11059</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td>Contamination control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-Cadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nanog</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560109</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OCT3/4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>611202</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX17</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561590</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561469</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SSEA4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560073</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA 1-81</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4381</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Pluripotency medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Morphogenetic Factor 4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3016</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Human Type IV</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354245</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase blend</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8051</td>
			<td>Digestion of foetal chorionic villi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest EcoR1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0274</td>
			<td>Restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2518</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>S011</td>
			<td>G Banding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS001</td>
			<td>Fixative for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution human</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1884</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KR0368</td>
			<td>OriP, EBNA1 PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaryoMAX Colcemid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15210040</td>
			<td>Mitotic arrest for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10829018</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>M1151F</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB113</td>
			<td>Fixative for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin ventricular heavy chain &#945;/&#946;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1552</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHDF Nucleofector Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VAPD-1001</td>
			<td>Nucleofection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Fixing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27077</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hSK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27078</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hUL</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27080</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>&#160; Thermo Fisher Scientific,</td>
			<td>&#160;15070063</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving 
			Storage: Room temperature. 
			PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. 
			Storage: Room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid purification Kit- Midi prep</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12143</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride Solution</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB043</td>
			<td>Hypotonic solution for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Genomic DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Hepatocyte differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM255</td>
			<td>Hypotonic solution for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB031</td>
			<td>Permeabilisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Subculture of &#160;foetal chorionic villi fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB067</td>
			<td>Preparation of PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946; III tubulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of induced pluripotent stem cells from turner syndrome (45xo) fetal cells for downstream modelling of neurological deficits associated with the syndrome

Le aneuploidie cromosomiche causano gravi malformazioni congenite tra cui malformazioni del sistema nervoso centrale e morte fetale. Lo screening genetico prenatale è puramente diagnostico e non chiarisce il meccanismo della malattia. Sebbene le cellule dei feti aneuploidi siano preziose materie biologiche che portano l'aneuploidia cromosomica, queste cellule sono di breve durata, limitandone l'uso per esperimenti di ricerca a valle. La generazione di modelli di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) è un metodo efficace di preparazione cellulare per la conservazione perpetua dei tratti aneuploidi. Si auto-rinnovano e si differenziano in cellule specializzate che ricordano lo sviluppo embrionale. Pertanto, le iPSC servono come strumenti eccellenti per studiare i primi eventi di sviluppo. La sindrome di Turner (TS) è una condizione rara associata a un cromosoma X completamente o parzialmente mancante. La sindrome è caratterizzata da infertilità, bassa statura, disturbi endocrini, metabolici, autoimmuni e cardiovascolari e difetti neurocognitivi. Il seguente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di fibroblasti dal tessuto fetale TS (45XO), la generazione di TSiPSC libere da integrazione attraverso la somministrazione di plasmidi di riprogrammazione episomiale mediante nucleofezione seguita da caratterizzazione. Le TSiPSC di riprogrammazione sono state inizialmente sottoposte a screening mediante colorazione di fosfatasi alcalina a cellule vive, seguita da un'ampia indagine per i biomarcatori di pluripotenza. Colonie selezionate sono state sezionate meccanicamente, sono state attraversate più volte e cellule stabili auto-rinnovanti sono state utilizzate per ulteriori esperimenti. Le cellule hanno espresso fattori di trascrizione a pluripotenza OCT4, NANOG, SOX2, marcatori di superficie cellulare SSEA 4 e TRA1-81 tipici delle cellule staminali pluripotenti. Il cariotipo 45XO originale è stato mantenuto dopo la riprogrammazione. Le TSiPSC sono state in grado di formare corpi embrioidi e differenziarsi in cellule di endoderma, mesoderma ed ectoderma esprimendo biomarcatori specifici del lignaggio ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). I plasmidi episomiali esogeni sono stati persi spontaneamente e non rilevati dopo il passaggio 15 nelle cellule. Queste TSiPSC sono una preziosa risorsa cellulare per modellare il neurosviluppo molecolare e cellulare difettoso che causa deficit neurocognitivi associati alla sindrome di Turner.

Generazione di iPSC senza integrazione da un feto abortito spontaneamente con cariotipo 45XO Abbiamo isolato fibroblasti da FCV con un cariotipo 45XO specifico per la sindrome di Turner (TS) e li abbiamo nucleoatizzati con plasmidi di riprogrammazione episomiale per generare TSiPSC che possono essere utilizzate per la modellazione a valle della sindrome, in particolare i deficit neurologici associati (Figura 1a&b). Abbiamo usato vettori episomiali non ing...

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Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome 45XO Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Questo protocollo descrive la generazione di iPSC libere da integrazione da fibroblasti del tessuto fetale attraverso la somministrazione di plasmidi episomiali mediante nucleofezione seguita dalla descrizione dei metodi utilizzati per la caratterizzazione iPSC e la differenziazione neuronale.

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule fetali della sindrome di Turner (45XO) per la modellazione a valle dei deficit neurologici associati alla sindrome

Chromosomal aneuploidies cause severe congenital malformations including central nervous system malformations and fetal death. Prenatal genetic screening ...

La sindrome di Turner è una condizione rara associata a un cromosoma X completamente o parzialmente mancante. La sindrome è caratterizzata da infertilità, bassa statura, disturbi cardiovascolari e difetti neurocognitivi. In alcuni casi, provoca la morte fetale.Sebbene le cellule somatiche dei feti aneuploidi siano biologicamente preziose, sono di breve durata, limitando così il loro uso nella ricerca. La generazione di iPSC è quindi un metodo efficace di preparazione cellulare per la conservazione perpetua dei tratti aneuploidi. Sono auto-rinnovanti e possono differenziarsi in tipi di cellule specializzate che ricordano lo sviluppo embrionale precoce.La somministrazione di plasmidi di riprogrammazione episomiale non integrante attraverso la finzione nucleare è un metodo efficiente e riproducibile per generare iPSC completamente riprogrammati e stabili. Questo metodo può essere utilizzato anche su celle difficili da programmare. In questo protocollo descriviamo la rigenerazione di iPSC da materiale fetale con aneupliod.Trasferire i villi corionici fetali raccolti in una capsula di Petri sterile. Lavarlo più volte con PBS contenente 1X soluzione antibiotica antimicotica. Rimuovere completamente il PBS mediante pipettaggio.Aggiungere 1 ml di miscela di collagenasi ai villi e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti o fino a quando il tessuto si disintegra. Dopo l'incubazione, neutralizzare la collagenasi aggiungendo mezzi contenenti il 10% di siero bovino fetale. Trasferire il contenuto della capsula di Petri in un tubo da 15 ml.Centrifugare il digest per raccogliere i villi disintegrati e le cellule rilasciate. Decantare attentamente il surnatante. Villi disintegrati a piastra insieme a cellule rilasciate in un pallone di coltura T25 e mezzi AmnioMAX e crescono fino a ottenere una coltura di fibroblasti confluenti.Espandere i fibroblasti e la coltura per preparare le scorte per l'uso in successivi esperimenti di trasfezione e caratterizzazione. Preparare colture di alcali contenenti i plasmidi riprogrammanti. Isolare i plasmidi utilizzando il kit di purificazione del plasmide Midi, secondo le istruzioni del produttore.Sospendere di ricaspendere ogni pallet in un volume adeguato di acqua libera da DNAse RNAse per ottenere una concentrazione finale di 1 microgrammo per millilitro. Verificare i plasmidi utilizzando il kit di digestione di restrizione ECoR1, seguendo le istruzioni del produttore. Tripsinizzare i fibroblasti dei villi corionici.Neutralizzare e centrifugare per raccogliere le cellule. Decantare il surnatante e sospendere di sospendere le cellule in 5 ml di OPTI-MEM. Contare le cellule usando un emocitometro e rimuovere 1 milione di cellule per la nucleofezione.Centrifuga per ottenere pallet di celle. Eseguire la nucleofezione utilizzando Amaxa NHDF Neucleofactor Kit. Preparare il reagente neucleofactor miscelando 0,5 mL di supplemento e 2,25 mL di soluzione nucleofattoriali fornita nel kit.Rimuovere 100 microlitri di soluzione nucleofattori e aggiungere 1 microgrammo di ciascun plasmide ad esso. Sospendere delicatamente 1 milione di cellule in questo mix. Trasferire la sospensione di DNA cellulare in cuvetta, assicurando che il campione copra il fondo della cuvetta senza bolle d'aria.Tappare la cuvetta e inserirla nel supporto. Selezionare il programma nucleofattori D-23 per un'elevata efficienza e applicare. Rimuovere la cuvetta dal supporto e aggiungere 1 mL di supporto AmnioMAX.Trasferire delicatamente il contenuto in una capsula di Petri trattata con coltura tissutale, utilizzando la pipetta fornita nel kit. Incubare le cellule in un incubatore di anidride carbonica umidificato a 37 gradi Celsius. Mantenere le cellule in amnioMAX media per 10 giorni, quindi passare al mezzo di pluripotenza per 20 giorni.Per l'espansione iPSC, sezionare manualmente le colonie embrionali simili a cellule staminali formate nel piatto di riprogrammazione utilizzando una pipetta di vetro tirata. Propagare le iPSC in modo appropriato e massaggiare ogni cinque-sette giorni. Gli iPCS sono risultati positivi per la fosfatasi alcalina marcatore di pluripotenza.Generare corpi embrioidi tagliando le colonie di iPSC in piccoli pezzi e placcandole in piastre di Petri a basso attaccamento in mezzo corporeo embrioide. La differenziazione dell'ectoderma è indotta dalla placcatura di corpi embrioidi del quarto giorno nel mezzo di differenziazione dell'ectoderma. Allo stesso modo, la differenziazione del mesoderma è indotta dalla placcatura di corpi embrionali dell'ottavo giorno nel mezzo di differenziazione del mesoderma.Per indurre la differenziazione dell'endoderma, coltura iPSC in un monostrato nel mezzo di differenziazione dell'endoderma. I cambiamenti morfologici nei fibroblasti sono stati monitorati nel corso della riprogrammazione. Esprimono una morfologia simile a una cellula epiteliale e formano colonie compatte.Le cellule avevano anche un rapporto nucleo-citoplasmatico di altezza, tipico delle cellule pluripotenti in coltura. Le iPSC possedevano un tipo di portante 45 XO ed erano positive per i marcatori di pluripotenza OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 ed E-CADHERIN. Le cellule sono state colorate per marcatori rappresentativi dello strato germinale.La sindrome di Turner sviluppa quindi deficit neurocognitivi. I neuroni derivati dalla sindrome di Turner iPSC possono essere un modello eccellente. Questo è modellato in una piastra di Petri per comprendere la nuova linea della normale sindrome dissociativa di Turner.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da congelata Buffy cappotti con non-integrazione episomiale Plasmidi

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte-Uso sinoviociti fibroblasti-come isolato da Giunti dell&#39;artrite reumatoide pazienti

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da melanoma umano Linfociti infiltranti il ​​tumore

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Pluripotenti indotte generazione di cellule staminali da cellule del sangue Utilizzando Sendai Virus e centrifugazione

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generazione di integrazione-liberi cellule staminali pluripotenti indotte dalle cellule mononucleari di sangue periferico umano Utilizzando episomiale Vettori

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definito e Generazione scalabile di cellule epatociti-come da cellule staminali umane pluripotenti

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Formazione di pellet condensato da cellule staminali pluripotenti indotte dal sangue

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione di standardizzato e riproducibile del Forebrain-tipo Organoids cerebrale da umani cellule staminali pluripotenti indotte

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Cellule staminali pluripotenti indotte generazione umana primordiale delle cellule di germe-come delle cellule sulla superficie dei corpi Embryoid da pluripotenza innescato

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...