Name: comparative analysis of experimental methods to quantify animal activity in caenorhabditis elegans models of mitochondrial disease
Uploaded: 2021-04-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease at JoVE.com

Wir danken Anthony Rosner, PhD., mit seiner organisatorischen Unterstützung für die frühe Vorbereitung dieses Projekts und Erin Haus für ihren Beitrag zur Protokollanalyse. Diese Arbeit wurde vom Juliet's Cure FBXL4 Mitochondrial Disease Research Fund, dem Jaxson Flynt C12ORF65 Research Fund und den National Institutes of Health (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 und T32-NS007413) finanziert. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der Geldgeber oder der National Institutes of Health dar.

1. Analyse der Wurmlokomotoraktivität in flüssigen Medien auf Glasobjektträgern mit der ZebraLab-Software
<ol><li>Nematodenwachstum und -handhabung<ol>
<li>Züchte C. elegans auf Petriplatten, die Nematodenwachstumsmedien (NGM) enthalten, und verteilen Sie sie mit Escherichia coli OP50 als Nahrungsquelle. Halten Sie die Wurmkultur bei 20 °C, wie zuvor beschrieben8.</li>
		<li>Synchronisieren Sie Würmer, die eine zeitisierte Eilage52 durchführen, un...

Hier fasste die Studie detaillierte Informationen und Begründungen für die Untersuchung der neuromuskulären Aktivität von C. elegans auf der Ebene verschiedener Endpunkte zusammen, einschließlich Wurmschlagen, Fortbewegung, Pharynxpumpen und Chemotaxis. Der Vergleich von 16 verschiedenen Aktivitätsanalysemethoden wurde in Bezug auf den relativen Durchsatz, die Vorteile und die Grenzen der Quantifizierung von Nematodenaktivitäten in einer einzelnen Wurm- oder Wurmpopulation in unterschiedlichem Alter und e...

Caenorhabiditis elegans ist weithin als herausragendes Modell in den Neurowissenschaften anerkannt, basierend auf 302 Neuronen, die alle Wurmverhaltensweisen koordinieren, einschließlich Paarung, Fütterung, Eiablage, Defäkation, Schwimmen und Fortbewegung auf festen Medien1. Diese hermaphroditischen Nematoden werden auch häufig verwendet, um eine breite Palette von menschlichen Krankheitsmechanismen zu verstehen, die durch ihr gut charakterisiertes Genom und ihre hohe Homologie von ~ 80% Genen zwischen C. elegans und Menschen ermöglicht werden2,3,4. C. elegans wird seit langem verwendet, um die menschliche mitochondriale Krankheit5,6, 7,8,9,10zuuntersuchen, die eine hochgradig genetisch und phänotypisch heterogene Gruppe von erblichen Stoffwechselstörungen ist, die eine beeinträchtigte Fähigkeit zur Erzeugung von Zellenergie teilen und oft klinisch mit erheblich beeinträchtigter neuromuskulärer Funktion, Belastungsintoleranz und Müdigkeit vorliegen11 ,12,13,14. Zu diesem Zweck ermöglicht die Verwendung von C. elegans-Modellen die präklinische Modellierung quantitativer Aspekte der tierischen Aktivität und der neuromuskulären Funktion in verschiedenen genetischen Subtypen mitochondrialer Erkrankungen sowie deren Reaktion auf Therapiekandidaten, die ihre neuromuskuläre Funktion und Gesamtaktivität verbessern können.
Die neuromuskuläre Aktivität bei C. elegans ist objektiv messbar durch eine Reihe experimenteller Methoden, einschließlich manueller und halbautomatischer Ansätze, die funktionelle Analysen in festen oder flüssigen Medien ermöglichen (Tabelle 1)1,15. Die genaue Quantifizierung der Aktivität von C. elegans hat sich als wichtig erwiesen, um Entdeckungen im Zusammenhang mit der Funktion und Entwicklung des Muskel- und Nervensystems zu ermöglichen16,17,18. Diese Studie fasst die experimentellen Anforderungen, Vorteile und Einschränkungen von 17 verschiedenen Assays zusammen und vergleicht sie, die in Forschungslabors durchgeführt werden können, um die neuromuskuläre Funktion und Aktivität an vier Schlüsselergebnissen in C. elegans-Krankheitsmodellen zu bewerten, sowohl zu Studienbeginn in einer Reihe von Entwicklungsstadien und Im alter als auch als Reaktion auf Kandidatentherapien (Tabelle 1 ). In der Tat bietet die Studie einen detaillierten Überblick über die Palette der verfügbaren experimentellen Ansätze zur Charakterisierung der Raten von C. elegans Thrashing (Körperbiegungen pro Minute), Bewegungsaktivität, Pharynxpumpen und Chemotaxis - jeweils unter Angabe der verwendeten experimentellen und analytischen Methodik, der Vorteile und Grenzen jeder Methode, der Ausrüstung und Software, die für die Durchführung und Analyse jedes Assays erforderlich sind. und die Durchsatzkapazität jeder Methode, um ihre Verwendung für genetische Hochdurchsatz- oder Arzneimittelscreening-Zwecke zu unterstützen. Die Durchsatzkapazität jedes Assays wird basierend auf der Komplexität des experimentellen Protokolls als niedrig, mittel oder hoch beschrieben, einschließlich der Wurmwartung, der Verarbeitungszeit, der Verwendung von Einzel- oder Mehrplatzplatten und/oder der Experimentatorzeit, die für die Fertigstellung der experimentellen Einstellung und der Datenanalysen erforderlich ist.
Manuelle Analysen von Thrashing19, Bewegungsaktivität20, Pharynxpumpen17,21und Chemotaxis22,23 sind etablierte Methoden zur Bewertung der Wurmaktivität, die ein Stereomikroskop erfordern24. Während die Messung der Schlagaktivität von Würmern eine Analyse in flüssigen Medien erfordert, um die Häufigkeit von Körperbiegungen pro Minute zu bestimmen, kann die Wurmlokomotoraktivität entweder auf festen Medien oder in flüssigen Medien gemessen werden. Manuelle Analysen der individuellen Wurmaktivität sind jedoch von Natur aus zeitaufwendig und beinhalten unvermeidliche benutzergenerierte Verzerrungen. Die Automatisierung von Wurmaktivitätsanalysen minimiert benutzergenerierte Verzerrungen und kann den experimentellen Durchsatz erheblich erhöhen25. Videoaufnahmen von Wurm-Thrashing-Aktivitäten in flüssigen Medien können mit wrMTrck, einem ImageJ-Plugin26,analysiert werden. Die ursprünglichen experimentellen Einstellungen, die für wrMTrck entwickelt wurden, schränkten jedoch seinen Nutzen ein, da zu viele Würmer in einem einzigen Flüssigkeitstropfen zu überlappenden Würmern führten, die eine genaue Verfolgung erschwerten. Während diese experimentelle Einschränkung aufgelöst wurde27,ist die wrMTrck-Methode nicht in der Lage, hochdurchsatziges Screening zu unterstützen.
Es gibt eine Reihe von Methoden zur Quantifizierung der Aktivität des Wurmlokomotors zu Studienbeginn und als Reaktion auf Mögliche Therapien in modellen der mitochondrialen Erkrankungen von C. elegans. Dazu gehören ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker28, Wide Field-of-View Nematode Tracking Platform (WF-NTP)29, WormMotel, WormWatcher30, WormLab31, Infinity Chip32und WMicrotracker One33 (Tabelle 1). Diese Methoden ermöglichen die gleichzeitige Analyse der Fortbewegung in mehreren Wurmstämmen oder -bedingungen, typischerweise auf Multi-Well-Platten, wodurch Arzneimittel-Screening-Anwendungen mit höherem Durchsatz unterstützt werden. Einige dieser Methoden haben einzigartige Überlegungen, die ihren allgemeinen Nutzen einschränken oder verbessern können, z. B. die Notwendigkeit teurer Geräte im Vergleich zu Open-Access-Software und die unterschiedliche Leichtigkeit der Durchführung experimenteller Protokolle. Insgesamt ist kein einzelnes experimentelles System oder Protokoll ideal für alle C. elegans Bewegungsaktivitätsexperimente geeignet. Vielmehr ist es wichtig, sorgfältig auszuwählen, welche Methode für die experimentellen Ziele und Anforderungen des jeweiligen Prüfers am besten geeignet ist.
Das Pharynxpumpen stellt ein weiteres wichtiges Ergebnis zur Beurteilung der neuromuskulären Aktivität bei C. elegansdar. Der C. elegans pharynx besteht aus 20 Muskelzellen, 20 Neuronen und 20 weiteren Zellen, die die Einnahme von Escherichia coli (E. coli) am vorderen Ende des Verdauungstraktes des Wurms ermöglichen34,35,36. Es wurden mehrere manuelle Methoden zur Bestimmung der Pharynxpumpraten17,21,37,38etabliert. Die meisten Methoden basieren auf der Verwendung eines Stereomikroskops und einer Kamera zur Visualisierung und Aufzeichnung der pharyngealen Pumpfrequenz mit direkter Zählung durch den experimentellen Beobachter21. Eine automatisierte Pharynxpumpenratenanalyse ist durch die Durchführung einer extrazellulären Aufzeichnung des so bezeichneten Elektropharyngeogramms (EPG) möglich, die zusätzliche Informationen über die Dauer jederPumpe liefert 39. Die Analyse der Pharynxpumprate ist auch in einem mikrofluidischen System, WormSpa, möglich, bei dem einzelne Würmer in den Kammern40,41eingeschlossen sind. Eine kommerzielle Methode, um die Analyse der Pharynxpumpenrate zu erleichtern, ist das ScreenChip System (InVivo Biosystems), das die neuromuskulären Aspekte des Fütterungsverhaltens in einem einzelnen Wurm misst, visualisiert und analysiert, der in einem benutzerdefinierten Chip immobilisiert wird. Dieser Pharynxpumpen-Quantifizierungsansatz kann verwendet werden, um sowohl neuronale als auch physiologische Reaktionen auf Medikamente, Alterung und andere Faktoren zu bewerten42,43,44,45.
Chemotaxis beschreibt die Bewegung von C. elegans als Reaktion auf ein Geruchsmittel, das von den Würmern in einem definierten Bereich der Nematodenwachstumsmedienplatte (NGM) entfernt ist. Die Beurteilung der Chemotaxis-Reaktion liefert ein integriertes Maß für die neuronale und neuromuskuläre Aktivität von Würmern, das quantifizierbar ist, indem die physische Entfernung, die Würmer in einem definierten Zeitraum zum Geruchsstoff zurücklegen, beobachtet und gemessen wird46. Der Multi-Worm Tracker ist eine automatische Methode, mit der die experimentelle Effizienz der Quantifizierung der von Würmern zurückgelegten Entfernung zu einem Lockstoff oder von einem Abwehrmittel verbessert werden kann47.
Hier wird das detaillierte Protokoll für zwei neuartige, halbautomatische Methoden zur Quantifizierung der Wurmaktivität beschrieben. Der erste Ansatz verwendet ZebraLab, eine kommerzielle Software, die ursprünglich entwickelt wurde, um die Schwimmaktivität von Danio rerio (Zebrafisch) für eine neuartige Anwendung mit mittlerem Durchsatz zu untersuchen, um die Gesamtaktivität des Bewegungsapparates in flüssigen Medien von C. elegans basierend auf Pixeländerungen während der Bewegung zu quantifizieren (Tabelle 1, Abbildung 1). Die Datenausgabe wird schnell aus einer großen Anzahl von gleichzeitigen Bedingungen und Proben gewonnen, die auf einem Glasobjektträger analysiert werden, obwohl diese Methode nicht für ein Multi-Well-Plattenformat geeignet ist. Der zweite Ansatz ist eine neuartige Adaption der WormScan-Methodik48,49 ( Abbildung2), die einen Flachbettscanner verwendet, um ein differenzielles Bild von zwei sequenziellen Scans zu erstellen, die variabel mit Open-Source-Software verwendet werden können, um eine halbautomatische quantitative Analyse integrierter physiologischer Ergebnisse wie Fruchtbarkeit und Überleben zu ermöglichen. Hier wurde eine neuartige Hochdurchsatzadaption der WormScan-Methodik zur Quantifizierung der Wurmlokomotoraktivität in flüssigen Medien in Populationen von fünfzehn Larven-Würmern im Stadium 4 (L4) pro Vertiefung einer 96-Well-Flachbodenplatte entwickelt. Diese halbautomatische und kostengünstige WormScan-Methodik kann leicht an Hochdurchsatz-Arzneimittel-Screens sowie an Analysen verschiedener Tierstadien und im Alter von48,49Jahren angepasst werden.
Hier wird das Protokoll und die Wirksamkeit der Analyse der Bewegungsaktivität von C. elegans mit halbautomatischen Methoden zebraLab und WormScan in einem gut etablierten C. elegans-Modell für die mitochondriale Komplex-I-Krankheit, Gas-1(fc21) demonstriert. Gas-1 (K09A9.5-Gen) ist ein Ortholog des humanen NDUFS2 (NADH: Ubichinonoxidoreduktase-Kern (Eisen-Schwefel-Protein) Untereinheit 2) (Abbildung 3). Der mutierte C. elegans Gas-1(fc21) -Mutantenstamm trägt eine homozygote p.R290K-Missense-Mutation im menschlichen Ortholog von NDUFS250, was zu einer signifikant verminderten Fruchtbarkeit und Lebensdauer, einer beeinträchtigten oxidativen Phosphorylierungskapazität der Atmungskette (OXPHOS)51sowie einer verminderten mitochondrialen Masse und Membranpotenzial mit erhöhtem oxidativem Stress führt5,8 . Trotz seiner in den letzten zwei Jahrzehnten gut etablierten Verwendung zur Untersuchung mitochondrialer Erkrankungen wurde die motorische Aktivität von Gas-1 (fc21) -Mutanten bisher nicht berichtet. Hier wurden ZebraLab- und WormScan-Methoden eingesetzt, um die Bewegungsaktivität von Gas-1(fc21) im Vergleich zu Wildtyp-Würmern (WT, N2 Bristol) unabhängig zu quantifizieren, sowohl um die Methoden zu validieren als auch um ihren vergleichenden Nutzen und ihre Effizienz der experimentellen Protokolle und Informatikanalysen zu demonstrieren. Die ZebraLab-Software ermöglichte die schnelle Quantifizierung mehrerer gleichzeitiger Zustände der Wurmlokomotoraktivität in modellen der mitochondrialen Erkrankung von C. elegans mit potenzieller Anwendung für gezielte Arzneimittelscreening- oder Validierungsstudien. Insbesondere die WormScan-Analyse ist gut geeignet, um Schnelldurchsatz-Wirkstoff-Screens von Wirkstoffbibliotheken zu ermöglichen und Leads zu priorisieren, die die neuromuskuläre Funktion des Tieres und die Bewegungsaktivität in präklinischen C. elegans-Modellen primärer mitochondrialer Erkrankungen verbessern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C. elegans wild isolate</td>
			<td>&#160;Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2 Bristol</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gas-1(fc-21)</td>
			<td>CGC</td>
			<td>CW152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4951PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium (NGM)</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>N81800-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Uracil auxotroph E. coli strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm)</td>
			<td>&#160;VWR international</td>
			<td>25373-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. Basal</td>
			<td>VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O</td>
			<td>VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>EPSON</td>
			<td>V800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10 microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat bottom</td>
			<td>&#160;VWR international</td>
			<td>29442-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WormScan software</td>
			<td>Mathew et al. 45</td>
			<td>S1 Standalone Java platform</td>
			<td>Software for automation of difference image of scanned plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZebraLab software</td>
			<td>ViewPoint</td>
			<td></td>
			<td>Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparative analysis of experimental methods to quantify animal activity in caenorhabditis elegans models of mitochondrial disease

Caenorhabditis elegans ist weithin bekannt für seinen zentralen Nutzen als translationales Tiermodell zur effizienten Befragung von Mechanismen und Therapien verschiedener menschlicher Krankheiten. Würmer eignen sich besonders gut für genetische und Arzneimittel-Screens mit hohem Durchsatz, um tiefere Einblicke in therapeutische Ziele und Therapien zu erhalten, indem sie ihren schnellen Entwicklungszyklus, ihre große Brutgröße, ihre kurze Lebensdauer, ihre mikroskopische Transparenz, niedrige Wartungskosten, eine robuste Suite genomischer Werkzeuge, Mutantenlager und experimentelle Methoden zur Abfrage der In-vivo- und Ex-vivo-Physiologie nutzen. Die Aktivität des Wurmlokomotors stellt einen besonders relevanten Phänotyp dar, der häufig bei mitochondrialen Erkrankungen beeinträchtigt ist, die in Ursachen und Manifestationen sehr heterogen sind, aber gemeinsam eine beeinträchtigte Fähigkeit zur Produktion von Zellenergie aufweisen. Während eine Reihe verschiedener Methoden verwendet werden kann, um das Verhalten von Würmern zu untersuchen, unterscheiden sich diese stark in experimentellen Kosten, Komplexität und Nutzen für genomische oder medikamentöse Hochdurchsatz-Screens. Hier wurden der relative Durchsatz, die Vorteile und Einschränkungen von 16 verschiedenen Aktivitätsanalysemethoden verglichen, die die Fortbewegung von Nematoden, das Thrashing, das Pharynxpumpen und / oder die Chemotaxis in einzelnen Würmern oder Wurmpopulationen von C. elegans in verschiedenen Stadien, Altersgruppen und experimentellen Dauern quantifizieren. Detaillierte Protokolle wurden für zwei halbautomatische Methoden zur Quantifizierung der Nematoden-Bewegungsaktivität demonstriert, die neuartige Anwendungen verfügbarer Software-Tools darstellen, nämlich ZebraLab (ein Mitteldurchsatzansatz) und WormScan (ein Hochdurchsatzansatz). Daten aus der Anwendung dieser Methoden zeigten ähnliche Grade reduzierter Tieraktivität im L4-Larvenstadium und fortgeschritten bei Erwachsenen des Tag 1, bei mitochondrialenKomplex-I-Krankheit ( Gas-1(fc21)) mutierten Würmern relativ zu Wildtyp (N2 Bristol) C. elegans. Diese Daten bestätigen den Nutzen für diese neuartigen Anwendungen der Verwendung der Softwaretools ZebraLab oder WormScan zur effizienten und objektiven Quantifizierung der Wurmlokomotoraktivität mit variabler Kapazität zur Unterstützung eines Hochdurchsatz-Arzneimittelscreenings auf Wurmverhalten in präklinischen Tiermodellen für mitochondriale Erkrankungen.

Die Analyse der Bewegungsaktivität von C. elegans in den flüssigen Medien könnte leicht einen integrierten Phänotyp von mitochondrialen Krankheitswurmmodellen erfassen, die auf festen Medien möglicherweise nicht leicht quantifizierbar sind. ZebraLab wurde verwendet, um die motorische Aktivität des gut etablierten mitochondrialen Komplexes I Krankheit Gas-1(fc21) Stamm relativ zu WT-Würmern in flüssigen Medien im L4-Larvenstadium zu quantifizieren. Die Aktivität von 5 Würmern in einem ...

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Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Diese Studie präsentiert Protokolle für zwei halbautomatische Ansätze zur Analyse der Bewegungsaktivität in C. elegans Komplex I Krankheit Gas-1(fc21) Würmer, nämlich ZebraLab (ein Mitteldurchsatz-Assay) und WormScan (ein Hochdurchsatz-Assay) und bieten vergleichende Analysen unter einer Vielzahl von Forschungsmethoden zur Quantifizierung des Nematodenverhaltens und der integrierten neuromuskulären Funktion.

Vergleichende Analyse experimenteller Methoden zur Quantifizierung der Tieraktivität bei Caenorhabditis elegans Modellen der mitochondrialen Erkrankung

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

Dieses Protokoll verwendet zwei verschiedene halbautomatische Assays, um die Bewegungsaktivität von C.elegans in flüssigem Medium schnell zu quantifizieren, und hat das Potenzial, für das Arzneimittelscreening in C.elegans-Krankheitsmodellen angewendet zu werden. Die Hauptvorteile dieser beiden Techniken sind ihre Benutzerfreundlichkeit und reproduzierbarkeit. Beide Techniken haben das Potenzial, die Auswirkungen von Medikamenten auf das Wurmverhalten mit variablem Durchsatz zu bewerten.Diese Motilitätstests sind nützlich, um die Bewegungsaktivität von C.elegans mitochondrialen Krankheitsmodellen zu bewerten, bei denen das neuromuskuläre System der Tiere beeinträchtigt ist. Um die Aktivität von C.elegans lokomotorischem Medium in flüssigem Medium auf Glasobjektträgern nach der Synchronisierung der Kontrolle in mutierten Wurmstämmen auf NGM-Platten mit und ohne medikamentöse Behandlungen, die für das L4-Stadium von Interesse sind, zu analysieren, verwenden Sie einen Wurmpickel und ein Stereomikroskop, um fünf Würmer pro Stamm und Zustand in einzelne 20 Mikrolitertropfen S.basal-Lösung auf einem Glasobjektträger zu picken. Fügen Sie Würmer aus demselben experimentellen Zustand von verschiedenen NGM-Platten zu mehreren Tröpfchen auf demselben Objektträger hinzu, um mehrere technische Replikate zu erhalten.Wenn alle Würmer gesammelt wurden, lassen Sie die Tiere eine Minute lang bei Raumtemperatur auf der Rutsche akklimatisieren, bevor Sie die Schwimmaktivität der Würmer in jedem Tropfen für eine Minute mit 15 Bildern pro Sekunde pro Tropfen aufzeichnen. Um die aufgezeichnete C.elegans-Bewegungsaktivität mit der ZebraLab-Software zu analysieren, verwenden Sie die ZEBRALAB AVI-Option, um Videos in die Software hochzuladen. Klicken Sie auf die Option Quantisierung mit AVI-Dateien.Um ein neues Protokoll zu erstellen, wählen Sie Parameter, Protokollparameter und Zeit aus, und legen Sie die Testdauer auf eine Minute fest. Wählen Sie No Time Bin und deaktivieren Sie Integrationszeitraum entsprechend der gewünschten Datenausgabe und wählen Sie Datei und Film öffnen, um jede einzelne zuvor aufgenommene Videodatei hochzuladen. Um einen einzelnen Erkennungsbereich zu erstellen, verwenden Sie das Kreiswerkzeug, um einen Bereich um den gesamten Flüssigkeitstropfen zu erstellen, in dem sich die Würmer befinden.Die Aktivität aller Würmer innerhalb des ausgewählten Bereichs wird erkannt. Um den zu kalibrierenden Abstand anzugeben, zeichnen Sie eine horizontale Linie von links nach rechts neben dem Videobereich und wählen Sie Kalibrierung, Zeichnen und Auf Gruppe anwenden aus. Damit die Erkennung aller verschiedenen C.elegans-Wurmstämme analysiert werden kann, deaktivieren Sie das Flächensymbol und passen Sie die Erkennungsempfindlichkeit im Aktivitätsschwellenwert an.Um die Spuren der Tiere während der Aktivitätsanalyse zu visualisieren, legen Sie die Anzeigeskala auf 70 fest und wählen Sie Auf Gruppe anwenden aus. Um die Videos zu analysieren, klicken Sie auf Wiedergabe, wählen Sie Experimentieren und Ausführen aus, um einen Dateinamen für das Video einzugeben. Nach dem Speichern erscheint ein Fenster, in dem Sie gefragt werden, ob das Video mit der maximalen Computergeschwindigkeit analysiert werden soll.Klicken Sie auf Ja. Das fenster für das laufende Experiment wird geöffnet. Klicken Sie auf Start.Wenn die Aufzeichnungsanalyse abgeschlossen ist, klicken Sie auf Experimentieren und beenden, um die im Droplet analysierte Aktivität in einer Tabelle zu speichern. Um die Aktivität von C.elegans Lokomotor in flüssigem Medium in einem 96-Well-Plattenformat zu analysieren, wenn die Würmer das L4-Stadium erreicht haben, fügen Sie 50 Mikroliter mit 2% Gewicht pro Volumen von E.coli OP50 und S.basal Medium zu jeder Vertiefung einer klaren 96-Well-Flachboden-Mikroplatte hinzu. Verwenden Sie das Stereomikroskop, um manuell 15 synchronisierte Würmer pro Vertiefung der 96-Well-Platte auszuwählen und die Würmer 20 Minuten lang akklimatisieren zu lassen.Verwenden Sie am Ende der Akklimatisierungsphase einen Standard-Flachbettscanner, um jede Mikroplatte zweimal mit weniger als 10 Sekunden zwischen den Scans zu scannen Um die Scans zu analysieren, verwenden Sie Open-Source-Software, um die beiden sequenziellen Scans auszurichten und die Pixeländerungsdaten zwischen den beiden Bildern und den relativen Wurm-Scan-Score zu erfassen, um die Änderungen der Lokomotorreaktion basierend auf der vom Scanner erzeugten Lichtintensität zu bestimmen, wenn sie auf ein Pixel eingestellt ist Schwellenwert von fünf. In dieser Analyse der Bewegungsaktivität von C.elegans in einem einzigen Tropfen flüssigen Mediums zeigten die Würmer der mitochondrialen Komplex-I-Krankheit eine signifikante Abnahme ihrer Bewegungsaktivität im L4-Stadium um 38% im Vergleich zu Wildtypwürmern. In ähnlicher Weise zeigte die Analyse der gleichen Populationen eine signifikante Verringerung der Bewegungsaktivität für die Krankheitsmodellwürmer im L4-Stadium im Vergleich zu N2-Bristol-Wildtypwürmern.Dieser Verlust der Bewegungsaktivität wurde auch bei Würmern der mitochondrialen Komplex-I-Krankheit im ersten Stadium bei Erwachsenen beobachtet, die durch Wurmscan-Analyse beurteilt wurden. Es ist wichtig, bei der Einrichtung jedes Assays daran zu denken, die richtige Anzahl von Würmern zu verwenden. Nach diesem Verfahren führt unser Labor häufig ein Drogenscreening durch.Diese beiden Techniken werden in unserem Labor verwendet, um die Auswirkungen von Medikamenten von Interesse auf die Wurmaktivität in präklinischen Tiermodellen von mitochondrialen Erkrankungen zu bewerten.

Research

JoVE Journal

Behavior

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

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Beurteilung der Sensomotorik in Maus-Modellen der Parkinson-Krankheit

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Forschung

Verhalten

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