Name: generation of induced pluripotent stem cells from turner syndrome (45xo) fetal cells for downstream modelling of neurological deficits associated with the syndrome
Uploaded: 2021-12-04T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome 45XO Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndr

El apoyo financiero para la investigación anterior fue proporcionado por la Academia de Educación Superior manipal. La caracterización de la línea se realizó parcialmente en el laboratorio de M.M. Panicker en NCBS. Agradecemos a Anand Diagnostic Laboratory por su ayuda con el cariotipo.

Los FCV se obtuvieron del Hospital Manipal, Bangalore, bajo la aprobación del Comité de Ética de los Hospitales Manipal.
NOTA: Consulte la Tabla 1 para la composición de todos los búferes y soluciones.
1. Aislamiento de fibroblastos de vellosidades coriónicas fetales (FCV)
<ol><li>
Recogida de muestras y desintegración tisular en colagenasa
	<ol>
<li>Recolectar FCV en condiciones estériles en solución sal...

<ol>
	<li>Verlinsky, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell+lines+with+genetic+disorders.">Human embryonic stem cell lines with genetic disorders.</a> Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).</li><li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Study+of+Fragile+X+Syndrome+Using+Human+Embryonic+Stem+Cells+Derived+from+Preimplantation+Genetically+Diagnosed+Embryos.">Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos.</a> Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).</li><li>Biancotti, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Embryonic+Stem+Cells+as+Models+for+Aneuploid+Chromosomal+Syndromes.">Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes.</a> STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+abnormal+early+development+with+induced+pluripotent+stem+cells+from+aneuploid+syndromes.">Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes.</a> Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).</li><li>Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turner+syndrome:+mechanisms+and+management.">Turner syndrome: mechanisms and management.</a> Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniparental+disomy+of+the+entire+X+chromosome+in+Turner+syndrome+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Discovery. 1, 15022 (2015).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+from+an+adult+male+with+45,X/46,XY+mosaicism.">Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism.</a> Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).</li><li>Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+from+chorionic+villi+of+a+Turner+syndrome+spontaneous+abortion.">Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion.</a> Stem Cell Research. 19, (2017).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+Disease+Patient-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Viral+Reprogramming+Factors.">Parkinson's Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors.</a> Cell. 136, 964-977 (2009).</li><li>Somers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgene-Free+Lung+Disease-Specific+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+a+Single+Excisable+Lentiviral+Stem+Cell+Cassette.">Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette.</a> STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).</li><li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li><li>Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+Without+Viral+Integration.">Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration.</a> Science. 322, 945-949 (2008).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).</li><li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Reprogramming+to+Pluripotency+and+Directed+Differentiation+of+Human+Cells+with+Synthetic+Modified+mRNA.">Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins.">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Vector+and+Transgene+Sequences.">Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li><li>Mart&#237;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pluripotent+stem+cells.">Characterization of pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).</li><li>Ambartsumyan, G., Clark, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+and+early+human+embryo+development.">Aneuploidy and early human embryo development.</a> Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).</li></ol>

La generación de modelos celulares estables de tejido fetal citogenéticamente anormal es necesaria para perpetuar el fenotipo defectuoso. La ruta iPSC es el método más eficaz de preparación celular para la conservación perpetua de propiedades defectuosas20.
Las células madre pluripotentes (PSC) muestran propiedades de autorrenovación y diferenciación en células especializadas que recuerdan a los embriones de escisión temprana21. Por lo...

Las aneuploidies conducen a defectos de nacimiento / malformaciones congénitas y pérdida del embarazo en humanos. ~ 50% -70% de las muestras de pérdidas de embarazo muestran anomalías citogenéticas. Los embriones aneuploides perdidos al principio del embarazo no se pueden obtener fácilmente para el análisis experimental, lo que plantea la necesidad de desarrollar otros modelos que representen estrechamente la embriogénesis humana. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de células diagnosticadas con trastornos genéticos se han utilizado para modelar las irregularidades genéticas representativas y su consecuencia en el desarrollo fetal1,2,3,4. Estas iPSC se asemejan a las células epiblásticas del embrión en desarrollo y pueden recapitular los eventos tempranos de formación embrionaria. Permiten comprender y caracterizar el programa de desarrollo de los linajes celulares y el modelado en embriones de mamíferos tempranos. iPSCs derivadas previamente de fibroblastos cutáneas y amniocitos de pruebas diagnósticas prenatales de síndromes de aneuploidía como monosomía X (síndrome de Turner), trisomía 8 (síndrome de Warkany 2), trisomía 13 (síndrome de Patau) y trisomía parcial 11; 22 (síndrome de Emanuel) han proporcionado información valiosa sobre el desarrollo fallido4.
El síndrome de Turner (STT) es una afección rara caracterizada por infertilidad femenina, baja estatura, trastornos endocrinos y metabólicos, un mayor riesgo de enfermedad autoinmune y una predisposición a la enfermedad cardiovascular5. Aunque es el único síndrome de monosomía que puede superar, también es letal para el embrión en desarrollo causando abortos espontáneos6. Los individuos sobrevivientes con SST presentan grados de alteración del material cromosómico X en sus células. Los cariotipos van desde la pérdida completa de un cromosoma X (45,XO) hasta mosaicos como 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, la presencia de cromosomas en anillo, la presencia de material cromosómico Y,etc. 5.
El diagnóstico del síndrome generalmente se realiza mediante el cariotipo de sangre de individuos sintomáticos y el muestreo de vellosidades coriónicas (CVS) para detectar síndromes de aneuploidía temprana. Dado que los síndromes de aneuploidía representan ~ 30% de los abortos espontáneos, es rutinario cariotipar el producto de la concepción (POC) en un aborto espontáneo. Estas células fetales, incluidas las vellosidades coriónicas que poseen la anomalía citogenética y las iPSC derivadas de ellas, proporcionan una valiosa fuente de material biológico para estudiar los síndromes de aneuploidía4,6. Las iPSC de TS se han establecido previamente a partir de amniocitos a través de la reprogramación retroviral4,fibroblastos de vellosidades coriónicas (obtenidos a través del diagnóstico prenatal) a través de la reprogramación retroviral6,de células mononucleares sanguíneas7 a través de la reprogramación del virus de Sendai y de fibroblastos de la piel de los individuos de TS a través de la reprogramación lentiviral4 . Dado que el enfoque principal de nuestro laboratorio es comprender el fracaso del desarrollo, hemos generado IPSC TS a partir de POC, específicamente el componente de vellosidades coriónicas de un aborto espontáneo8. Todas las células aisladas de este tejido fetal tenían un cariotipo 45XO y producían iPSCs con el mismo cariotipo. Estas iPSC son únicas, ya que son las primeras que se generan a partir de un feto abortado y proporcionan un recurso valioso para estudiar las fallas del embarazo relacionadas con la aneuploidía. Este artículo proporciona una metodología detallada de la generación de iPSC a partir de esta fuente celular única a través de la reprogramación episomal.
Los primeros métodos de generación de iPSC utilizaron la transducción viral y los transposones para administrar los factores de reprogramación. Los métodos de inducción de células a la pluripotencia han evolucionado desde el uso de vectores retrovirales integradores9,vectores lentivirales excisables10,11 y métodos basados en transposones12 hasta vectores adenovirales no integradores13 y vectores basados en virus de Sendai14. La reprogramación basada en retrovirales y lentivirales, aunque eficiente, implica la integración de los factores de reprogramación en los cromosomas del huésped, causando mutaciones de inserción que tienen efectos imprevistos en las iPSC. Además, la reprogramación basada en virus impide la aplicación traslacional de iPSC. Se han explorado los sistemas basados en ARN15 y la entrega directa de proteínas16 para eliminar por completo los riesgos potenciales asociados con el uso de virus y transfecciones de ADN. Sin embargo, estos métodos han demostrado ser ineficientes.
En 2011, Okita et al. informaron una mejora en la eficiencia de la reprogramación por plásmidos episomales aumentados con la supresión de TP53 a través de shRNA. También reemplazaron cMYC con LMYC no transformador (MYC asociado al carcinoma de pulmón de células pequeñas) para mejorar la seguridad de las hiPSC. Estos plásmidos episomales expresan 5 factores de reprogramación: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC y shRNA para TP5317,18. Estos vectores se mantienen extracromosómicamente y se pierden de las células reprogramadas en el cultivo continuo, lo que hace que las líneas estén libres de transgenes dentro de 10-15 pasajes. La nucleofection es una forma especializada de electroporación que suministra ácidos nucleicos directamente al núcleo de las células huésped. Es un método eficiente para la entrega de los plásmidos de reprogramación en varios tipos de células. Los plásmidos episomales son rentables y compensan los altos costos de la nucleofección. Este método es eficiente y reproducible en condiciones optimizadas, produciendo iPSC estables a partir de una variedad de células somáticas. En este protocolo, describimos el método para la generación de iPSCs a partir de fibroblastos aislados del tejido fetal por nucleofección de plásmidos de reprogramación episomal. Aquí están los protocolos detallados para el aislamiento de fibroblastos de vellosidades coriónicas fetales, purificación de plásmidos, nucleofection, selección de colonias de la placa de reprogramación y establecimiento de iPSC estables.
Es esencial confirmar la presencia de rasgos de pluripotencia en las iPSC recién generadas. Esto incluye la demostración de factores relacionados con la pluripotencia (por ejemplo, expresión de fosfatasa alcalina, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherina; generalmente se muestra con ensayos de inmunofluorescencia o expresión génica), identificación de las tres capas germinales mediante ensayos de diferenciación in vitro para validar sus potenciales de diferenciación, cariotipo para determinar el contenido cromosómico, tipificación STR para establecer identidad con células madre, verificar la pérdida de genes exógenos, y ensayos in vivo más estrictos, como la formación de teratomas y la complementación tetraploide. Aquí describimos protocolos de caracterización de cariotipo, tinción de fosfatasa alcalina de células vivas, detección de biomarcadores relacionados con la pluripotencia por inmunofluorescencia, ensayos de diferenciación in vitro y método para demostrar pérdida de genes exógenos19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.15% trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>27250018</td>
			<td>G Banding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;, 6 diamidino-2-phenylindole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3003</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14353</td>
			<td>AP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMAXA Nucleofector II</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>-</td>
			<td>Nucleofection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmnioMAX II complete media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>11269016</td>
			<td>Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC021</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11059</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td>Contamination control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-Cadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nanog</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560109</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OCT3/4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>611202</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX17</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561590</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561469</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SSEA4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560073</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA 1-81</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4381</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Pluripotency medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Morphogenetic Factor 4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3016</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Human Type IV</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354245</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase blend</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8051</td>
			<td>Digestion of foetal chorionic villi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest EcoR1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0274</td>
			<td>Restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2518</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>S011</td>
			<td>G Banding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS001</td>
			<td>Fixative for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution human</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1884</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KR0368</td>
			<td>OriP, EBNA1 PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaryoMAX Colcemid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15210040</td>
			<td>Mitotic arrest for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10829018</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>M1151F</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB113</td>
			<td>Fixative for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin ventricular heavy chain &#945;/&#946;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1552</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHDF Nucleofector Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VAPD-1001</td>
			<td>Nucleofection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Fixing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27077</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hSK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27078</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hUL</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27080</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>&#160; Thermo Fisher Scientific,</td>
			<td>&#160;15070063</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving 
			Storage: Room temperature. 
			PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. 
			Storage: Room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid purification Kit- Midi prep</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12143</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride Solution</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB043</td>
			<td>Hypotonic solution for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Genomic DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Hepatocyte differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM255</td>
			<td>Hypotonic solution for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB031</td>
			<td>Permeabilisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Subculture of &#160;foetal chorionic villi fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB067</td>
			<td>Preparation of PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946; III tubulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of induced pluripotent stem cells from turner syndrome (45xo) fetal cells for downstream modelling of neurological deficits associated with the syndrome

Las aneuploidias cromosómicas causan malformaciones congénitas graves, incluidas malformaciones del sistema nervioso central y muerte fetal. El cribado genético prenatal es puramente diagnóstico y no aclara el mecanismo de la enfermedad. Aunque las células de fetos aneuploides son material biológico valioso que soporta la aneuploidía cromosómica, estas células son de corta duración, lo que limita su uso para experimentos de investigación posteriores. La generación de modelos de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) es un método eficaz de preparación celular para la conservación perpetua de rasgos aneuploides. Se autorrenovan y se diferencian en células especializadas que recuerdan al desarrollo embrionario. Por lo tanto, las iPSC sirven como excelentes herramientas para estudiar los eventos tempranos del desarrollo. El síndrome de Turner (TS) es una afección rara asociada con la falta total o parcial de un cromosoma X. El síndrome se caracteriza por infertilidad, baja estatura, trastornos endocrinos, metabólicos, autoinmunes y cardiovasculares y defectos neurocognitivos. El siguiente protocolo describe el aislamiento y cultivo de fibroblastos a partir de tejido fetal TS (45XO), generación de TSiPSC libres de integración a través de la entrega de plásmidos de reprogramación episomal por nucleofection seguido de caracterización. Las TSiPSC de reprogramación se examinaron inicialmente mediante tinción de fosfatasa alcalina de células vivas seguida de un sondeo extenso para detectar biomarcadores de pluripotencia. Las colonias seleccionadas fueron diseccionadas mecánicamente, pasadas varias veces y se utilizaron células estables autorrenovadoras para experimentos posteriores. Las células expresaron factores de transcripción de pluripotencia OCT4, NANOG, SOX2, marcadores de superficie celular SSEA 4 y TRA1-81 típicos de las células madre pluripotentes. El cariotipo 45XO original se mantuvo después de la reprogramación. Las TSiPSCs fueron capaces de formar cuerpos embrioides y diferenciarse en células de endodermo, mesodermo y ectodermo expresando biomarcadores específicos del linaje ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). Los plásmidos episomales exógenos se perdieron espontáneamente y no se detectaron después del paso 15 en las células. Estas TSiPSC son un valioso recurso celular para modelar el neurodesarrollo molecular y celular defectuoso que causa déficits neurocognitivos asociados con el síndrome de Turner.

Generación de iPSCs sin integración a partir de un feto abortado espontáneamente con cariotipo 45XO Se aislaron fibroblastos de FCV con un cariotipo 45XO específico del síndrome de Turner (ST) y se nucleofectaron con plásmidos de reprogramación episomal para generar TSiPSCs que pueden ser utilizados para el modelado posterior del síndrome, específicamente los déficits neurológicos asociados (Figura 1a&b). Se utilizaron vectores episomales no in...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome 45XO Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndr

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome 45XO Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Este protocolo describe la generación de iPSC libres de integración a partir de fibroblastos de tejido fetal a través de la administración de plásmidos episomales por nucleofection seguido de la descripción de los métodos utilizados para la caracterización de iPSC y la diferenciación neuronal.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir del síndrome de Turner (45XO) células fetales para el modelado posterior de déficits neurológicos asociados con el síndrome

Chromosomal aneuploidies cause severe congenital malformations including central nervous system malformations and fetal death. Prenatal genetic screening ...

El síndrome de Turner es una afección rara asociada con la falta total o parcial del cromosoma X. El síndrome se caracteriza por infertilidad, baja estatura, trastornos cardiovasculares y defectos neurocognitivos. En algunos casos, causa la muerte fetal.Aunque las células somáticas de los fetos aneuploides son biológicamente valiosas, son de corta duración, lo que limita su uso en la investigación. La generación de iPSC es, por lo tanto, un método eficaz de preparación celular para la conservación perpetua de los rasgos aneuploides. Se autorrenovan y pueden diferenciarse en tipos de células especializadas que recuerdan el desarrollo embrionario temprano.La entrega de plásmidos de reprogramación episomal no integradores a través de la ficción nuclear es un método eficiente y reproducible para generar iPSC completamente reprogramados y estables. Este método también se puede utilizar en células que son difíciles de programar. En este protocolo describimos la regeneración de iPSCs a partir de material fetal con anepupliod.Transfiera las vellosidades coriónicas fetales recolectadas a una placa de Petri estéril. Lávelo varias veces con PBS que contenga 1X solución antimicótica antibiótica. Retire el PBS por completo mediante pipeteo.Agregue 1 ml de mezcla de colagenasa a las vellosidades e incube a 37 grados centígrados durante 10 minutos o hasta que el tejido se desintegre. Después de la incubación, neutralice la colagenasa agregando medios que contengan 10% de suero bovino fetal. Transfiera el contenido de la placa de Petri a un tubo de 15 ml.Centrifugar el digesto para recoger las vellosidades desintegradas y las células liberadas. Decanta el sobrenadante con cuidado. Placa de vellosidades desintegradas junto con células liberadas en un matraz de cultivo T25 y medios AmnioMAX y crecen hasta obtener un cultivo de fibroblastos confluentes.Ampliar los fibroblastos y el cultivo para preparar las existencias para su uso en experimentos posteriores de transfección y caracterización. Preparar cultivos de álcali que contengan los plásmidos reprogramadores. Aísle los plásmidos utilizando el kit de purificación de plásmidos Midi, según las instrucciones del fabricante.Vuelva a suspender cada palet en un volumen adecuado de agua libre de DNAse RNAse para obtener una concentración final de 1 microgramo por mililitro. Verifique los plásmidos utilizando el kit de digestión de restricción ECoR1, siguiendo las instrucciones del fabricante. Tripsinizar los fibroblastos de vellosidades coriónicas.Neutralizar y centrifugar para recoger las células. Decantar el sobrenadante, y volver a suspender las células en 5 ml OPTI-MEM. Cuente las células usando un hemocitómetro y extraiga 1 millón de células para la nucleofección.Centrífuga para obtener palet celular. Realizar nucleofection utilizando Amaxa NHDF Neucleofactor Kit. Prepare el reactivo neucleofactor mezclando el suplemento de 0,5 ml y la solución de nucleofactor de 2,25 ml proporcionada en el kit.Retire 100 microlitros de solución de nucleofactor y agréguele 1 microgramo de cada plásmido. Vuelva a suspender suavemente 1 millón de células en esta mezcla. Transfiera la suspensión de ADN celular a la cubeta, asegurándose de que la muestra cubra la parte inferior de la cubeta sin burbujas de aire.Tapa la cubeta e insértelo en el soporte. Seleccione el programa de nucleofactores D-23 para una alta eficiencia y aplíquelo. Retire la cubeta del soporte y agregue 1 ml de soporte AmnioMAX.Transfiera el contenido suavemente a una placa de Petri tratada con cultivo de tejidos, utilizando la pipeta proporcionada en el kit. Incubar las células en una incubadora de dióxido de carbono humidificado a 37 grados centígrados. Mantenga las células en medios AmnioMAX durante 10 días y luego cambie a medio de pluripotencia durante 20 días.Para la expansión de iPSC, diseccione manualmente las colonias embrionarias similares a células madre formadas en el plato de reprogramación utilizando una pipeta de vidrio tirado. Propague las iPSC de manera adecuada y masajee cada cinco a siete días. Los iPCS fueron positivos para el marcador de pluripotencia fosfatasa alcalina.Genere cuerpos embrionarios cortando las colonias de iPSC en trozos pequeños y chapándolas en placas de Petri de baja fijación en medio de cuerpo embrionario. La diferenciación del ectodermo se induce al enchapar el día cuatro cuerpos embrionarios en el medio de diferenciación del ectodermo. Del mismo modo, la diferenciación del mesodermo es inducida por el recubrimiento del día ocho cuerpos embrionarios en el medio de diferenciación del mesodermo.Para inducir la diferenciación del endodermo, culta iPSCs en una monocapa en medio de diferenciación del endodermo. Los cambios morfológicos en los fibroblastos fueron monitoreados en el transcurso de la reprogramación. Expresan morfología epitelial similar a la de las células y formaron colonias compactas.Las células también tenían una relación de núcleo a citoplasma de altura, típica de las células pluripotentes en cultivo. Los iPSC poseían un tipo portador de 45 XO y fueron positivos para los marcadores de pluripotencia OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 y E-CADHERIN. Las células se tiñeron para marcadores representativos de la capa germinal.El síndrome de Turner desarrolla así déficits neurocognitivos. Las neuronas derivadas del síndrome de Turner iPSC pueden ser un excelente modelo. Esto se modela en una placa de Petri para comprender la nueva línea del síndrome de Turner disociativo normal.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de Frozen Buffy Coats utilizando para no integrar episomal plásmidos

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Generación de células madre pluripotentes inducidas por el Uso de sinoviocitos similares a fibroblastos aislados de las articulaciones de pacientes con artritis reumatoide

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de melanoma humano linfocitos infiltrantes de tumores,

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Inducida por la generación de células madre pluripotentes a partir de células de la sangre usando el virus Sendai y centrifugación

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definido y escalable Generación de células hepatocitos como las de las células madre pluripotentes

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Formación de gránulos condrogénicos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre del cordón umbilical

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generación de organoides Cerebral prosencéfalo-tipo estandarizadas y reproducibles de humanos inducida por células madre pluripotentes

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Generación humana Primordial células germinales-como las células en la superficie de cuerpos de Embryoid de pluripotencia cebada inducida por células madre pluripotentes

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generación de 3D piel organoide de cable derivadas de sangre inducida por las células de vástago Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...