Name: generation of induced pluripotent stem cells from turner syndrome (45xo) fetal cells for downstream modelling of neurological deficits associated with the syndrome
Uploaded: 2021-12-04T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome 45XO Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndr

Ekonomiskt stöd till ovanstående forskning tillhandahölls av Manipal Academy of Higher Education. Karakterisering av linjen genomfördes delvis i laboratoriet för M.M Panicker vid NCBS. Vi tackar Anand Diagnostic Laboratory för hjälp med karyotypning.

FCV erhölls från Manipal Hospital, Bengaluru, under Etikkommittén för Manipal Hospitals godkännande.
SE tabell 1 för sammansättning av alla buffertar och lösningar.
1. Isolering av fibroblaster från fetala chorionic villi (FCV)
<ol><li>
Provsamling och vävnadsupplösning i kollagenas
	<ol>
<li>Samla FCV under sterila förhållanden i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och transportera (vid rumstemperatur) ...

<ol>
	<li>Verlinsky, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell+lines+with+genetic+disorders.">Human embryonic stem cell lines with genetic disorders.</a> Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).</li><li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Study+of+Fragile+X+Syndrome+Using+Human+Embryonic+Stem+Cells+Derived+from+Preimplantation+Genetically+Diagnosed+Embryos.">Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos.</a> Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).</li><li>Biancotti, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Embryonic+Stem+Cells+as+Models+for+Aneuploid+Chromosomal+Syndromes.">Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes.</a> STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+abnormal+early+development+with+induced+pluripotent+stem+cells+from+aneuploid+syndromes.">Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes.</a> Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).</li><li>Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turner+syndrome:+mechanisms+and+management.">Turner syndrome: mechanisms and management.</a> Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniparental+disomy+of+the+entire+X+chromosome+in+Turner+syndrome+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Discovery. 1, 15022 (2015).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+from+an+adult+male+with+45,X/46,XY+mosaicism.">Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism.</a> Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).</li><li>Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+from+chorionic+villi+of+a+Turner+syndrome+spontaneous+abortion.">Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion.</a> Stem Cell Research. 19, (2017).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+Disease+Patient-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Viral+Reprogramming+Factors.">Parkinson's Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors.</a> Cell. 136, 964-977 (2009).</li><li>Somers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgene-Free+Lung+Disease-Specific+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+a+Single+Excisable+Lentiviral+Stem+Cell+Cassette.">Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette.</a> STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).</li><li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li><li>Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+Without+Viral+Integration.">Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration.</a> Science. 322, 945-949 (2008).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).</li><li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Reprogramming+to+Pluripotency+and+Directed+Differentiation+of+Human+Cells+with+Synthetic+Modified+mRNA.">Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins.">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Vector+and+Transgene+Sequences.">Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li><li>Mart&#237;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pluripotent+stem+cells.">Characterization of pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).</li><li>Ambartsumyan, G., Clark, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+and+early+human+embryo+development.">Aneuploidy and early human embryo development.</a> Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).</li></ol>

Generering av stabila cellulära modeller av cytogenetiskt onormal fetala vävnad är nödvändigt för att upprätthålla defekta fenotyp. IPSC-rutten är den mest effektiva metoden för cellberedning för evig bevarande av defekta egenskaper20.
Pluripotenta stamceller (PSC) visar egenskaper hos självförnyelse och differentiering i specialiserade celler som påminner om tidiga klyvningsembryon21. Därför kan PSCs fungera som utmärkta modelle...

Aneuploidies leder till fosterskador/medfödda missbildningar och graviditet förlust hos människor. ~ 50%-70% av exemplaren från graviditetsförluster visar cytogenetiska avvikelser. Aneuploida embryon som förlorats tidigt i graviditeten kan inte lätt erhållas för experimentell analys som ökar behovet av att utveckla andra modeller som nära representerar human embryogenes. Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) som härrör från celler som diagnostiserats med genetiska störningar har använts för att modellera de representativa genetiska oegentligheterna och deras konsekvens på fostrets utveckling1,2,3,4. Dessa iPSCs liknar epiblastceller i det utvecklande embryot och kan rekapitulera de tidiga händelserna i embryobildning. De tillåter förståelse och karakterisering av utvecklingsprogrammet för cell härstamningar och mönstra i tidiga däggdjursembryon. IPSCs härrör tidigare från huden fibroblaster och amniocyter från prenatala diagnostiska tester av aneuploidy syndrom som monosomi X (Turner syndrom), trisomi 8 (Warkany syndrom 2), trisomi 13 (Patau syndrom) och partiell trisomi 11; 22 (Emanuel syndrom) har gett värdefulla insikter om misslyckad utveckling4.
Turner syndrom (TS) är ett sällsynt tillstånd som kännetecknas av kvinnlig infertilitet, kort resning, endokrina och metabola störningar, en ökad risk för autoimmun sjukdom och en predisposition för hjärt-kärlsjukdom5. Även om det är det enda överlevnadsbara monosomisyndromet är det också dödligt för det utvecklande embryot som orsakar spontana aborter6. Överlevande individer med TS närvarande med grader av förändring av X-kromosomal material i sina celler. Karyotyper varierar från fullständig förlust av en X-kromosom (45,XO) till mosaiker som 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, närvaron av ringkromosomer, närvaron av Y-kromosommaterialetc.
Diagnos av syndromet görs i allmänhet genom karyotypning blod av symptomatiska individer och chorionic villi provtagning (CVS) för att upptäcka tidiga aneuploidy syndrom. Eftersom aneuploidy syndrom står för ~ 30% av spontana aborter, är det rutin att karyotyp produkten av befruktning (POC) vid en spontan abort. Dessa fetala celler inklusive chorionic villi som har cytogenetiska onormala tillstånd och iPSCs som härrör från dem ger en värdefull källa till biologiskt material för att studera aneuploidy syndrom4,6. TS iPSCs har tidigare etablerats från amniocyter via retroviral omprogrammering4, fibroblaster av korioniska villi (erhållna genom prenatal diagnos) via retroviral omprogrammering6, från blodmononukleära celler7 via Sendai virus omprogrammering och från huden fibroblaster av TS-individer via lentiviral omprogrammering4 . Eftersom det primära fokuset för vårt labb är att förstå utvecklingsmisslyckande har vi genererat TS iPSCs från POC, särskilt den chorionic villi komponenten i en spontan abort8. Alla celler isolerade från denna fetala vävnad hade en 45XO karyotyp och gett iPSCs med samma karyotyp. Dessa iPSCs är unika eftersom de är de första som genereras från ett aborterat foster och ger en värdefull resurs för att studera aneuploidy relaterade graviditet misslyckanden. Den här artikeln innehåller en detaljerad metod för generering av iPSCs från denna unika cellkälla via episomal omprogrammering.
De tidiga metoderna för iPSC-generering använde viral transduktion och transposoner för att leverera omprogrammeringsfaktorerna. Metoder för att inducera celler till pluripotens har utvecklats från att använda integrera retrovirala vektorer9,excisable lentiviral vektorer10,11 och transposonbaserade metoder12 till icke-integrerande adenoviral vektorer13 och Sendai virusbaserade vektorer14. Retroviral och lentiviral baserade omprogrammering, även om effektiv, innebär integration av omprogrammeringsfaktorerna i värd kromosomer, orsakar insättning mutationer som har oförutsedda effekter i iPSCs. Dessutom förhindrar virusbaserad omprogrammering translationell tillämpning av iPSC. RNA-baserade system15 och direkt proteintillförsel16 har undersökts för att helt eliminera de potentiella riskerna i samband med användning av virus och DNA-transfektioner. Dessa metoder har dock visat sig ineffektiva.
Under 2011 rapporterade Okita et al. förbättrad effektivitet av omprogrammering av episomala plasmider förstärkta med TP53-dämpning via shRNA. De ersatte också cMYC med icke-transformerande LMYC (små cell lung carcinom associerade MYC) för att förbättra säkerheten för hiPSCs. Dessa episomala plasmider uttrycker 5 omprogrammeringsfaktorer: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC och shRNA för TP5317,18. Dessa vektorer underhålls extra-kromosomalt och förloras från de omprogrammerade cellerna på kontinuerlig kultur, vilket gör linjerna transgene-fria inom 10-15 passager. Nukleofection är en specialiserad form av elektroporation som levererar nukleinsyror direkt in i kärnan av värdceller. Det är en effektiv metod för leverans av omprogrammeringsplasmider till olika celltyper. Episomala plasmider är kostnadseffektiva och kompenserar de höga kostnaderna för nukleofection. Denna metod är effektiv och reproducerbar under optimerade förhållanden som ger stabila iPSCs från en mängd olika somatiska celler. I detta protokoll beskriver vi metoden för generering av iPSCs från fibroblaster isolerade från fetala vävnad genom nukleofection av episomal omprogrammering plasmider. Här är de detaljerade protokollen för fibroblast isolering från fetala chorionic villi, plasmid rening, nukleofection, plockning av kolonier från omprogrammering plattan och upprättandet av stabila iPSCs.
Det är viktigt att bekräfta förekomsten av pluripotency egenskaper i de nyligen genererade iPSCs. Detta inkluderar påvisande av pluripotensrelaterade faktorer (t.ex. alkaliska fosfatasuttryck, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherin; vanligtvis visas med immunofluorescens- eller genuttrycksanalyser), identifiering av de tre bakterielagren genom in vitro-differentieringsanalyser för att validera deras differentieringspotential, karyotypning för att bestämma kromosominnehåll, STR-skrivning för att fastställa identitet med överordnade celler, verifiera förlust av gener. och strängare in vivo-analyser såsom teratombildning och tetraploidkomplementering. Här beskriver vi karakteriseringsprotokoll av karyotypning, levande celler alkalisk fosfatasfärgning, detektion av pluripotensrelaterade biomarkörer genom immunofluorescens, in vitro differentieringsanalyser och metod för att visa förlust av exogena gener19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.15% trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>27250018</td>
			<td>G Banding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;, 6 diamidino-2-phenylindole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3003</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14353</td>
			<td>AP staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMAXA Nucleofector II</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>-</td>
			<td>Nucleofection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmnioMAX II complete media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>11269016</td>
			<td>Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC021</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11059</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td>Contamination control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-Cadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nanog</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560109</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OCT3/4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>611202</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX17</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561590</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561469</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SSEA4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560073</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA 1-81</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4381</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Pluripotency medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Morphogenetic Factor 4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3016</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Human Type IV</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354245</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase blend</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8051</td>
			<td>Digestion of foetal chorionic villi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest EcoR1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0274</td>
			<td>Restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2518</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>S011</td>
			<td>G Banding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS001</td>
			<td>Fixative for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution human</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1884</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KR0368</td>
			<td>OriP, EBNA1 PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaryoMAX Colcemid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15210040</td>
			<td>Mitotic arrest for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10829018</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>M1151F</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB113</td>
			<td>Fixative for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin ventricular heavy chain &#945;/&#946;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1552</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHDF Nucleofector Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VAPD-1001</td>
			<td>Nucleofection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Fixing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27077</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hSK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27078</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hUL</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27080</td>
			<td>Episomal reprogramming Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>&#160; Thermo Fisher Scientific,</td>
			<td>&#160;15070063</td>
			<td>Pluripotency and Embryoid body medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving 
			Storage: Room temperature. 
			PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. 
			Storage: Room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid purification Kit- Midi prep</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12143</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride Solution</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB043</td>
			<td>Hypotonic solution for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Genomic DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Hepatocyte differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM255</td>
			<td>Hypotonic solution for karyotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB031</td>
			<td>Permeabilisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Subculture of &#160;foetal chorionic villi fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB067</td>
			<td>Preparation of PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946; III tubulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Differentiation assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of induced pluripotent stem cells from turner syndrome (45xo) fetal cells for downstream modelling of neurological deficits associated with the syndrome

Kromosomal aneuploidies orsaka allvarliga medfödda missbildningar inklusive centrala nervsystemet missbildningar och fetala död. Prenatala genetisk screening är rent diagnostisk och belyser inte sjukdom mekanism. Även om celler från aneuploida foster är värdefullt biologiskt material som bär kromosomal aneuploidy, är dessa celler kortlivade, vilket begränsar deras användning för nedströms forskningsexperiment. Generering av inducerade pluripotenta stamcellsmodeller (iPSC) är en effektiv metod för cellberedning för evig bevarande av aneuploidegenskaper. De är självförnyande och differentierar sig till specialiserade celler som påminner om embryonal utveckling. IPSCs fungerar således som utmärkta verktyg för att studera tidiga utvecklingshändelser. Turner syndrom (TS) är ett sällsynt tillstånd som är associerade med en helt eller delvis saknas X-kromosom. Syndromet kännetecknas av infertilitet, kort resning, endokrina, metabola, autoimmuna och kardiovaskulära störningar och neurokognitiva defekter. Följande protokoll beskriver isolering och odling av fibroblaster från TS (45XO) fetala vävnad, generering av integration gratis TSiPSCs genom leverans av episomal omprogrammering plasmider genom nukleofection följt av karakterisering. Omprogrammering TSiPSCs screenades ursprungligen av levande cell alkaliska fosfatas färgning följt av omfattande sondering för pluripotency biomarkörer. Utvalda kolonier dissekerades mekaniskt, passagedes flera gånger och stabila självförnyande celler användes för ytterligare experiment. Cellerna uttryckte pluripotency transkriptionsfaktorer OCT4, NANOG, SOX2, cellytan markörer SSEA 4 och TRA1-81 typiska för pluripotenta stamceller. Den ursprungliga 45XO karyotyp behölls efter omprogrammering. TSiPSCs kunde bilda embryoidkroppar och differentieras till celler av endoderm, mesoderm och ectoderm som uttrycker härstamningsspecifika biomarkörer ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). Exogena episomal plasmids förlorades spontant och inte upptäckts efter passage 15 i celler. Dessa TSiPSCs är en värdefull cellulär resurs för modellering defekt molekylära och cellulära neuroutveckling orsakar neurokognitiva underskott är associerade med Turner syndrom.

Generering av integrationsfria iPSCs från ett spontant aborterat foster med 45XO karyotyp Vi isolerade fibroblaster från FCV med en Turner syndrom (TS) specifika 45XO karyotyp och nukleofected dem med episomal omprogrammering plasmider för att generera TSiPSCs som kan användas för nedströms modellering av syndromet, särskilt de associerade neurologiska underskotten (figur 1a&b). Vi använde icke-integrerande episomala vektorer och nukleofection fö...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome 45XO Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndr

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome 45XO Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Detta protokoll beskriver generering av integration gratis iPSCs från fetala vävnad fibroblaster genom leverans av episomal plasmider genom nukleofection följt av beskrivning av metoder som används för iPSC karakterisering och neuronal differentiering.

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från Turners syndrom (45XO) Fosterceller för nedströms modellering av neurologiska underskott i samband med syndromet

Chromosomal aneuploidies cause severe congenital malformations including central nervous system malformations and fetal death. Prenatal genetic screening ...

Turner syndrom är ett sällsynt tillstånd som är associerade med en helt eller delvis saknas X-kromosom. Syndromet kännetecknas av infertilitet, kort resning, kardiovaskulära störningar och neurokognitiva defekter. I vissa fall orsakar det fosterdöd.Även om somatiska celler av aneuploida foster är biologiskt värdefulla, är de kortlivade, vilket begränsar deras användning i forskning. Generering av iPSC är således en effektiv metod för cellberedning för evig bevarande av aneuploida egenskaper. De är självförnyande och kan differentiera sig till specialiserade celltyper som påminner om tidig embryonal utveckling.Leverans av icke-integrerande episomala omprogrammeringsplasmider genom kärnfiktion är en effektiv och reproducerbar metod för att generera helt omprogrammerade och stabila iPSC. Denna metod kan också användas på celler som är svåra att programmera. I detta protokoll beskriver vi regenerering av iPSCs från fetala material med aneupliod.Överför den insamlade fetala chorionic villi till en steril Petri-maträtt. Tvätta det flera gånger med PBS som innehåller 1X antimykotisk lösning. Ta bort PBS helt genom pipettering.Tillsätt 1 ml kollagenasblandning till villi och inkubera vid 37 grader Celsius i 10 minuter eller tills vävnaden sönderdelas. Efter inkubation neutraliserar du kollagenaset genom att tillsätta media som innehåller 10% fetalt bovinserum. Överför innehållet i Petri-skålen till ett 15 ml rör.Centrifugera sammandraget för att samla upp de sönderfallna villi och släppte celler. Dekantera supernatanten försiktigt. Platta upplöst villi tillsammans med utsläppta celler i en T25-odlingskolv och AmnioMAX-media och växa tills en sammanflöde fibroblastkultur erhålls.Expandera fibroblaster och kultur för att förbereda lager för användning i efterföljande transfekterings- och karakteriseringsexperiment. Förbered alkalikulturer som innehåller omprogrammeringsplasmiderna. Isolera plasmiderna med Midi plasmid reningskit, enligt tillverkarens instruktioner.Suspendera varje pall i lämplig volym DNAse RNAse fritt vatten för att erhålla en slutlig koncentration på 1 mikrogram per milliliter. Kontrollera plasmiderna med ECoR1-begränsningsrötningssatsen enligt tillverkarens instruktioner. Trypsinize chorionic villi fibroblasts.Neutralisera och centrifugera för att samla cellerna. Dekantera supernatanten och suspendera cellerna i 5 ml OPTI-MEM. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och ta bort 1 miljon celler för nukleofection.Centrifug för att erhålla cellpall. Utför nukleofection med Amaxa NHDF Neucleofactor Kit. Förbered neukleofactorreagens genom att blanda 0,5 ml tillägg och 2,25 ml nukleofaktorlösning som finns i satsen.Ta bort 100 mikroliter nukleofaktorlösning och tillsätt 1 mikrogram av varje plasmid till den. Suspendera försiktigt 1 miljon celler i denna blandning. Överför cellens DNA-suspension till cuvette, så att provet täcker botten av cuvette utan luftbubblor.Kapa cuvettet och sätt in i hållaren. Välj nukleofabriksprogrammet D-23 för hög effektivitet och applicera. Ta ut cuvette ur hållaren och tillsätt 1 ml AmnioMAX-media.Överför innehållet försiktigt till en vävnadskulturbehandlad Petri-skål med pipetten i satsen. Inkubera cellerna i en fuktad koldioxidinkubator vid 37 grader Celsius. Underhåll cellerna i AmnioMAX-media i 10 dagar och skifta sedan till pluripotensmedium i 20 dagar.För iPSC-expansion, dissekera manuellt de embryonala stamcellsliknande kolonierna som bildas i omprogrammeringsfatet med hjälp av en pulled glasspipette. Sprid iPSCs på lämpligt sätt och massera var femte till sjunde dag. IPCSs var positiva för pluripotency markör alkaliska fosfatas.Generera embryoidkroppar genom att skära iPSC-kolonierna i små bitar och plätera dem i petriskålar med låg fastsättning i embryoidkroppsmedium. Ectoderm differentiering induceras genom plätering dag fyra embryoid organ i ectoderm differentiering medium. På samma sätt induceras mesoderm differentiering genom plätering dag åtta embryoid organ i mesoderm differentiering medium.För att inducera endoderm differentiering, kultur iPSCs i en monolayer i endoderm differentiering medium. Morfologiska förändringar i fibroblaster övervakades under omprogrammering. De uttrycker epitelcellliknande morfologi och bildade kompakta kolonier.Cellerna hade också en höjd kärna till cytoplasmic förhållandet, typiska för pluripotent celler i kultur. IPSCs hade en 45 XO bärartyp och var positiva för pluripotency markörer OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 och E-CADHERIN. Cellerna var färgade för representativa groddar-lager markörer.Turner syndrom utvecklar således neurokognitiva underskott. Nervceller som härrör från Turners syndrom iPSC kan vara en utmärkt modell. Detta är modellerat i en petriskplatta för att förstå den nya linjen av normalt disassociativt Turnersyndrom.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från Frozen Buffy Coats använder icke-integrerande Episomalt plasmider

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Generering av inducerade-pluripotenta stamceller med hjälp fibroblastliknande synoviocyter Isolerad från fogar av patienter med reumatoid artrit

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från humant melanom tumörinfiltrerande lymfocyter

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Inducerade pluripotenta stamceller Generation från blodkroppar med användning Sendai virus och centrifugering

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generation Integrations-fria inducerade pluripotenta stamceller från humant perifert blod mononukleära celler med användning av episomala vektorer

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definierade och skalbar generation av hepatocyte-liknande celler från mänskliga pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Kondrogen pelletsbildning från Cord Blood-härledda inducerade Pluripotenta stamceller

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation av standardiserade och reproducerbara framhjärnan-typ Cerebral Organoids från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Generation av mänskliga primordiala könsceller-liknande celler på ytan av Embryoid kroppar från primas-pluripotency inducerade pluripotenta stamceller

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generation av 3D hud Organoid från sladd blod-derived inducerade pluripotenta stamceller

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...