Name: generation of induced pluripotent stem cells from turner syndrome (45xo) fetal cells for downstream modelling of neurological deficits associated with the syndrome
Uploaded: 2021-12-04T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome 45XO Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndr

上記の研究のための財政支援は、高等教育のマニパルアカデミーによって提供されました.ラインの特徴付けは、NCBSのM.Mパニッカーの研究室で部分的に行われました。アナンド診断研究所のカリョタイピングに関する支援に感謝します。

FCVは、マニパル病院の倫理委員会の承認の下、バンガロールのマニパル病院から入手されました。
注: すべてのバッファーとソリューションの構成については、 表 1 を参照してください。
1. 胎児絨毛(FCV)からの線維芽細胞の分離
<ol><li>
コラゲナーゼにおけるサンプル採取と組織崩壊
	<ol>
<li>リン酸緩衝生理食?...

<ol>
	<li>Verlinsky, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell+lines+with+genetic+disorders.">Human embryonic stem cell lines with genetic disorders.</a> Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).</li><li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Study+of+Fragile+X+Syndrome+Using+Human+Embryonic+Stem+Cells+Derived+from+Preimplantation+Genetically+Diagnosed+Embryos.">Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos.</a> Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).</li><li>Biancotti, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Embryonic+Stem+Cells+as+Models+for+Aneuploid+Chromosomal+Syndromes.">Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes.</a> STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+abnormal+early+development+with+induced+pluripotent+stem+cells+from+aneuploid+syndromes.">Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes.</a> Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).</li><li>Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turner+syndrome:+mechanisms+and+management.">Turner syndrome: mechanisms and management.</a> Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniparental+disomy+of+the+entire+X+chromosome+in+Turner+syndrome+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Discovery. 1, 15022 (2015).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+from+an+adult+male+with+45,X/46,XY+mosaicism.">Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism.</a> Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).</li><li>Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+from+chorionic+villi+of+a+Turner+syndrome+spontaneous+abortion.">Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion.</a> Stem Cell Research. 19, (2017).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+Disease+Patient-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Viral+Reprogramming+Factors.">Parkinson's Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors.</a> Cell. 136, 964-977 (2009).</li><li>Somers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgene-Free+Lung+Disease-Specific+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+a+Single+Excisable+Lentiviral+Stem+Cell+Cassette.">Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette.</a> STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).</li><li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li><li>Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+Without+Viral+Integration.">Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration.</a> Science. 322, 945-949 (2008).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).</li><li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Reprogramming+to+Pluripotency+and+Directed+Differentiation+of+Human+Cells+with+Synthetic+Modified+mRNA.">Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins.">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Vector+and+Transgene+Sequences.">Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li><li>Mart&#237;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pluripotent+stem+cells.">Characterization of pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).</li><li>Ambartsumyan, G., Clark, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+and+early+human+embryo+development.">Aneuploidy and early human embryo development.</a> Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).</li></ol>

細胞遺伝学的に異常な胎児組織の安定した細胞モデルの生成は、欠陥表現型を永続させるために必要である。iPSC経路は、欠陥物20の永久保存のための細胞調製の最も効果的な方法である。
多能性幹細胞(PSC)は、初期の切断胚21を連想させる特殊な細胞への自己複製および分化の特性を示す。したがって、PSCは、早期に中絶された胎児の?...

無数化は、出生時欠損/先天性奇形およびヒトにおける妊娠喪失を引き起こす。妊娠喪失から50%~70%の検体が細胞遺伝学的異常を示す。妊娠初期に失われた無数胚は、ヒト胚発生を密接に表す他のモデルを開発する必要性を高める実験分析では容易には得られない。遺伝性疾患と診断された細胞由来の誘導多能性幹細胞(iPSC)は、胎児の発達における代表的な遺伝的不規則性とその結果をモデル化するために用いられてきた。これらのiPSCは、現像性胚のエピブラスト細胞に似ており、胚形成の初期の事象を再現することができる。これらは、初期の哺乳類胚における細胞系統およびパターニングの発達プログラムの理解と特徴付けを可能にする。iPSCは、単一体性X(ターナー症候群)、トリソミー8(ワルカニー症候群2)、トリソミー13(パタウ症候群)および部分トリソミー11のような無数数分解症候群の出生前診断試験から以前に由来する皮膚線維芽細胞およびアミオサイトから誘導された。22(エマニュエル症候群)は、失敗した開発4に関する貴重な洞察を提供しています。
ターナー症候群(TS)は、女性の不妊、低身長、内分泌および代謝障害、自己免疫疾患のリスクの増加、および心血管疾患に対する素因を特徴とする稀な状態である5。それは唯一の生存可能な単一体症候群であるが、それはまた、自発的な中絶を引き起こす発達中の胚に致命的である6.TSを有する生存者は、細胞内のX染色体物質の変化の程度を有する。核型は、1つのX染色体(45,XO)の完全な損失から45、XO / 46、XXのようなモザイクまで及ぶ。45、XO/47、XXX、環染色体の存在、Y染色体物質の存在、5.
この症候群の診断は、一般的に、症状のある個人の核型血液と、初期の異性数体症候群を検出するための絨毛絨毛サンプリング(CVS)によって行われる。無数性症候群は、自然流産の30%を占めるので、自然流産時に受胎(POC)の産物を核型化することは日常的である。これらの胎児細胞は、細胞遺伝学的異常を有する絨毛性絨毛およびそれらに由来するiPSCを含む、無数性症候群4,6を研究するための有用な生物材料源を提供する。TS iPSCは、レトロウイルスリプログラミング4を介してアニオサイトから以前に確立されており、レトロウイルスリプログラミング6を介して絨毛性絨毛絨毛菌の線維芽細胞(出生前診断を通じて得られる)、センダイウイルスリプログラミングを介した血液単核細胞7から、およびレンチウイルスリプログラミングを介したTS個体の皮膚線維芽細胞から4.私たちの研究室の主な焦点は発達障害を理解することなので、私たちはPOCからTS iPSC、特に自発的中絶の絨毛絨毛性絨毛成分を生成しました 8.この胎児組織から単離された細胞は全て45XOの核型を有し、同じ核型のiPSCを生み出した。これらのiPSCは、中絶された胎児から最初に生成され、妊娠障害に関連する妊娠障害を研究するための貴重なリソースを提供するので、ユニークです。この記事では、エピソームリプログラミングを通じて、このユニークな細胞源からのiPSCの生成の詳細な方法論を提供します。
iPSC生成の初期の方法では、ウイルス伝達とトランスポゾンを使用してリプログラミング因子を提供しました。細胞を多能性に誘導する方法は、レトロウイルスベクター9、切除可能なレンチウイルスベクター10、11およびトランスポゾンベースの方法12を用い、非統合型アデノウイルスベクター13およびセンダイウイルスベースベクター14に進化した。レトロウイルスおよびレンチウイルスベースのリプログラミングは、効率的ではあるが、宿主染色体へのリプログラミング因子の統合を伴い、iPSCに予期せぬ影響を及ぼす挿入突然変異を引き起こす。さらに、ウイルスベースのリプログラミングは、iPSCの翻訳適用を防ぎます。RNA系システム15および直接タンパク質送達16は、ウイルスおよびDNAトランスフェクションの使用に関連する潜在的なリスクを完全に排除するために検討されている。しかし、これらの方法は非効率的であることが証明されています。
2011年、沖田らは、shRNAを介したTP53抑制によって増強されたエピソームプラスミドによるリプログラミングの効率向上を報告した。彼らはまた、cMYCを非変形型LMYC(小細胞肺癌関連MYC)に置き換え、hipscの安全性を高めました。これらのエピソームプラスミドは、5つのリプログラミング因子を発現する:OCT4、LIN28、SOX2、KLF4、LMYCおよびSHRNA用TP5317,18。これらのベクターは、余分な染色体的に維持され、連続培養時に再プログラムされた細胞から失われ、10〜15の通過以内にラインをトランスジーンフリーにします。核細胞は、宿主細胞の核に直接核酸を送達するエレクトロポレーションの特殊な形態です。これは、様々な細胞タイプにリプログラミングプラスミドを送達するための効率的な方法です。上皮プラスミドは費用効果が高く、核の高い費用を補います。この方法は、様々な体細胞から安定したiPSCを生み出す最適化された条件下で効率的かつ再現可能です。本プロトコルでは、エピソームリプログラミングプラスミドの核形成によって胎児組織から単離された線維芽細胞からのiPSCの生成方法について述べている。ここでは、胎児絨毛絨毛絨毛、プラスミド精製、核整離、リプログラミングプレートからのコロニーの摘出、安定したiPSCの確立からの線維芽細胞の分離のための詳細なプロトコルを示します。
新たに生成されたiPSCにおける多能性特性の存在を確認することが不可欠である。これには、多能性関連因子のデモンストレーションが含まれます(例えば、 アルカリホスファターゼ発現、ナノグ、SSEA4、Tra 1-80、Tra 1-81、E-カドヘリン;通常、免疫蛍光または遺伝子発現アッセイで示される)、インビトロ分化アッセイによる3つの胚芽層の同定、染色体含有量を決定するための核型入力、染色体含有量を決定するためのカルギタイピング、同定を確立するためのSTRタイピング そして、テラトーマ形成および四数相補解のようなインビボアッセイでより厳しい。ここでは、核型の特徴付けプロトコル、生細胞アルカリホスファターゼ染色、免疫蛍光による多能性関連バイオマーカーの検出、外因性遺伝子19の喪失を実証する体外分化アッセイおよび方法について説明する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.15% trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>27250018</td>
			<td>G Banding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;, 6 diamidino-2-phenylindole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3003</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14353</td>
			<td>AP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMAXA Nucleofector II</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>-</td>
			<td>Nucleofection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmnioMAX II complete media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>11269016</td>
			<td>Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC021</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11059</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td>Contamination control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-Cadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nanog</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560109</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OCT3/4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>611202</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX17</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561590</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561469</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SSEA4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560073</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA 1-81</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4381</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Pluripotency medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Morphogenetic Factor 4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3016</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Human Type IV</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354245</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase blend</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8051</td>
			<td>Digestion of foetal chorionic villi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest EcoR1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0274</td>
			<td>Restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2518</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>S011</td>
			<td>G Banding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS001</td>
			<td>Fixative for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution human</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1884</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KR0368</td>
			<td>OriP, EBNA1 PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaryoMAX Colcemid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15210040</td>
			<td>Mitotic arrest for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10829018</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>M1151F</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB113</td>
			<td>Fixative for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin ventricular heavy chain &#945;/&#946;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1552</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHDF Nucleofector Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VAPD-1001</td>
			<td>Nucleofection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Fixing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27077</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hSK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27078</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hUL</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27080</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>&#160; Thermo Fisher Scientific,</td>
			<td>&#160;15070063</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving 
			Storage: Room temperature. 
			PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. 
			Storage: Room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid purification Kit- Midi prep</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12143</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride Solution</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB043</td>
			<td>Hypotonic solution for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Genomic DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Hepatocyte differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM255</td>
			<td>Hypotonic solution for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB031</td>
			<td>Permeabilisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Subculture of &#160;foetal chorionic villi fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB067</td>
			<td>Preparation of PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946; III tubulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of induced pluripotent stem cells from turner syndrome (45xo) fetal cells for downstream modelling of neurological deficits associated with the syndrome

染色体の無数化は、中枢神経系奇形や胎児死を含む重度の先天性奇形を引き起こす。出生前の遺伝子スクリーニングは純粋に診断であり、疾患メカニズムを解明するものではありません。無数性胎児の細胞は染色体異数化を有する貴重な生物学的物質であるが、これらの細胞は短命であり、下流の研究実験への使用を制限している。誘導多能性幹細胞(iPSC)モデルの生成は、無数形質の永久保存のための細胞調製の有効な方法である。彼らは自己更新し、胚発生を連想させる特殊な細胞に分化しています。したがって、iPSCは初期の発生事象を研究するための優れたツールとして機能します。ターナー症候群(TS)は、完全にまたは部分的に欠けているX染色体に関連する稀な状態である。この症候群は、不妊症、低身長、内分泌、代謝、自己免疫障害および心血管障害および神経認知障害を特徴とする。以下のプロトコルは、TS(45XO)胎児組織からの線維芽細胞の単離および培養、核整形によるエピソームリプログラミングプラスミドの送達を介した統合自由TSiPSCの生成、その後の特徴付けについて説明する。TSiPSCのリプログラミングは、最初は生細胞アルカリホスファターゼ染色によってスクリーニングされ、続いて多能性バイオマーカーの広範な調査が行われました。選択したコロニーを機械的に解剖し、数回通過し、安定した自己更新細胞を更なる実験に使用した。細胞は、多能性転写因子OCT4、NANOG、SOX2、細胞表面マーカーSSEA 4およびTRA1-81の多能性幹細胞の典型的な転写因子を発現した。元の45XOの核型はポストリプログラミングを保持していた。TSiPSCは胚体を形成し、系統特異的バイオマーカー((SRY BOX17)(ミオシンヴェントリーキュラーヘビーチャイエンα/β)(βIII TUBULIN)を発現する内胚体、中胚および外胚の細胞に分化することができた。外因性エピソームプラスミドは、細胞内で15を通過した後、自発的に失われ、検出されなかった。これらのTSiPSCは、ターナー症候群に関連する神経認知障害を引き起こす欠陥のある分子および細胞性神経発達をモデル化するための貴重な細胞資源である。

45XO核型を用いた自発的に中止された胎児からの統合自由なiPSCの生成 我々は、ターナー症候群(TS)特異的な45XO核型を有するFCVから線維芽細胞を単離し、エピソームリプログラミングプラスミドでこれらを核感染させ、症候群の下流モデリングに使用できるTSiPSC、特に関連する神経学的欠損を生成した(図1a&b)。トランスフェクション実験に非イ?...

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Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome 45XO Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

このプロトコルは、核軟部によるエピソームプラスミドの送達を通じた胎児組織線維芽細胞からの統合自由なiPSCの生成と、iPSC特性評価および神経分化に用いられる方法の記述を記述する。

ターナー症候群(45XO)の胎児細胞による、その症候群に伴う神経障害の下流モデリングのための人工多能性幹細胞の生成

Chromosomal aneuploidies cause severe congenital malformations including central nervous system malformations and fetal death. Prenatal genetic screening ...

ターナー症候群は、完全にまたは部分的に欠けているX染色体に関連する稀な状態である。この症候群は、不妊症、低身長、心血管障害、および神経認知障害を特徴とする。場合によっては、胎児の死を引き起こす。無数胎児の体細胞は生物学的に価値があるが、それらは短命であり、研究における使用を制限する。iPSCの生成は、したがって、無数形質の永久保存のための細胞調製の有効な方法である。彼らは自己更新であり、初期の胚発生を連想させる特殊な細胞型に分化することができる。核小説を通じた非統合エピソームリプログラミングプラスミドの提供は、完全に再プログラムされた安定したiPSCを生成するための効率的で再現可能な方法です。この方法は、プログラミングが困難なセルにも使用できます。このプロトコルでは、胎児物質からのiPSCのアネプリオドによる再生について説明する。収集した胎児絨毛絨毛を滅菌ペトリ皿に移します。1X抗生物質抗ミキサン溶液を含むPBSで数回洗浄してください。ピペット処理でPBSを完全に取り除く。ビリにコラゲターゼブレンド1mlを加え、摂氏37度で10分間、または組織が崩壊するまでインキュベートします。インキュベーション後、10%の牛血清を含む培地を添加してコラゲターゼを中和する。ペトリ皿の内容物を15mlのチューブに移します。崩壊した絨毛と放出細胞を収集するために消化を遠心分離する。上清を慎重にデカントします。プレートは、T25培養フラスコおよびAmnioMAX培地中で放出された細胞と共に絨毛を崩壊させ、コンフルエント線維芽細胞培養が得られるまで増殖する。繊維芽細胞と培養を展開し、その後のトランスフェクションおよび特性評価実験で使用するための在庫を準備します。リプログラミングプラスミドを含むアルカリの培養物を準備する。メーカーの指示に従って、ミディプラスミド精製キットを使用してプラスミドを分離します。各パレットを適切な量のDNAse RNAseフリー水で再中断し、1ミリリットル当たり1マイクログラムの最終濃度を得る。メーカーの指示に従って、ECoR1制限消化キットを使用してプラスミドを確認します。絨毛性絨毛線維芽細胞をトリプシン化する。中和し、遠心分離機を使用して細胞を採取する。上清をデカントし、細胞を5mlOPTI-MEMで再懸濁する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、核の100万個の細胞を除去します。遠心分離機は、セルパレットを取得します。アマキシNHDFニュークレオフアクターキットを使用して核切除を行います。キットに用意されている0.5 mLサプリメントと2.25 mL核級の核を混合して、中性硬化剤試薬を調製します。100マイクロリットルの核を除去し、各プラスミドを1マイクログラムずつ加えます。このミックスで100万個の細胞を穏やかに再懸濁する。細胞DNA懸濁液をキュベットに移し、サンプルが気泡を使わずにキュベットの底部を覆っていることを確認します。キュベットをキャップし、ホルダーに挿入します。高効率のために核のアクタープログラムD-23を選択し、適用します。ホルダーからキュベットを取り出し、1 mLのAmnioMAXメディアを追加します。キットに用意されているピペットを使用して、ペトリ皿を処理した組織培養物に内容物をそっと移します。加湿した二酸化炭素インキュベーターで細胞を摂氏37度でインキュベートします。AmnioMAX培地中の細胞を10日間維持し、20日間多能性培地に移行する。iPSC拡張の場合、プルドガラスピペットを使用して、リプログラミング皿で形成された胚性幹細胞様コロニーを手動で解剖する。iPSCを適切に伝播し、5~7日ごとにマッサージを行います。iPCSは、多能性マーカーアルカリホスファターゼに陽性であった。iPSCコロニーを小片に切断し、胚性体培地中の低い付着ペトリ皿でめっきすることによって胚体を生成する。外胚分化は、外胚分化培地中の4日目の胚体をめっきすることによって誘導される。同様に、中胚分化は、メソダーム分化培地において8日目の胚体をめっきすることによって誘導される。内胚葉分化を誘導するために、培養iPSCを単層中の内胚分化培地中に含む。線維芽細胞の形態学的変化を、再プログラミングの過程でモニタリングした。それらは上皮細胞様形態を発現し、コンパクトなコロニーを形成した。また、細胞は細胞質比に対する高さの核を有し、培養において多能性細胞の典型的なものである。iPSCは45のXOキャリア型を有し、多能性マーカーOCT4、NANOG、SOX 2、SSEA 4、TRA-1-81およびE-CADHERINに陽性であった。細胞を代表的な胚芽層マーカーに染色した。ターナー症候群は、このように神経認知の欠陥を開発します.ターナー症候群iPSCに由来するニューロンは、優れたモデルであることができます。これは、正常な解離性ターナー症候群の新しいラインを理解するためにシャートリプレートでモデル化されています。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

発生生物学

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

関節リウマチ患者の関節から分離された線維芽細胞様滑膜細胞を用いて誘導多能性幹細胞の生成

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

センダイウイルスや遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞の生成

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞から肝細胞様細胞の定義され、スケーラブルな世代

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

標準化され、再現性のある前脳型人間から脳オルガノイドの生成誘導多能性幹細胞

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

プライミング多能性胚様体の表面で人間の始原生殖細胞のような細胞の生成誘導多能性幹細胞

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...