Name: a time-efficient fluorescence spectroscopy-based assay for evaluating actin polymerization status in rodent and human brain tissues
Uploaded: 2021-06-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues at JoVE.com

这项工作得到了新西兰神经学基金会（1835-PG）、新西兰健康研究理事会（#16-597）和新西兰奥塔哥大学解剖学系的支持。我们感谢HCB-IDIBAPS生物库（西班牙）的神经组织库用于人体脑组织。我们感谢张嘉贤在录制和编辑视频方面所做的帮助。

所有实验程序均按照奥塔哥大学保护和使用实验室动物道德委员会的规定进行（道德议定书第1号）AUP95/18 和 AUP80/17）和新西兰立法机构。人脑组织是从西班牙巴塞罗那的Clénic-IDIBAPS生物库的神经组织库获得的。所有组织收集协议均得到巴塞罗那克莱尼奇医院道德委员会的批准，并征得家属的知情同意。
1. 准备缓冲器和试剂
<ol><li>为脑组织的同质化和合成终端的丰富部分的?...

这里描述的检测，基本上改编自先前的研究30与修改，采用了一种法洛托辛，法洛丁标签与荧光标签。荧光法洛丁类比被认为是固定组织47、48、49染色蛋白丝的黄金标准。事实上，它们是专门识别行为细丝50的最古老的工具，并且仍然是检测行为细丝的最广泛使用的工具，特别是用于随后的?...

细胞骨质蛋白作用素涉及多种细胞功能，包括结构支持、细胞传输、细胞动力和分裂。Actin 以两种形式以均衡形式发生：单体球状作用素 （G-actin） 和聚合丝作用素 （F-actin）。actin的聚合状态（其G-和F-形式之间的互通）的快速变化导致快速的丝组装和拆卸，并成为其细胞生理学调控作用的基础。Actin是神经元细胞骨结构的主要组成部分，影响广泛的神经元功能1，2。值得注意的是，细胞球菌的作用是突触终端结构平台的组成部分。因此，它是突触形态形成和生理学的主要决定因素，在控制突触3、4、5的大小、数量和形态方面起着基础性作用。特别是，动态作用聚合-去聚合是与记忆和学习过程背后的突触可塑性相关的突触重塑的关键决定因素。事实上，前突性（如神经递质释放6，7，8，9，10）和后突体功能（可塑性相关的动态改造11，12，13，14）都严重依赖于在细胞细胞细胞顿的聚合状态的动态变化。
在生理条件下，F-actin水平通过多式联运途径进行动态和严格调节，包括后翻译修饰4、15、16以及活性结合蛋白（ABPs）4、17。ABP 可以影响多个级别的活性动力学（如启动或抑制聚合、诱导丝分枝、将细丝分离到较小的碎片、促进去聚合和防止脱聚），并依次在对各种细胞外信号敏感的严格调制控制下18、19、20。这种多层次的监管检查要求对突触细胞细胞细胞的活性动力学进行严格监管，在基础和活动诱发状态下对神经元生理学的前期和后突触方面进行微调。
鉴于行为素在神经元生理学中的重要作用，一些研究提供了证据，证明行为动力学的改变与各种神经系统疾病有关，包括神经退化、心理疾病以及神经发育疾病3、21、22、23、24、25、26、27等。然而，尽管大量的研究数据表明作用在神经元生理学和病理生理学中的关键作用，但在对行为动力学的理解上，特别是在突触细胞细胞细胞学方面，仍然存在着重大差距。需要更多的研究来更好地了解神经元作用及其在病理条件下的改变。在这方面，一个主要的重点领域是评估作用物聚合状态。有西方印迹为基础的商业套件（G-Actin/F-Actin在体内测定生化套件;赛托斯凯尔顿SKO BK03728，29）和自制的检测评估F-actin水平6。然而，由于这些需要F-actin和G-actin的生化分离，并且由于它们随后的定量基于免疫凝固协议，因此它们可能非常耗时。我们这里报告一个荧光光谱为基础的检测，改编自先前的研究30与修改，可用于评估F-actin的基础水平，以及其组装拆解的动态变化。值得注意的是，我们已经有效地修改了原来的协议，要求样品适合1 mL的cuvette到目前的96井板格式。因此，修改后的方案显著减少了检测所需的组织/样本量。此外，我们提供证据表明，该协议不仅适用于脑组织同质化，还适用于细胞下部分，如分离突触终端（突触体和突触体）。最后，该检测可用于刚解剖的啮齿动物脑组织和长期储存的死后人类大脑样本。值得注意的是，虽然测定是在神经元环境中呈现的，但它可以适当地扩展到与之相关的其他细胞类型和生理过程。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>349622</td>
			<td>For gradient centrifugation (synaptosome prep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td>F-actin specific ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against &#160;b-actin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-47778</td>
			<td>For evaluation of total actin levels by immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab181602</td>
			<td>For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Bradford based protein estimation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td>Krebs buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>For light-scattering measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Krebs buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>Solvent for phalloidin and latrunculin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner)</td>
			<td>Li-Cor Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>For detection of immunoreactive signals on immunoblots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6257</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latrunculin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5163</td>
			<td>Depolymerizer of actin filaments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Krebs buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitex membrane filter 5 mm</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>LSWP01300</td>
			<td>Preparation of synaptoneurosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc F96 MicroWell Black Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>237105</td>
			<td>For fluorometric measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter 100 mm</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NY1H02500</td>
			<td>Preparation of synaptoneurosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail IV</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab201115</td>
			<td>For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>Krebs buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride (NaBH4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71320</td>
			<td>Component of Permeabilization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>LabServ (Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>BSPSL944</td>
			<td>Krebs buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>LabServ (Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>BSPSL900</td>
			<td>Krebs buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>For fluorometric measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/8600/60</td>
			<td>Buffer ingredient for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swimnex Filter Holder</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Sx0001300</td>
			<td>Preparation of synaptoneurosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>358034</td>
			<td>For tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Component of Permeabilization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Buffer ingredient for sample preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a time-efficient fluorescence spectroscopy-based assay for evaluating actin polymerization status in rodent and human brain tissues

Actin 是细胞骨骼的主要成分，在维持神经元结构和功能方面起着至关重要的作用。在生理状态下，行为素以两种形式以平衡形式发生：单体球状（G-actin）和聚合丝（F-actin）。在突触终端，作用细胞细胞细胞形成关键突触前和突触后功能的基础。此外，作用素聚合状态的动态变化（球状和细丝形式的作用之间的转换）与突触结构和功能的可塑性相关变化密切相关。我们在这里报告一种基于荧光的修改方法，以评估 前体内 环境中作用素的聚合状态。该检测采用荧光标签的法洛丁，一种法洛托辛，专门结合到作用丝（F-actin），提供聚合丝活性蛋白的直接测量。作为原则的证明，我们为在啮齿动物和死后人类脑组织同质化中进行检测的适用性提供了证据。使用拉特伦库林A（一种使肌细丝脱聚的药物），我们确认该检测在监测F-actin水平变化方面的作用。此外，我们扩展检测到分离突触终端的生化部分，其中我们确认通过高细胞外 K+去极化刺激刺激时增加作用素聚合。

F-actin 水平评估的检测的线性 首先，确定了亚历克萨荧光647法洛丁荧光线性增加的标准曲线，并重复了每组实验（图1）。为了调查检测的线性范围，处理了不同数量的大脑同质性，从啮齿动物（图2A和2B）和死后人类受试者（图3A和3B）。检测结果发现，该检测在50-200微克蛋白质范围内是线性的，通?...

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A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

我们报告了一种简单、省时和高通量荧光光谱分析，用于从啮齿动物和人类受试者脑组织 中对 活体细丝进行定量。

用于评估啮齿动物和人类脑组织中行为素聚合状态的基于时间的荧光光谱分析

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Actin 是细胞骨骼的主要成分，对细胞形态和生理学的几个方面（包括神经元）进行了批判性调节。Actin 发生在其两种形式之间的平衡中，单体球状 G-actin 或聚合细丝 F-actin。作用素的聚合状态通过作用结合蛋白以及自身的转化后调节在多个层面受到严格监管。在内在突触中，F-actin 水平的动态变化是一个关键的调节事件，可控制突触前和后终端的信号和可塑性。毫不奇怪，行为功能障碍与几个神经病理状态有关。最近的进步已经导致在神经元生理学和病理生理学方面拥有丰富的行为素知识。然而，许多仍不得而知，需要关注。在这方面，法洛丁的荧光类比已被证明是在行为研究的主要工具。这种咽毒素特别与丝状活性结合，因此可以直接测量F-actin的数量及其在病理生理状态下的变化。这项研究提出了一个快速和高效的氟测定测试，用于评估前活体生物样本中的活性聚合状态，如从脑组织批发同质化和生化分离的突触终端。值得注意的是，该检测可以应用于其他细胞和组织类型及其相关的生理现象。有关本研究中使用的缓冲器的配方，请参阅详细文本。来自大鼠或人类受试者的脑组织样本在波特-埃尔韦杰姆玻璃管中均质化，并在10卷同质化缓冲器中在冰上缠缠。对于突触体准备，同质性首先以慢速旋转，然后以更高的速度旋转，以获得粗突触体线粒体分数。从这个粗分数中获得丰富的突触体是在不连续的蔗糖梯度后获得的。对于突触生成制备，同质物通过两个100微米和一个5微米过滤器连续传递。使用布拉德福德试剂进行蛋白质估计，在 Krebs 缓冲区稀释样品，最终体积为 50 微升，每毫升蛋白质浓度为 2 到 3 毫克。通过在37度时将细胞外钾短暂增加30秒，对分离的突触终端（突触体或突触体）进行刺激。为此，在样品中加入一个氯化摩尔钾，最终浓度为15毫升。同源物是未刺激的，去极化突触片段固定在2.5%的谷胱甘肽，通过添加所需的体积25%谷氨酸含量溶液。样品在室温下孵育了两三分钟。固定性通过离心在20，000G中取出5分钟。然后，这些样品在克雷布斯缓冲区通过悬念进行渗透，该缓冲器含有0.1%的Triton X-100和1毫克每mL氢化钠，在室温下两到三分钟。通过离心再次去除渗透缓冲，颗粒表面上用克雷布斯缓冲器清洗，并重新用含有 1X Alexa Fluor 647 phalloidin 的 Krebs 缓冲器，相当于 500 微单位的法洛丁。在黑暗的室温下，绑定允许进行10分钟。多余的未绑定法洛丁通过离心在2万G中取出5分钟，颗粒表面上用克雷布斯缓冲器清洗，并再次在含有0.32摩尔蔗糖的克雷布斯缓冲器中再补充，以保持突触体或突触体的浮力。荧光法洛丁绑定样品被分配在一个96井黑色板的荧光读数在板阅读器。兴奋和发射波长分别设定为645纳米和670纳米。对于每组实验，我们包括不同数量的亚历克萨氟647巴洛丁在克雷布斯缓冲区含有0.32摩尔蔗糖。为了说明洗涤过程中样品的任何损失，样品从黑色转移到透明的 96 井板。然后在440纳米时对采集样本进行检查。荧光球蛋白的保留与样品中行为素细丝或F-actin水平的含量成正比。在50至200微克蛋白质范围内观察到帕勒多林结合的线性。作为原则的证明，我们还测试了我们的检测效果在模型的F-actin去聚利用药理破坏作用素细丝由拉特伦库林A，以及刺激F-actin形成由KCl调解刺激孤立的突触终端。绑定法洛丁的荧光发射可以表示为标准线性曲线产生的绑定法洛丁的两个单位，并且相对于控制样本。对于图 4，F-actin 水平表示为绑定法乐蛋白的微单位。另一方面，对于图5的F-actin水平在去极化突触片段表示相对于控制未极化样本。我们描述了一个坚固、省时和高吞吐量的检测方法，用于分析行为细丝（F-actin）及其生理和病理生理状态的改变，适用于 96 井板格式。检测比现有的替代协议快得多，可以单独或结合现有的免疫造血术和基于西方印迹的检测，作为与行为相关的研究中的重要工具。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

同时在啮齿动物脑功能磁共振成像和电

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

科研

神经科学

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

从啮齿动物的神经元和非人类灵长类动物的脑片DiOLISTIC标签

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

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双荧光原位杂交食脑切片

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