Name: comparative analysis of experimental methods to quantify animal activity in caenorhabditis elegans models of mitochondrial disease
Uploaded: 2021-04-04T14:00:00
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我们感谢安东尼·罗斯纳博士为该项目的早期准备工作提供组织支持，并感谢艾琳·豪斯为协议分析做出贡献。这项工作由朱丽叶治疗FBXL4线粒体疾病研究基金、贾克逊·弗林特C12ORF65研究基金和国家卫生研究院（R01-GM120762，R01-GM120762-08S1，R35-GM134863和T32-NS007413）资助。内容完全由作者负责，不一定代表资助者或国家卫生研究院的官方观点。

1. 使用 ZebraLab 软件在玻璃幻灯片上的液体介质中的蠕虫运动器活动分析
<ol><li>线虫生长和处理<ol>
<li>在含有线虫生长介质 （NGM） 的培养皿板上种植C. elegans，并以大肠杆菌OP50 作为食物来源传播。将蠕虫培养保持在 20 °C，如前所述8。</li>
		<li>同步蠕虫执行定时卵子奠定52 和研究蠕虫在所需的阶段。在此协议中，对 L4 阶段蠕虫进行了分析。</li>
		...

在这里，该研究总结了详细的信息和理由，研究C.elegans神经肌肉活动在不同的结果水平，包括蠕虫击打，运动，咽抽水，化疗。比较了16种不同的活动分析方法，从不同年龄和实验持续时间的单个蠕虫或蠕虫种群中线虫活动的相对吞吐量、优势和局限性进行。其中，突出了两种新型的适应和半自动分析的应用，以证明在L4幼虫发育阶段幼虫和在一个成熟的线粒体复合体I病C.elegans菌株?...

卡诺哈比德炎是公认的神经科学的杰出模型，因为它有302个神经元，协调所有蠕虫的行为，包括交配，喂养，产卵，排便，游泳和固体介质1运动。这些造虫线虫也广泛用于理解广泛的人类疾病机制，其良好的基因组特征和高同源性 +80% 的基因之间的C. elegans和人类2，3，4.长期以来，C.elegans一直被用来询问人类线粒体疾病5，6，7，8，9，10，这是一个高度遗传和表型异构的遗传代谢紊乱组，共享受损的能力，以产生细胞能量，往往临床存在严重受损的神经肌肉功能，运动不耐受和疲劳11 ，12，13，14。为此，使用C.elegans模型，能够对线粒体疾病不同遗传亚型动物活动和神经肌肉功能的定量方面进行临床前建模，以及它们对可能改善其神经肌肉功能和整体活动的候选人疗法的反应。
C.elegans的神经肌肉活动通过一系列实验方法客观地可以测量，包括手动和半自动方法，允许在固体或液体介质（表1）1，15进行功能分析。准确量化C.elegans活动已被证明对与肌肉和神经系统16、17、18的功能和发展有关的发现非常重要。本研究总结并比较了17种不同检测方法的实验要求、优势和局限性，这些分析可以在研究实验室中进行，以评估C.elegans疾病模型中的四个关键结果的神经肌肉功能和活动，这些结果既在一系列发育阶段和年龄的基线上，也针对候选疗法（表1）).事实上，该研究提供了详细的概述，以描述C.elegans击打率（身体弯曲每分钟），体液活动，咽抽水，和化疗在每种情况下，具体说明使用的实验和分析方法，每种方法的优势和局限性，设备和软件需要执行和分析每个检测， 以及每种方法的吞吐量，以支持其用于高通量基因或药物筛选目的。根据实验协议的复杂性（包括蠕虫维护、处理时间、使用单井或多井板以及/或完成实验设置和数据分析所需的实验时间）来描述每个检测的吞吐量为低、中或高。
手动分析击打19，龙体活性20，咽泵17，21，化疗22，23是公认的方法来评估蠕虫活动，需要立体显微镜24。虽然测量蠕虫的击打活性需要分析液体介质，以确定每分钟身体弯曲的频率，但蠕虫的体压活动可以用固体介质或液体介质来测量。但是，对单个蠕虫活动的手动分析本身就很费时，并且涉及不可避免的用户生成的偏差。蠕虫活动分析的自动化可最大限度地减少用户生成的偏差，并可大幅提高实验吞吐量25。液体介质中蠕虫击打活动的视频录音可以使用"wrMTrck"（ImageJ插件26）进行分析。然而，最初为wMTrck开发的实验设置限制了其效用，因为单个液体掉落中的蠕虫太多导致蠕虫重叠，使得精确跟踪变得困难。虽然这个实验限制已经解决了27，wrMTrck方法不能支持高通量筛选。
存在一系列方法来量化基线的蠕虫运动体活动，并响应C.elegans线粒体疾病模型中的候选疗法。其中包括斑马实验室（视点生命科学），Tierpsy跟踪器28，宽视场线虫跟踪平台（WF-NTP）29，蠕虫汽车，蠕虫观察器30，蠕虫实验室31，无限芯片32，和W微轨跟踪器133（表1）。这些方法能够同时分析多蠕虫菌株或条件下的移动，通常位于多井板上，从而支持高通量药物筛选应用。其中一些方法具有独特的考虑因素，可能会限制或增强其通用性，例如需要昂贵的设备而不是开放访问软件，以及执行实验协议的不同易用性。总体而言，没有一个实验系统或协议非常适合所有C.elegans运动实验。相反，重要的是要仔细选择哪种方法最适合特定的调查员的实验目标和要求。
咽部抽水是评估C.elegans神经肌肉活动的另一个重要结果。C.elegans咽由20个肌肉细胞、20个神经元和20个其他细胞组成，这些细胞能够在蠕虫的胃道34、35、36的前端摄入大肠杆菌（大肠杆菌）。已建立了若干手动方法，以确定咽抽水率17，21，37，38。大多数方法是基于使用立体显微镜和相机可视化和记录咽抽吸频率与实验观察者21直接计数。通过执行称为电磷图 （EPG） 的细胞外记录，可以进行自动咽泵速率分析，该记录提供了有关每个泵39持续时间的其他信息。在微流体系统WormSpa中，也可以进行咽部抽吸率分析，其中单个蠕虫被限制在40、41室中。一种可用于促进咽泵速率分析的商业方法是 ScreenChip 系统（InVivo 生物系统），它测量、可视化和分析在自定义芯片中固定的单个蠕虫中喂养行为的神经肌肉方面。这种咽抽水定量方法可用于评估神经元和生理对药物的反应，衰老，和其他因素42，43，44，45。
切莫塔西斯描述了 C.elegans 的运动，以响应在线虫生长介质（NGM）板块的定义区域放置远离蠕虫的气味。评估化疗反应提供了蠕虫神经元和神经肌肉活动的综合测量，通过观察和测量蠕虫在规定的时间段46中向气味剂移动的物理距离来量化。多蠕虫跟踪器是一种自动方法，可用于提高实验效率，量化蠕虫向吸引者或驱虫剂47的距离。
在这里，描述了为量化蠕虫活动而建立的两种新型半自动化方法的详细协议。第一种方法利用ZebraLab一种最初开发用于研究Danio rerio（斑马鱼）游泳活动的商业软件，用于一种新的中等通量应用，根据运动过程中的像素变化（表1，图1）量化C.elegans液体介质中的整体运动体活动。数据输出是从大量并发条件和在玻璃滑梯上分析的样品中快速获得的，尽管这种方法不适合多井板格式。第二种方法是对WormScan方法48，49（图2）的全新改编，它使用平板扫描仪创建两个连续扫描的差分图像，可以与开源软件一起使用，从而能够半自动定量分析综合生理结果，如生育和生存。在这里，开发了一种新的WormScan方法，以量化每口96井平底板15个幼虫阶段4（L4）蠕虫种群中液体介质中的蠕虫体活性。这种半自动化和低成本的WormScan方法可以很容易地适应高通量的药物筛选，以及分析各种动物阶段和年龄48，49岁。
在这里，使用斑马实验室和WormScan半自动化方法分析C.elegans运动活动的协议和有效性在线粒体复合物I病，气体-1（fc21）的成熟C.elegans模型中得到了证明。气体-1（K09A9.5基因）是人类NDUFS2（NADH：尿素氧化物酶核（铁硫蛋白）子组2）（图3）的正词。C.elegans气体-1（fc21）突变菌株携带同源p.R.R.290K误入原位突变在NDUFS250的人类正统，导致显著减少的生育和寿命， 受损的呼吸链氧化磷化（OXPHOS）容量51，以及线粒体质量和膜潜力降低，增加氧化应激5，8 .尽管过去二十年来它已久经研究线粒体疾病，但此前没有报告过气体-1（fc21）突变体的体活性。在这里，ZebraLab和WormScan方法被应用于独立量化气体-1（fc21）与野生类型（WT，N2布里斯托尔）蠕虫的旋孔活性，既作为验证方法的一种方式，也是为了证明其实验协议和信息学分析的相对效用和效率。ZebraLab 软件允许快速量化C. elegans线粒体疾病模型中蠕虫运动者活动的几个并发条件，并有可能应用于有针对性的药物筛选或验证研究。WormScan 分析尤其适合于方便地启用复合库的高通量药物筛选，并优先考虑改善原发线粒体疾病临床前C. elegans模型中的动物神经肌肉功能和运动体活性的引线。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C. elegans wild isolate</td>
			<td>&#160;Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2 Bristol</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gas-1(fc-21)</td>
			<td>CGC</td>
			<td>CW152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4951PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium (NGM)</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>N81800-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Uracil auxotroph E. coli strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm)</td>
			<td>&#160;VWR international</td>
			<td>25373-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. Basal</td>
			<td>VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O</td>
			<td>VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>EPSON</td>
			<td>V800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10 microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat bottom</td>
			<td>&#160;VWR international</td>
			<td>29442-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormScan software</td>
			<td>Mathew et al. 45</td>
			<td>S1 Standalone Java platform</td>
			<td>Software for automation of difference image of scanned plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZebraLab software</td>
			<td>ViewPoint</td>
			<td></td>
			<td>Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparative analysis of experimental methods to quantify animal activity in caenorhabditis elegans models of mitochondrial disease

卡诺哈布迪炎埃莱甘斯被广泛认可为一种转化动物模型，可以有效地询问各种人类疾病的机制和疗法。蠕虫特别适合高通量基因和药物筛选，通过利用其快速发展周期、大育雏规模、短寿命、微观透明度、低维护成本、强大的基因组工具套件、突变存储库和实验方法来深入了解治疗靶点和疗法，从而对活体和前体内生理学进行询问。蠕虫体活性代表一种特别相关的表型，经常在线粒体疾病中受损，线粒体疾病在病因和表现上高度异质，但共同具有产生细胞能量的能力受损。虽然一套不同的方法可用于询问蠕虫行为，但这些方法在实验成本、复杂性和基因组或药物高通量屏幕的效用方面差异很大。在这里，比较了16种不同活性分析方法的相对产量、优势和局限性，在C.elegans的单个蠕虫或蠕虫群中对线虫运动、颤动、咽抽吸和/或化疗进行量化，时间不同。elegans的单个蠕虫或蠕虫种群在不同阶段、年龄和实验持续时间。演示了两种半自动化方法的详细协议，以量化代表现有软件工具新应用的线虫运动体活动，即 ZebraLab（中等吞吐量方法）和 WormScan（高通量方法）。应用这些方法的数据表明，类似的减少动物活动发生在L4幼虫阶段，并在第一天成人进展，在线粒体复合I病（气体-1（fc21）突变蠕虫相对于野生类型（N2布里斯托尔）C.elegans。这些数据验证了使用 ZebraLab 或 WormScan 软件工具高效、客观地量化蠕虫运动活动的这些新应用的效用，具有可变容量，支持线粒体疾病临床前动物模型中对蠕虫行为进行高通量药物筛查。

分析液体介质中的C. elegans运动体活性可以轻松捕获线粒体疾病蠕虫模型的集成表型，这些模型在固体介质上可能不容易量化。ZebraLab 用于量化在 L4 幼虫阶段液体介质中相对于 WT 虫的成熟线粒体复合体 I 病气体-1（fc21）菌株的体活动。在1分钟内记录了5个蠕虫在一次液体下降中的活性，每个菌株总共记录了19个视频（技术复制），总共分析了每个菌株95个蠕虫。每个菌株获得了?...

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Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

本研究为C.elegans复合I病气体-1（fc21）蠕虫（即斑马实验室（中通量检测）和WormScan（高通量检测）的两种半自动运动体活性分析方法提供了协议，并在各种研究方法中提供了比较分析，以量化线虫行为和综合神经肌肉功能。

线粒体疾病脑 膜炎基因 模型中量化动物活动的实验方法比较分析

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

该协议使用两种不同的半启动检测方法快速量化液体介质中的C.elegans运动体活性，并有可能应用于C.elegans疾病模型的药物筛查。这两种技术的主要优点是易于使用和易于重复。这两种技术都有可能以可变的吞吐量来评估药物对蠕虫行为的影响。这些运动性测定有助于评估C.elegans线粒体疾病模型的体细胞活性，在这些模型中，动物的神经肌肉系统受损。要分析C.elegans在玻璃滑梯上液体介质中的体活动，在同步控制NGM板上的突变蠕虫菌株后，无论是否对L4阶段进行感兴趣的药物治疗，请使用蠕虫采摘和立体显微镜，每株和条件在玻璃滑梯上采摘5只蠕虫，并将其转化为S.basal溶液的单独20微升滴。将来自相同实验条件的蠕虫从不同的 NGM 板添加到同一幻灯片上的多个液滴中，以获得多个技术复制。收集所有蠕虫后，让动物在室温下在滑梯上适应一分钟，然后以每滴 15 帧每秒 15 帧的速度记录蠕虫在每次下降中游泳活动一分钟。要使用 ZebraLab 软件分析录制的 C.elegans 运动活动，请使用 ZEBRALAB AVI 选项将视频上传到软件中。单击 AVI 文件选项的量化。要创建新的协议，请选择参数、协议参数和时间，并将实验持续时间设置为一分钟。根据所需的数据输出选择"无时间"和"未选择集成"期间，并选择"文件"并打开"电影"以上传每个以前录制的视频文件。要构建单个检测区域，请使用圆圈工具创建蠕虫所在的整个液体滴周围的区域。将检测到选定区域内所有蠕虫的活动。要指示校准距离，请从视频区域的左侧到右侧绘制一条水平线，并选择校准、绘制和应用到组。为了分析所有不同的 C.elegans 蠕虫菌株的检测，请取消选择区域图标并调整活动阈值中的检测灵敏度。要在活动分析进行期间可视化动物制作的轨道，请将显示刻度设置为 70，并选择"应用到组"。要分析视频，请单击"播放"并选择"实验"，然后执行以输入视频的文件名称。保存后，会出现一个窗口，询问是否以最大计算机速度分析视频。单击"是"。运行中的实验窗口将打开。单击"开始"。当记录分析完成后，单击"实验"并停止以保存电子表格中滴中分析的活动。要分析96井板格式液体介质中的C.elegans介质活性，当蠕虫到达L4阶段时，在每卷大肠杆菌OP50和S.basal介质中加入50微升，每孔油井的净96井平底微板。使用立体显微镜手动挑选每口96井板的15个同步蠕虫，让蠕虫适应20分钟。在适应期结束时，使用标准平板扫描仪在扫描之间用不到 10 秒的时间扫描每个微板两次分析扫描，使用开源软件对齐两个连续扫描，并获取两个图像和相对蠕虫扫描分数之间的像素变化数据，根据扫描仪设置为像素时产生的光强度确定显微板响应的变化阈值为五。在分析C.elegans运动体活性在一滴液体介质中，线粒体复合I病蠕虫在L4阶段的体活动显著减少38%，与野生型蠕虫相比。同样，对相同种群的蠕虫扫描分析显示，与N2布里斯托尔野生型蠕虫相比，L4阶段疾病模型蠕虫的蠕虫活动显著减少。这种机车活动损失也观察到在成人第一阶段线粒体复合I病蠕虫评估蠕虫扫描分析。在设置每个检测时，必须记住使用正确的蠕虫数量。按照这个程序，我们的实验室经常进行药物筛选。这两种技术用于我们的实验室，用于评估感兴趣的药物对线粒体疾病临床前动物模型中蠕虫活动的影响。

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