Name: generation of induced pluripotent stem cells from turner syndrome (45xo) fetal cells for downstream modelling of neurological deficits associated with the syndrome
Uploaded: 2021-12-04T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome 45XO Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndr

Økonomisk støtte til ovennevnte forskning ble gitt av Manipal Academy of Higher Education. Karakterisering av linjen ble utført delvis i laboratoriet til M.M. Panicker ved NCBS. Vi takker Anand Diagnostisk Laboratorium for hjelp med karyotyping.

FCV ble hentet fra Manipal Hospital, Bengaluru, under Etikkkomiteen for Manipal Hospitals godkjenning.
MERK: Se tabell 1 for sammensetning av alle buffere og løsninger.
1. Isolering av fibroblaster fra føtal chorionic villi (FCV)
<ol><li>
Prøveinnsamling og vevsoppløsing i kollagenalisse
	<ol>
<li>Samle FCV under sterile forhold i fosfatbufret saltvann (PBS) og transport (ved romtemperatur) til cellekulturanle...

<ol>
	<li>Verlinsky, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell+lines+with+genetic+disorders.">Human embryonic stem cell lines with genetic disorders.</a> Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).</li><li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Study+of+Fragile+X+Syndrome+Using+Human+Embryonic+Stem+Cells+Derived+from+Preimplantation+Genetically+Diagnosed+Embryos.">Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos.</a> Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).</li><li>Biancotti, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Embryonic+Stem+Cells+as+Models+for+Aneuploid+Chromosomal+Syndromes.">Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes.</a> STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+abnormal+early+development+with+induced+pluripotent+stem+cells+from+aneuploid+syndromes.">Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes.</a> Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).</li><li>Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turner+syndrome:+mechanisms+and+management.">Turner syndrome: mechanisms and management.</a> Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniparental+disomy+of+the+entire+X+chromosome+in+Turner+syndrome+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Discovery. 1, 15022 (2015).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+from+an+adult+male+with+45,X/46,XY+mosaicism.">Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism.</a> Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).</li><li>Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+from+chorionic+villi+of+a+Turner+syndrome+spontaneous+abortion.">Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion.</a> Stem Cell Research. 19, (2017).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+Disease+Patient-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Viral+Reprogramming+Factors.">Parkinson's Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors.</a> Cell. 136, 964-977 (2009).</li><li>Somers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgene-Free+Lung+Disease-Specific+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+a+Single+Excisable+Lentiviral+Stem+Cell+Cassette.">Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette.</a> STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).</li><li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li><li>Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+Without+Viral+Integration.">Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration.</a> Science. 322, 945-949 (2008).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).</li><li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Reprogramming+to+Pluripotency+and+Directed+Differentiation+of+Human+Cells+with+Synthetic+Modified+mRNA.">Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins.">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Vector+and+Transgene+Sequences.">Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li><li>Mart&#237;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pluripotent+stem+cells.">Characterization of pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).</li><li>Ambartsumyan, G., Clark, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+and+early+human+embryo+development.">Aneuploidy and early human embryo development.</a> Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).</li></ol>

Generering av stabile cellulære modeller av cytogenetisk unormalt fostervev er nødvendig for å opprettholde defekt fenotype. IPSC-ruten er den mest effektive metoden for celleforberedelse for evig bevaring av defekte egenskaper20.
Pluripotente stamceller (PSC) viser egenskaper til selvfornyelse og differensiering i spesialiserte celler som minner om tidlige spaltingsembryoer21. Derfor kan PSCer tjene som gode modeller for å studere tidlige mo...

Aneuploidies fører til fødselsskader/medfødte misdannelser og graviditetstap hos mennesker. ~50%-70% av prøver fra graviditet tap viser cytogenetiske abnormiteter. Aneuploid embryoer tapt tidlig i svangerskapet kan ikke lett oppnås for eksperimentell analyse øke behovet for å utvikle andre modeller som nært representerer menneskelig embryogenese. Induserte pluripotente stamceller (iPSCer) avledet fra celler diagnostisert med genetiske lidelser har blitt brukt til å modellere de representative genetiske uregelmessighetene og deres konsekvens på fosterutvikling1,2,3,4. Disse iPSCene ligner epiblastomer i det utviklende embryoet og kan rekapitulere de tidlige hendelsene i embryodannelse. De tillater forståelse og karakterisering av utviklingsprogrammet for celleavstamninger og mønster i tidlige pattedyrembryoer. iPSCer avledet tidligere fra hudfibroblaster og amniocytter fra prenatale diagnostiske tester av aneuploidy syndromer som monosomi X (Turner syndrom), trisomi 8 (Warkany syndrom 2), trisomi 13 (Patau syndrom) og delvis trisomi 11; 22 (Emanuel syndrom) har gitt verdifull innsikt om mislykket utvikling4.
Turner syndrom (TS) er en sjelden tilstand preget av kvinnelig infertilitet, kort statur, endokrine og metabolske forstyrrelser, økt risiko for autoimmun sykdom og en predisponering for kardiovaskulær sykdom5. Selv om det er det eneste overlevende monosomisyndromet, er det også dødelig for det utviklende embryoet som forårsaker spontane aborter6. Overlevende individer med TS tilstede med grader av endring av X-kromosomalt materiale i sine celler. Karyotyper spenner fra fullstendig tap av ett X-kromosom (45,XO) til mosaikker som 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, tilstedeværelsen av ringkromosomer, tilstedeværelsen av Y-kromosomalt materiale, etc5.
Diagnose av syndromet gjøres vanligvis ved karyotyping blod av symptomatiske individer og chorionic villi sampling (CVS) for å oppdage tidlige aneuploidy syndromer. Siden aneuploidy syndromer står for ~ 30% av spontane aborter, er det rutinemessig å karyotype produktet av unnfangelse (POC) ved en spontan abort. Disse fostercellene, inkludert den chorioniske villi som har cytogenetisk abnormitet og iPSC avledet fra dem, gir en verdifull kilde til biologisk materiale for å studere aneuploidy syndromer4,6. TS iPSCs har tidligere blitt etablert fra amniocytter via retroviral reprogrammering4, fibroblaster av chorionic villi (oppnådd gjennom prenatal diagnose) via retroviral reprogrammering6, fra blod mononukleære celler7 via Sendai virus reprogrammering og fra hudfibroblaster av TS individer via lentiviral reprogrammering4 . Siden hovedfokuset i laboratoriet vårt er å forstå utviklingssvikt, har vi generert TS iPSCer fra POC, spesielt den chorioniske villikomponenten i en spontan abort8. Alle cellene isolert fra dette fostervevet hadde en 45XO karyotype og ga iPSC med samme karyotype. Disse iPSCene er unike da de er de første som genereres fra et abortert foster og gir en verdifull ressurs for å studere aneuploidy relaterte graviditetsfeil. Denne artikkelen gir en detaljert metodikk for generering av iPSCer fra denne unike cellekilden via episomal omprogrammering.
De tidlige metodene for iPSC-generasjonen brukte viral transduksjon og transposoner for å levere omprogrammeringsfaktorene. Metoder for å indusere celler til pluripotency har utviklet seg fra å bruke integrere retrovirale vektorer9, eksiserbare lentivirale vektorer10,11 og transposonbaserte metoder12 til ikke-integrerende adenovirale vektorer13 og Sendai virusbaserte vektorer14. Retroviral og lentiviral basert omprogrammering, selv om det er effektivt, innebærer integrasjon av omprogrammeringsfaktorene i vertskromosomene, noe som forårsaker innsettingsmutasjoner som har uforutsette effekter i iPSCene. Videre forhindrer viral-basert omprogrammering translasjonell anvendelse av iPSCer. RNA-baserte systemer15 og direkte proteinlevering16 er utforsket for å eliminere de potensielle risikoene forbundet med bruk av virus og DNA-transfeksjoner. Imidlertid har disse metodene vist seg ineffektive.
I 2011 rapporterte Okita et al. forbedret effektivitet av omprogrammering ved episomale plasmider forsterket med TP53-undertrykkelse via shRNA. De erstattet også cMYC med ikke-transformerende LMYC (litencellet lungekarsinom assosiert MYC) for å forbedre sikkerheten til hiPSCene. Disse episomale plasmidene uttrykker 5 omprogrammeringsfaktorer: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC og shRNA for TP5317,18. Disse vektorene opprettholdes ekstra kromosomalt og går tapt fra de omprogrammerte cellene ved kontinuerlig kultur, og gjør dermed linjene transgenefrie innen 10-15 passasjer. Kjerneofeksjon er en spesialisert form for elektroporasjon som leverer nukleinsyrer direkte inn i kjernen av vertsceller. Det er en effektiv metode for levering av omprogrammeringsplasmider til ulike celletyper. Episomale plasmider er kostnadseffektive og kompenserer de høye kostnadene ved kjerneofeksjon. Denne metoden er effektiv og reproduserbar under optimaliserte forhold som gir stabile iPSCer fra en rekke somatiske celler. I denne protokollen beskriver vi metoden for generering av iPSCer fra fibroblaster isolert fra fostervev ved kjerneofeksjon av episomale reprogrammeringsplasmider. Her er de detaljerte protokollene for fibroblastisolasjon fra føtal chorionic villi, plasmid rensing, kjerneofeksjon, plukking av kolonier fra omprogrammeringsplaten og etablering av stabile iPSCer.
Det er viktig å bekrefte tilstedeværelsen av pluripotensegenskaper i de nylig genererte iPSCene. Dette inkluderer demonstrasjon av pluripotensrelaterte faktorer (f.eks. alkalisk fosfataseuttrykk, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-kadherin; vanligvis vist med immunfluorescens eller genuttrykksanalyser), identifisering av de tre bakterielagene ved in vitro differensieringsanalyser for å validere deres differensieringspotensialer, karyotyping for å bestemme kromosomalt innhold, STR-skriving for å etablere identitet med foreldreceller, verifisere tap av eksogene gener, bekrefte tap av eksogene gener, og strengere in vivo-analyser som teratomadannelse og tetraploidkomplimentering. Her beskriver vi karakteriseringsprotokoller av karyotyping, levende celler alkalisk fosfatasefarging, påvisning av pluripotensrelaterte biomarkører ved immunfluorescens, in vitro differensieringsanalyser og metode for å demonstrere tap av eksogene gener19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.15% trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>27250018</td>
			<td>G Banding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;, 6 diamidino-2-phenylindole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3003</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14353</td>
			<td>AP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMAXA Nucleofector II</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>-</td>
			<td>Nucleofection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmnioMAX II complete media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>11269016</td>
			<td>Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC021</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11059</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td>Contamination control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-Cadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nanog</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560109</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OCT3/4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>611202</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX17</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561590</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561469</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SSEA4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560073</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA 1-81</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4381</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Pluripotency medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Morphogenetic Factor 4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3016</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Human Type IV</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354245</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase blend</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8051</td>
			<td>Digestion of foetal chorionic villi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest EcoR1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0274</td>
			<td>Restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2518</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>S011</td>
			<td>G Banding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS001</td>
			<td>Fixative for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution human</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1884</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KR0368</td>
			<td>OriP, EBNA1 PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaryoMAX Colcemid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15210040</td>
			<td>Mitotic arrest for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10829018</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>M1151F</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB113</td>
			<td>Fixative for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin ventricular heavy chain &#945;/&#946;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1552</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHDF Nucleofector Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VAPD-1001</td>
			<td>Nucleofection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Fixing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27077</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hSK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27078</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hUL</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27080</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>&#160; Thermo Fisher Scientific,</td>
			<td>&#160;15070063</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving 
			Storage: Room temperature. 
			PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. 
			Storage: Room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid purification Kit- Midi prep</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12143</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride Solution</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB043</td>
			<td>Hypotonic solution for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Genomic DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Hepatocyte differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM255</td>
			<td>Hypotonic solution for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB031</td>
			<td>Permeabilisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Subculture of &#160;foetal chorionic villi fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB067</td>
			<td>Preparation of PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946; III tubulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of induced pluripotent stem cells from turner syndrome (45xo) fetal cells for downstream modelling of neurological deficits associated with the syndrome

Kromosomale aneuploidier forårsaker alvorlige medfødte misdannelser, inkludert misdannelser i sentralnervesystemet og fosterdød. Prenatal genetisk screening er rent diagnostisk og belyser ikke sykdomsmekanismen. Selv om celler fra aneuploidfostre er verdifulle biologiske materialer som bærer kromosomal aneuploidy, er disse cellene kortvarige, noe som begrenser bruken av nedstrøms forskningseksperimenter. Generering av induserte pluripotente stamcellemodeller (iPSC) er en effektiv metode for celleforberedelse for evig bevaring av aneuploide egenskaper. De er selvfornyende og skiller seg ut i spesialiserte celler som minner om embryonal utvikling. Dermed fungerer iPSCer som gode verktøy for å studere tidlige utviklingshendelser. Turner syndrom (TS) er en sjelden tilstand forbundet med et helt eller delvis manglende X-kromosom. Syndromet er preget av infertilitet, kort statur, endokrine, metabolske, autoimmune og kardiovaskulære lidelser og nevrokognitive defekter. Følgende protokoll beskriver isolasjon og dyrking av fibroblaster fra TS (45XO) fostervev, generering av integrasjonsfrie TSiPSCer gjennom levering av episomale omprogrammeringsplasmider ved kjerneavsnitt etterfulgt av karakterisering. Omprogrammeringen av TSiPSCs ble først screenet av alkaliske fosfatasefarging i levende celler etterfulgt av omfattende undersøkelser for pluripotensbiomarkører. Utvalgte kolonier ble mekanisk dissekert, passert flere ganger og stabile selvfornyende celler ble brukt til videre eksperimenter. Cellene uttrykte pluripotenstranskripsjonsfaktorer OCT4, NANOG, SOX2, celleoverflatemarkører SSEA 4 og TRA1-81 typisk for pluripotente stamceller. Den opprinnelige 45XO karyotypen ble beholdt etter omprogrammering. TSiPSCene var i stand til å danne embryoide legemer og differensiere i celler av endoderm, mesoderm og ectoderm som uttrykte avstamningsspesifikke biomarkører ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). De eksogene episomale plasmidene gikk tapt spontant og ble ikke oppdaget etter passasje 15 i celler. Disse TSiPSCene er en verdifull cellulær ressurs for modellering av defekt molekylær og cellulær nevroutvikling som forårsaker nevrokognitive underskudd forbundet med Turners syndrom.

Generering av integrasjonsfrie iPSCer fra et spontant abortert foster med 45XO karyotype Vi isolerte fibroblaster fra FCV med et Turner syndrom (TS) spesifikk 45XO karyotype og nukleofekterte dem med episomale reprogrammeringsplasmider for å generere TSiPSCer som kan brukes til nedstrøms modellering av syndromet, spesielt de tilhørende nevrologiske underskuddene (Figur 1a&b). Vi brukte ikke-episomale vektorer og kjerneaveksjon for transfeksjonsforsøke...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome 45XO Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndr

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome 45XO Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Denne protokollen beskriver genereringen av integrasjonsfrie iPSCer fra fostervevsfibroblaster gjennom levering av episomale plasmider ved kjerneofeksjon etterfulgt av beskrivelse av metoder som brukes til iPSC-karakterisering og nevronal differensiering.

Generering av induserte pluripotente stamceller fra Turners syndrom (45XO) Fosterceller for nedstrøms modellering av nevrologiske underskudd forbundet med syndromet

Chromosomal aneuploidies cause severe congenital malformations including central nervous system malformations and fetal death. Prenatal genetic screening ...

Turner syndrom er en sjelden tilstand forbundet med et helt eller delvis manglende X-kromosom. Syndromet er preget av infertilitet, kort statur, kardiovaskulære lidelser og nevrokognitive defekter. I noen tilfeller forårsaker det fosterdød.Selv om somatiske celler av aneuploide fostre er biologisk verdifulle, er de kortvarige, og begrenser dermed bruken i forskning. Generering av iPSC er dermed en effektiv metode for celleforberedelse for evig bevaring av aneuploide egenskaper. De er selvfornyende og kan skille seg ut i spesialiserte celletyper som minner om tidlig embryonal utvikling.Levering av ikke-integrerte episomale omprogrammeringsplasmider gjennom kjernefysisk fiksjon er en effektiv og reproduserbar metode for å generere fullstendig omprogrammerte og stabile iPSC-er. Denne metoden kan også brukes på celler som er vanskelige å programmere. I denne protokollen beskriver vi regenerering av iPSCer fra fostermateriale med aneupliod.Overfør den oppsamlede fosteret chorionic villi til en steril Petri-tallerken. Vask det flere ganger med PBS som inneholder 1X antimykotisk løsning. Fjern PBS helt ved å pipettere.Tilsett 1 ml kollagenalisseblanding til villi og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter eller til vevet går i oppløsning. Etter inkubasjon nøytraliserer du kollagenen ved å legge til medier som inneholder 10% foster Bovine Serum. Overfør innholdet i Petri-parabolen til et 15 ml rør.Sentrifuger fordøyet for å samle de oppløste villi og frigjorte cellene. Dekanter supernatanten forsiktig. Plate oppløst villi sammen med frigjorte celler i en T25 kultur kolbe og AmnioMAX media og vokse til en konfluent fibroblast kultur er oppnådd.Utvid fibroblaster og kultur for å forberede aksjer for bruk i etterfølgende transfeksjons- og karakteriseringseksperimenter. Forbered kulturer av alkali som inneholder omprogrammeringsplasmider. Isoler plasmidene ved hjelp av Midi plasmid rensesett, i henhold til produsentens instruksjoner.Re-suspendere hver pall i egnet volum av DNAse RNAse fritt vann for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 mikrogram per milliliter. Kontroller plasmidene ved hjelp av ECoR1-begrensningsfordøyeringssettet, i henhold til produsentens instruksjoner. Trypsinize chorionic villi fibroblasts.Nøytraliser, og sentrifuge for å samle cellene. Dekanter supernatanten, og suspender cellene på nytt i 5 ml OPTI-MEM. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer, og fjern 1 million celler for kjerneofeksjon.Sentrifuge for å få cellepall. Utfør kjerneaveksjon ved hjelp av Amaxa NHDF Neucleofactor Kit. Forbered neucleofactor reagens ved å blande 0,5 ml tilskudd og 2,25 ml nukleofaktorløsning som følger med i settet.Fjern 100 mikroliter nukleofaktorløsning, og tilsett 1 mikrogram av hver plasmid til den. Re-suspender forsiktig 1 million celler i denne blandingen. Overfør celle-DNA-suspensjonen til cuvette, og sørg for at prøven dekker bunnen av cuvette uten luftbobler.Hette cuvette, og sett den inn i holderen. Velg nukleofaktorprogrammet D-23 for høy effektivitet, og bruk. Fjern cuvette ut av holderen, og tilsett 1 ml AmnioMAX-medier.Overfør innholdet forsiktig til en vevskulturbehandlet Petri-tallerken ved hjelp av pipetten som følger med i settet. Inkuber cellene i en fuktet karbondioksidinkubator ved 37 grader Celsius. Vedlikehold cellene i AmnioMAX-medier i 10 dager, og skift deretter til pluripotensmedium i 20 dager.For iPSC-utvidelse, disseker de embryonale stamcellelignende koloniene som dannes i omprogrammeringsfatet manuelt ved hjelp av en trukket glasspipette. Forplant iPSCene på riktig måte, og masser hver femte til syv dager. IPCS-ene var positive for pluripotensmarkør alkalisk fosfatase.Generer embryoide kropper ved å kutte iPSC-koloniene i små biter og plating dem i lav vedlegg Petri retter i embryoid kroppsmedium. Ectoderm differensiering er indusert av plating dag fire embryoide kropper i ectoderm differensiering medium. På samme måte blir mesoderm differensiering indusert av plating dag åtte embryoide kropper i mesoderm differensieringsmedium.For å indusere endoderm differensiering, kultur iPSCs i en monolayer i endoderm differensiering medium. Morfologiske endringer i fibroblaster ble overvåket i løpet av omprogrammering. De uttrykker epitelcellelignende morfologi og dannet kompakte kolonier.Cellene hadde også en høydekjerne til cytoplasmatisk forhold, typisk for pluripotente celler i kulturen. IPSCene hadde en 45 XO-bærertype og var positive for pluripotensmarkører OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 og E-CADHERIN. Cellene ble farget for representative bakterielagmarkører.Turner Syndrome utvikler dermed nevrokognitive underskudd. Nevroner avledet fra Turner Syndrome iPSC kan være en utmerket modell. Dette er modellert i en petriskål for å forstå den nye linjen med normalt disassosiativt Turner syndrom.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Generering av Induced Pluripotent stamceller fra Frozen Buffy Coats bruker Non-integrere episomal Plasmider

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Generering av indusert-pluripotente stamceller ved hjelp av fibroblast synoviocytter Isolert fra ledd av pasienter med revmatoid artritt

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generering av Induced Pluripotent stamceller fra humane melanom Tumor-infiltrerende lymfocytter

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Induced pluripotent stamcelle Generation fra Blood Cells hjelp Sendai Virus og sentrifugering

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generasjon Integrerings--frie Utførte Pluripotent stamceller fra menneskelige perifere mononukleære blodceller Bruke episomale vektorer

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definert og Scalable Generation of hepatocytter lignende celler fra menneskelige Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Kondrogen pelletsdannelse fra Cord Blood-avledede Induced Pluripotent Stamceller

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon av standardiserte og reproduserbar Forebrain-type Cerebral Organoids fra menneske indusert Pluripotent stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon av menneskelige Primordial bakterie celle-lignende celler på overflaten av Embryoid organer fra primet pluripotency indusert Pluripotent stamceller

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon 3D huden Organoid fra ledningen blod-avledet indusert Pluripotent stamceller

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...