Name: cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, spotiton
Uploaded: 2021-02-25T14:00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton at JoVE.com

نود أن نشكر بيتر أ. كان وتيري رود في شركة الفنون الهندسية ذ.م.م (أريزونا، الولايات المتحدة الأمريكية) على التصميم الأولي والتطوير اللاحق لنظام Spotiton. نشكر موظفي مركز سيمونز للفحص المجهري الإلكتروني في مركز نيويورك للبيولوجيا الهيكلية على المساعدة والدعم التقني. تم تنفيذ العمل المعروض هنا في المورد الوطني للمجهر الجزيئي الآلي الموجود في مركز نيويورك للبيولوجيا الهيكلية، بدعم من المنح المقدمة من المعاهد القومية للصحة (GM103310) ومؤسسة سيمونز (SF349247).

<ol>
	<li>Berriman, J., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transient+structures+by+cryo-microscopy+combined+with+rapid+mixing+of+spray+droplets.">Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets.</a> Ultramicroscopy. 56 (4), 241-252 (1994).</li><li>Dubochet, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+pure+water+for+electron+microscopy.">Vitrification of pure water for electron microscopy.</a> Journal of microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).</li><li>White, H. D., Walker, M. L., Trinick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-controlled+spraying-freezing+apparatus+for+millisecond+time-resolution+electron+cryomicroscopy.">A computer-controlled spraying-freezing apparatus for millisecond time-resolution electron cryomicroscopy.</a> Journal of Structural Biology. 121 (3), 306-313 (1998).</li><li>White, H. D., Thirumurugan, K., Walker, M. L., Trinick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+generation+apparatus+for+time-resolved+electron+cryo-microscopy+using+stepper+motors+and+electrospray.">A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray.</a> Journal of Structural Biology. 144 (1-2), 246-252 (2003).</li><li>Kontziampasis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-EM+grid+preparation+device+for+time-resolved+structural+studies.">A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies.</a> IUCrJ. 6, 1024-1031 (2019).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-assisted+annular+microsprayer+for+sample+preparation+for+time-resolved+cryo-electron+microscopy.">Gas-assisted annular microsprayer for sample preparation for time-resolved cryo-electron microscopy.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 24 (11), 115001 (2014).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy.">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23 (6), 1097-1105 (2015).</li><li>Kaledhonkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+steps+in+bacterial+translation+initiation+visualized+using+time-resolved+cryo-EM.">Late steps in bacterial translation initiation visualized using time-resolved cryo-EM.</a> Nature. 570 (7761), 400-404 (2019).</li><li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+for+release-factor+activation+during+translation+termination+revealed+by+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy.">The structural basis for release-factor activation during translation termination revealed by time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Nature Communications. 10 (1), 2579 (2019).</li><li>M&#228;eots, M. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microfluidics+enables+kinetic+insight+from+time-resolved+cryo-EM.">Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM.</a> Nature Communications. 11 (1), 3465 (2020).</li><li>Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+cryo-electron+microscopy+using+a+microfluidic+chip.">Time-resolved cryo-electron microscopy using a microfluidic chip.</a> Methods in Molecular Biology. 1764, 59-71 (2018).</li><li>Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotiton:+a+prototype+for+an+integrated+inkjet+dispense+and+vitrification+system+for+cryo-TEM.">Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM.</a> Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).</li><li>Razinkov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+vitrifying+samples+for+cryoEM.">A new method for vitrifying samples for cryoEM.</a> Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).</li><li>Dandey, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotiton:+New+features+and+applications.">Spotiton: New features and applications.</a> Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).</li><li>Dandey, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+cryo-EM+using+Spotiton.">Time-resolved cryo-EM using Spotiton.</a> Nature Methods. 17, 897-900 (2020).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+"self-wicking"+nanowire+grids.">Optimizing "self-wicking" nanowire grids.</a> Journal of Structural Biology. 202 (2), 170-174 (2018).</li><li>Ravelli, R. B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structures+from+sub-nl+volumes+using+pin-printing+and+jet+vitrification.">Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification.</a> Nature Communications. 11 (1), 2563 (2020).</li></ol>

B.C./C.S.P. لديها علاقة تجارية مع SPT Labtech، وهي شركة تنتج أداة متاحة تجاريا، الحرباء، التي تقوم على نموذج Spotiton الأولي.

يحدد هذا البروتوكول استخدام نظام Spotiton الروبوتي لإعداد شبكات التصوير بالتبريد -EM التي تحمل عينتين ، عادة بروتين مثير للاهتمام وليغاند نشط ، تم خلطهما لمدة 90-500 مللي ثانية. على الرغم من أن سير العمل مباشر، إلا أن هناك بعض الاعتبارات التي يجب على المستخدم وضعها في الاعتبار لضمان جلسة عمل إنتاجية لصنع الشبكة. أولا، ليس من غير المألوف أن تصبح إحدى نصائح موزع الكهروضوئي مسدودة أو مسدودة تمنعها من إطلاق النار. سيؤدي مثل هذا الفشل إلى شريط سائل ، يظهر على التقاط الصور من الكاميرا العلوية أو السفلية ، وهو أضيق بشكل واضح من ذلك الذي شوهد بعد إطلاق كلتا النصائح. يمكن أن ينتج الانسداد عن فقاعة هوائية في الطرف ، مما يعطل تكوين القطيرات ، أو من عينة البروتين التي جفت وأغلقت فتحة الطرف الضيقة. على الرغم من فقدان العينة يستنشق في هذه العملية، يمكن حل كل من المشاكل عن طريق غسل بالموجات فوق الصوتية من النصائح وإعادة الطموح للعينة. لمنع انسداد اللاحقة وعينة النفايات، فمن الأهمية بمكان لرئيس تماما (دافق) خطوط السوائل قبل الطموح عينة والحفاظ على مستوى الرطوبة عالية ومتسقة داخل الغرفة والكفن. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤثر عينة البروتين ذات التركيز العالي بشكل خاص على إطلاق البقشيش على الرغم من الرطوبة التي يتم الحفاظ عليها بشكل جيد. على الرغم من أن زيادة سعة الإطلاق على علامة التبويب Inspect يمكن أن تعوض جزئيا عن ضعف إطلاق النار بسبب تركيز البروتين العالي ، فإن تمييع العينة على الأقل 1:2 سيحسن إطلاق البقشيش وتجنب الانسداد.
ثانيا، قد يكون من الصعب تحقيق سرعة الفتل المثالية اللازمة لتوليد جليد من سمك أمثل لمدة الخلط المستهدفة. عموما، سوف أوقات خلط أسرع تتطلب فتل أسرع، وأوقات خلط أبطأ تتطلب فتل أبطأ. بالنسبة للشبكة الشريرة بشكل مثالي ، يمكن تمييز الشريط السائل بوضوح في صورة الكاميرا العلوية ، بينما في الكاميرا السفلية ، لا يزال سماكة طفيفة جدا لقضبان الشبكة في موقع الشريط مرئية. فتل بطيء، وأشار من قبل شريط داكن على صورة الكاميرا السفلى، ويترك عموما الجليد التي هي سميكة جدا للتصوير. غياب شريط على أي صورة يشير إلى فتل سريع التي قد تركت أي ماء في الثقوب (الشكل S5). يمكن أن تؤثر عدة عوامل مثل كثافة الأسلاك النانوية وإعدادات تنظيف البلازما ومدتها ووقت التعرض لمستوى رطوبة الغرفة وتعيينه على سرعة الفتل. قد يكون فتل الفقراء (البطيء) نتيجة لطلاء متناثر من الأسلاك النانوية على الشبكة. عن طريق تخفيف قليلا وزيادة وقت التعرض للحل nanowire16، وكثافة وتغطية nanowires على قضبان الشبكة وزيادة ، وتسهيل أسرع فتل. إذا كانت كثافة الأسلاك النانوية كافية ، فإن زيادة إعداد القوة الكهربائية أو مدة تنظيف البلازما ستحسن أيضا الفتل. الإعدادات الموصى بها هنا منخفضة نسبيا ومدة طويلة، ولكن قد تتغير إذا لزم الأمر.
ومع ذلك ، إذا كانت كل من الدفعة المحددة من الشبكات وإعدادات تنظيف البلازما قد عملت بشكل جيد في جلسة سابقة ، فقد ينشأ أداء الفتل البطيء من التعرض المفرط للأسلاك النانوية إلى رطوبة عالية داخل الغرفة ، مما يؤدي إلى تشبعها بالرطوبة وتقليل القدرة على حمل السائل. يمكن تقليل تأثير تشبع الشبكة من رطوبة الغرفة إما عن طريق تقليل الوقت المنقضي بين تصاعد ملاقط والشبكة تغرق أو خفض مستوى رطوبة النظام قبل الهبوط. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن هذا الأخير يجلب الخطر المرتبط بأن الطرف المحملة عينة البروتين سوف تسد. لتعويض هذا الخطر، عقد نصائح في الكفن حيث يتم الحفاظ على مستوى الرطوبة العالية، يمكن أن تزيد من مقدار الوقت المسموح به لتركيب ملاقط عقد شبكة جديدة. وأخيرا، تجدر الإشارة إلى أن انخفاض وقت الهبوط (الذي يتحقق عن طريق زيادة تسارع الشبكة و / أو السرعة القصوى) يمكن أن يؤدي إلى شبكات مع الجليد أرق دون تغيير خصائص الفتيل في الواقع من الشبكة. ومع ذلك ، كما سيتم أيضا تقليل وقت خلط العينتين ، فإن وقت الهبوط ليس عاملا يتم تغييره عادة لمعالجة الفتل البطيء. لمعالجة الفتل الذي هو سريع جدا، مما أدى إلى الجليد التي هي إما رقيقة جدا أو غائبة في ثقوب الشبكة، يمكن اتخاذ عكس التدابير المبينة أعلاه.
Spotiton يقدم بعض المزايا والعيوب بالمقارنة مع التقنيات الأخرى التي وضعت للدراسات دون الثانوية حل الوقت. كما يحتوي على شريط عينة مختلطة فقط 2-4 nL من السائل من كل موزع، واحد 3 ميكرولتر aliquot من كل عينة كافية لإعداد العديد من الشبكات-ميزة رئيسية عندما تكون العينة محدودة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مراقبة ترسب العينة باستخدام الكاميرات المتكاملة ، على الرغم من أنها ليست فريدة تماما ل Spotiton17، ليست سمة من سمات أجهزة الخلط الأخرى وتسمح للشبكات المغرقة بالخضوع لتقييم تمرير / فشل الخام ، مما يقلل إلى حد كبير من وقت الفحص. أحد العيوب الرئيسية للنظام هو الحد الأدنى من وقت الاختلاط 90 مللي ثانية ، مقيدا بالقيود المادية للمكونات الميكانيكية ، مما يجعل استجواب التفاعلات البيولوجية الأسرع بعيدا عن متناول اليد. وعلى سبيل المقارنة، يتم تحقيق أقل من 10 مللي ثانية بشكل روتيني على الأنظمة الدقيقة الفلورية الموجودة. على Spotiton القائم على نظام الحرباء المتاحة تجاريا ، والتصميم والبناء التحسينات خفضت الحد الأدنى من الوقت يغرق إلى 54 مللي ثانية ، ورفع احتمال أن إضافة موزع الثاني يمكن أن تسمح أسرع أوقات الاختلاط من Spotiton يمكن أن تقدم حاليا.
حتى الآن ، تم إجراء مجموعة من التجارب للتحقيق في الحالات الجزيئية المبكرة قصيرة الأجل باستخدام Spotiton ، بما في ذلك تجميع الريبوسوم 70S ، والتغيرات التركيبية الناجمة عن الكالسيوم في قناة أيونات عبر الميمبران ، وانقباض ال دينامين استجابة للتحلل المائي GTP15. ومنذ نشر هذه النتائج، أدخلت عدة تغييرات على النظام لتعزيز إنتاجية دورات صنع الشبكة Spotiton وإعادة استنساخها والإبلاغ عنها. وتشمل هذه، من بين أمور أخرى، نظام مراقبة الرطوبة والتحكم التلقائي في المنطقة المزدوجة، وميزة عارض التجربة، وميزة فحص البقشيش جنبا إلى جنب، والعديد من الترقيات الطفيفة لواجهة المستخدم. وسيدعم النظام المطور بشكل أفضل تجارب الخلط المستقبلية ذات العينتين المماثلة لتلك التي تم الإبلاغ عنها سابقا وكذلك المقايسات الملزمة السريعة مثل بين علاج جزيء صغير وهدفه البروتيني أو حتى تكوين مركب مستضد الأجسام المضادة. وفي حين أن التجارب الحالية والمستقبلية التي تم حلها زمنيا والتي تشمل شريكين متفاعلين ستستمر بالتأكيد، فإن إضافة موزع كهرومغناطيس ثالث وما يرتبط به من أجهزة يمكن أن يزيد من توسيع نطاق التجارب المحتملة. على سبيل المثال، يمكن أن يزيل الترسب الأولي للمنظفات يليه البروتين المثير للاهتمام، يليه ليغاند المتفاعل أو المنشط أي تأثير سلبي محتمل للتعرض الموسع للمنظفات، وغالبا ما يكون ضروريا لمنع نتائج التصوير الشائعة دون المستوى الأمثل مثل التوجه المفضل. في ضوء كل من العمل المنشور بالفعل والتطبيقات المستقبلية المحتملة ، تمثل Spotiton أداة مهمة لمجتمع cryo-EM لتسهيل إجراء دراسات حل الوقت الثانوي.

وقد تحققت إمكانية ل CRYO-EM لالتقاط وتكشف عن حالات تشكيلية عابرة من البروتينات على مقياس زمني دون الثاني (وقت حل cryo-EM) من قبل عدة مجموعات، بدءا من بريمان وأونوين1 الذي بنيت تقنية على طريقة تجميد الهبوط القياسية التي وضعتها دوبوشيه لإعداد شبكات التبريد EM2. وأضافوا رذاذ فقط فوق كوب cryogen التي تستخدم غاز النيتروجين المضغوط لرش ضباب غرامة من عينة ثانية على شبكة EM يغرق تحتوي على العينة الأولى التي تم تطبيقها ولطخت إلى طبقة مائي رقيقة. على الرغم من أن هذا النظام يمكن أن يحقق خلط مرات منخفضة تصل إلى 1 مللي ثانية ، فإنه لا يزال يتطلب النشاف اليدوي للعينة الأولى من قبل المستخدم - مهمة صعبة من الناحية الفنية ، وحجم مرتفع نسبيا من العينة الثانية. وعلاوة على ذلك، من الصعب عمليا معرفة مكان حدوث خلط العينتين، مما يتطلب استخدام الجسيمات النانوية الفيريتين كعلامة في العينة المختلطة. الجهود اللاحقة التي بذلها هوارد وايت وزملاء العمل تحسين السيطرة وإعادة إنتاج هذا النهج الرش خلط من خلال دمج التحكم في الكمبيوتر من النشاف والرش الخطوات3،4. لمعالجة مدى و أين تختلط العينات، انتقلت نفس المجموعة5 و غيرها6و7و8و9و10 إلى نهج خلط الرش11 حيث يتم خلط عينتين إما في أنابيب شعرية ضيقة تحت ضغط مضخات الحقن أو في رقائق ميكروفلويديك المصنعة الدقيقة التي يقودها غاز النيتروجين. هذه النظم premixing ليس فقط ضمان الاختلاط الكامل ، ولكن أيضا تمكين صقل أوقات الاختلاط لزيادة دقة الدراسات التي تم حلها في الوقت المناسب.
إدخال موزعات الكهروضوئية كوسيلة بديلة لتطبيق عينة على شبكات EM في نظام Spotiton مكنت كل من الاستهداف الدقيق لترسب العينة ومتطلبات حجم عينة أصغر بكثير لجعل الشبكة12. في وقت لاحق ، واستخدام شبكات nanowire وتطبيق عينة في الطريق ("على الطاير" اكتشاف) إزالة الحاجة إلى خطوة النشاف وخفض التطبيق إلى التزجيج مرات13،14. لنهج جديد لحل الوقت cryo-EM وصفها هنا، تم إضافة موزع الثاني جنبا إلى جنب مع أجهزة التحكم اللازمة وترقيات البرمجيات إلى نظام Spotiton لتمكين تسليم عينة ثانية على شبكة nanowire تتحرك على الفور تقريبا بعد ترسب أول15. مزيج اثنين من عينات متداخلة على الشبكة لأنها شريرة من قبل nanowires في طبقة مائي رقيقة قبل التزجيج. يمكن تحقيق خلط مرات منخفضة مثل 90 مللي ثانية. يهدف هذا البروتوكول إلى توفير معلومات عملية حول كيفية إجراء التجارب التي تم حلها زمنيا باستخدام الاستغناء الكهربائي والشبكات النانوية. بالإضافة إلى ذلك، كما يتم تعديل الأجهزة والبرامج لتحسين سهولة الاستخدام والتناسق والإنتاجية، هذا البروتوكول أيضا بمثابة وصف محدثة من الأسلوب15المبلغ عنها سابقا .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryogenic grid storage boxes</td>
			<td>EMS (Hatfield, PA; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu/Rh 300 mesh EM grids</td>
			<td>EMS (Hatfield, PA; USA)</td>
			<td>EMS300-Cu-Rh</td>
			<td>treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethane gas</td>
			<td>TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid-handling forceps</td>
			<td>EMS (Hatfield, PA; USA)</td>
			<td>78320-5B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picosystem</td>
			<td>Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>water purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein/other sample</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solarus 950 plasma cleaner</td>
			<td>Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, spotiton

لا يزال التقاط الحالات الجزيئية قصيرة الأجل الناجم عن اللقاء المبكر لاثنين أو أكثر من الجسيمات المتفاعلة يشكل تحديا تجريبيا ذا أهمية كبيرة في مجال المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM). وقد تم وضع عدد قليل من الاستراتيجيات المنهجية التي تدعم هذه الدراسات "حل الوقت"، واحدة منها، Spotiton-a نظام الروبوتية الجديدة يجمع بين الاستغناء عن قطرات عينة الحجم picoliter مع التحكم الزمني والمكاني الدقيق. يوفر سير عمل Spotiton الذي تم حله زمنيا نهجا فعالا بشكل فريد لاستجواب عمليات إعادة الترتيب الهيكلي المبكرة من الحد الأدنى لحجم العينة. أطلقت من موزعات كهربائية بيزوئية تسيطر عليها بشكل مستقل، وعينتين الأرض ومزيج بسرعة على شبكة EM nanowire لأنها تغرق نحو cryogen. يمكن إعداد مئات الشبكات في تعاقب سريع من عدد قليل من microliters فقط من عينة. هنا، يتم تقديم بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لتشغيل نظام Spotiton مع التركيز على استكشاف الأخطاء وإصلاحها مشاكل محددة تنشأ أثناء إعداد الشبكة.

الشكل 4 يظهر صورا لشبكات أعدت خلال جلسة سبوتيتون حلها مرة واحدة عن طريق خلط البوليميراز RNA و105 BP الحمض النووي oligomer تحمل تسلسل المروج لمدة 150 مللي ثانية قبل التزجيج15. وينظر في هذا الرقم هي الصور التي اتخذتها اثنين من الكاميرات عالية السرعة من ست شبكات في نقطتين زمنيتين بعد تطبيق العينة. هذه الكاميرات، فريدة من نوعها بين المجمدات على غرار يغرق، تسمح للمستخدم أن يقرر على الفور ما إذا كان للحفاظ على أو تجاهل شبكة على أساس مدى لاحظ من فتل من قبل أسلاك النانو واحتمال تم سحب العينات السائلة في طبقة مائي رقيقة بما يكفي للتصوير EM. وعلى الرغم من أن شبكة واحدة يمكن أن توفر ما يكفي من الجليد لمجموعة بيانات كاملة، فبمجرد تحقيق الظروف المثلى، فإن العديد من الشبكات مستعدة للإبقاء على أهبة الاستعداد في حالة فقدان أو تلوث شبكة واحدة أو أكثر. من الشبكات الست التي أعدت في هذه الدورة ، والتقاط الصور تظهر واحدة فقط مع فتل دون المستوى الأمثل(الشكل 4F).
تم إعداد الشبكات المعروضة (الخطوات من 2.5.1 إلى 2.5.8) على التوالي على مدى 40 دقيقة بعد ساعة لتجهيز العينات والجهاز كما هو موضح في البروتوكول (الخطوات من 1.1.1 إلى 2.4.6). ومن بين الشبكات الست، استخدمت شبكتان لجمع البيانات، وحفظت الشبكات المتبقية لتحليلها لاحقا إذا لزم الأمر. نمط الجليد على شبكة vitrified (الشكل 5C) يطابق عن كثب نمط السائل المودع ينظر في صورة الكاميرا العليا (الشكل 5B). فتل فعال من العينات المختلطة ، التي أدلى بها واضح من عدم وجود شريط السائل مرئية في صورة الكاميرا السفلى(الشكل 5A)، يحدث على طول قضبان الشبكة التي تغطيها nanowire ، وعينة نادرا ما يفيض في المربعات المجاورة لتلك التي هبطت فيها. داخل المربعات المليئة بالجليد ، يكون الجليد عادة أكثر سمكا داخل الثقوب في وسط المربع ويصبح أرق في ثقوب أقرب إلى قضبان الشبكة(الشكل 5E). غالبا ما تكون الثقوب المجاورة مباشرة لقضبان الشبكة فارغة بسبب قربها من الأسلاك النانوية(الشكل 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig01.jpg"> الشكل 1: نظام Spotiton الذي تم حله زمنيا. 1. محطة عمل المشغل؛ 2. غرفة البيئة؛ 3. إمدادات النيتروجين؛ 4. إيثان توريد 5. التحكم في الإضاءة الخلفية لكاميرا مسار الهبوط العلوي 6. وحدات تحكم موزع كهربائية؛ 7. مضخات حقنة؛ 8. مضخة فراغ؛ 9. غسل إمدادات المياه وزجاجات النفايات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig02.jpg"> الشكل 2: Spotiton واجهة المستخدم البرمجيات. (أ) رمز سطح المكتب وشاشة البداية. (ب) ويتكون واجهة المستخدم الرئيسية من ستة مجالات: 1. منطقة العرض لمسار يغرق العلوي ("العلوي") وكاميرات التفتيش تلميح; 2. منطقة العرض لانخفاض مسار الهبوط ("أقل") الكاميرا؛ 3. منطقة التشغيل لمقاطع فيديو التفتيش تلميح؛ 4. منطقة علامة التبويب متعددة الوظائف؛ 5. رصد الرطوبة الحية؛ 6. ملف سجل النظام المباشر. اختصار: واجهة المستخدم = واجهة المستخدم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig03.jpg"> الشكل 3: منظر داخلي لغرفة Spotiton (روبوتات في SafePosition). 1. شبكة الروبوت (أحمر)؛ 2. موزع الروبوت (الأصفر)؛ 3. كاميرا مسار الهبوط العلوي (الوردي)؛ 4. انخفاض كاميرا مسار الهبوط (الأزرق الفاتح)؛ 5. تلميح كاميرا التفتيش (البرتقالي)؛ 6. كفن الرطوبة (أخضر)؛ 7. عينة صينية؛ 8. تجميع البخاخات (أزرق داكن)؛ 9. نظام الخزانات وخطوط المياه. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig04.jpg"> الشكل 4: صور كاميرا النظام التمثيلي من جلسة عمل Spotiton التي تم حلها زمنيا. (أ) -F) العلوي (يسار) وأقل (يمين) يغرق صور كاميرا المسار من ست شبكات التي تم تطبيقها بوليمراز الحمض النووي RNA وتسلسل الحمض النووي المروج باستخدام Spotiton. مقياس الشريط = 500 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig05.jpg"> الشكل 5: نمط ترسب الجليد على شبكة Spotiton المعدة. أجزاء من (أ) أقل و (ب) صور الكاميرا العليا و (C) أطلس الشبكة هو مبين في الشكل 4F. المواقع التقريبية للجليد الناتج عن ترسب العينة والاختلاط هي الخزامى الملونة. يتم تصوير المناطق داخل المربع الذي تم وضع علامة عليه برأس سهم أصفر في (E-G). المنطقة الموضحة في (E) محاصر باللون الأصفر في (D). مربع تمثيلي (E) ، ثقب (F) ، و (G) صور التعرض التي تم جمعها من الشبكة المبينة في (A-D). المناطق محاصر في مربع وصور حفرة تتوافق مع ثقب والتعرض للصور، على التوالي. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (A-D)، 5 ميكرومتر (E)، 2 ميكرومتر (F)، 100 نانومتر (G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الشكل S1: التفتيش على طرف اطلاق النار. وينظر إلى عرض حي لإطلاق تلميح 2 في شاشة الكاميرا العليا على يسار واجهة المستخدم، في حين أن تسجيل أدلى سابقا من تلميح 1 اطلاق يلعب على حلقة للمقارنة في منطقة تشغيل الفيديو على اليمين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S1.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا تحميل هذا الملف.</a>
الشكل S2: التنظيف بالموجات فوق الصوتية من نصائح موزع. فقاعة الهواء في (A) تلميح سوف تعطل تشكيل قطرة ومنع إطلاق طرف. (ب) نصائح مغمورة في الماء في محطة التنظيف بالموجات فوق الصوتية لإزالة فقاعة الهواء أو البروتين المجفف واضحة عرقلة فتحة تلميح. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S2.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا تحميل هذا الملف.</a>
الشكل S3: تحميل الشبكة في ملاقط. (أ) وضعت شبكة نانو واير الجانب حتى على حافة كتلة الشبكة. (ب) شبكة متمركزة بشكل صحيح في ملاقط الإغلاق الذاتي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S3.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا تحميل هذا الملف.</a>
الشكل S4: تعقب الرطوبة. الرطوبة النسبية في الغرفة (الأزرق الداكن) والكفن (الأزرق الفاتح) كما هو مسجل خلال جلسة نموذجية لصنع الشبكة. يتم رسم أوقات هبوط الشبكة (المربعات الخضراء) على الرسم البياني. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S4.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا تحميل هذا الملف.</a>
الشكل S5: فتل على شبكات نانو واير خلال الهبوط. ممثل العلوي (A, C, E) وأقل (B, D, F) يغرق صور الكاميرا مسار فتل على شبكات نانو واير التي هي بطيئة جدا (A, B), مثالية (C, D), وسريع جدا (E, F). سماكة طفيفة (رؤوس الأسهم البيضاء) يشير إلى أشرطة الشبكة مع أسلاك النانو التي تم تشبعها بالعينة. الساحات في هذه المناطق تحتوي عادة على الجليد من سمك مناسب للتصوير المجهري الإلكتروني. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S5.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا تحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton at JoVE.com

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

يصف البروتوكول المعروض هنا استخدام Spotiton ، وهو نظام روبوتي جديد ، لتقديم عينتين من الاهتمام على شبكة نانوية ذاتية الفتل تختلط لمدة لا تقل عن 90 مللي ثانية قبل التزجيج في cryogen السائل.

إعداد الشبكة المجهرية كريو إلكترون للدراسات التي تم حلها عبر الزمن باستخدام نظام روبوتي جديد، Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

باستخدام نظام Spotiton الروبوتي ، يمكن للمرء خلط وvitrify بروتين من الفائدة مع شريك التفاعل على شبكة المجهر الإلكتروني في أسرع وقت 90 مللي ثانية. يسمح هذا البروتوكول بالتقاط تأكيدات البروتين الوسيطة العابرة للغاية بحيث لا يمكن التقاطها بواسطة تقنيات إعداد الشبكة القياسية. يمكن أن يقوم Spotiton الذي تم حله بالوقت بإعلام الأنظمة البيولوجية أو الكيميائية الحيوية دون الثانية مثل تنشيط قناة الغشاء أو تخليق الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو التفاعل المبكر لعقار أو مضاد مع البروتين المستهدف.يجب على المستخدم إدارة عدة مكونات تؤثر مباشرة على جودة الشبكة بشكل متزامن. من المهم فهم النظام قبل الاستخدام والصبر عند إعداد الشبكات. للبدء، افتح الصمام الرئيسي على خزان إمدادات النيتروجين وتأكد من ملء خزان النظام بالمياه فائقة البور التي تم إزالة الغازات عنها.قم بتشغيل الكمبيوتر ونظام Spotiton في قطاع الطاقة متعدد المنافذ. انقر على أيقونة سطح المكتب لفتح واجهة المستخدم لبرنامج Spotiton. في القائمة أدوات، حدد تهيئة مراحل لتهيئة والمنزل الروبوتات محور ثلاثة والتجميع رئيس موزع الدورية، وضمان نصائح موزع تشير إلى أسفل قبل التهيئة ومهتدية.في القائمة الرئيسية، انقر على الانتقال إلى الوضع الآمن لإرسال الروبوتات إلى الوضع الآمن. في علامة التبويب أسبيرات، حدد رئيس الوزراء لطرد رؤساء موزع عدة مرات مع المياه من الخزان. استمر حتى يمكن رؤية تيارين من المياه دون انقطاع يخرجان من النصائح.في علامة التبويب فحص، أرسل تلميحا واحدا إلى كاميرا الفحص واختبر مياه الحريق، مع ضبط السعة حتى يتم إنتاج قطرات منفصلة. اضغط على زر تسجيل في شاشة الكاميرا العلوية لتسجيل فيديو من طرف واحد إطلاق النار. أرسل التلميح الثاني إلى كاميرا الفحص.تشغيل الفيديو من طرف واحد اطلاق النار في الشاشة الجانب الأيمن في نفس الوقت يتم تشغيل تلميح اثنين في شاشة الكاميرا العليا، مطابقة لنمط إنتاج قطرة من موزعين. إزالة الملاقط من جبل على الروبوت الشبكة باستخدام مفتاح ألن الموردة. على سطح مقاعد البدلاء القريبة، ضع جانب نانوواير شبكة اختبار حتى على حافة كتلة الشبكة.الاستيلاء بعناية على حافة الشبكة ووضعها بشكل صحيح في ملاقط. ثم إعادة تحميل الملاقط. في علامة التبويب Cryo، انقر على تلميح إلى الكاميرا لنقل طرف واحد إلى مجال الرؤية لكاميرا مسار الهبوط العلوي، مع ضمان تحديد Live في شاشة الكاميرا العلوية.قم بتشغيل ضوء الكاميرا العلوي وضبطه. تلميح موضع واحد مرئي في شاشة الكاميرا العلوية، عن طريق النقر فوق الماوس داخل الشاشة. انقر على الشبكة إلى الكاميرا لوضع الشبكة أمام الكاميرا العلوية، ثم ضبط طرف موقف واحد مرة أخرى إذا لزم الأمر.في علامة التبويب Cryo، تأكد من عدم تحديد الشبكة Vitrified، انقر فوق هدف قائمة الانتظار، ثم على الهبوط. تقييم الصور العلوية والسفلية للتأكد من موزعات تعمل بشكل طبيعي. تمييع عينتين إلى التركيزات المطلوبة مع عازل مناسب ، من الناحية المثالية باستخدام نفس الشيء لكليهما ، وملء وعاء cryogen بالنيتروجين السائل.البلازما تنظيف ثلاث إلى أربع شبكات نانوواير باستخدام خمسة واط الهيدروجين والأوكسجين، و 1.5 دقيقة كنقطة انطلاق. سد العجز في البخاخات ومراقبة خروج بخار الميناء المركزي للغطاء البخاخات. مراقبة مراقبة الرطوبة الحية في النافذة الرئيسية أو فتح تعقب الرطوبة المحيطة تحت التقارير والمحيطة.تحقق من مستويات الرطوبة في مناطق الحجرة والكفن. أضف خمسة ميكرولترات من كل عينة إلى أكواب العينة. قم بتحميل أكواب العينة في صينية الاحتجاز مع عينة للنصيحة الأولى على اليسار وللطرف الثاني على اليمين.ثم ادفع الدرج مرة أخرى إلى الجهاز حتى يتسع. في علامة التبويب أسبيرات، حدد ثلاثة ميكرولترات لوحدة التخزين التي سيتم يستنشقها كل طرف. تأكد من أن علبة العينة قد تم الجلوس بشكل آمن ، وانقر فوق أسبيرات ، ومراقبة مرحلة ماصة تحريك رؤساء موزع في أكواب العينة.تحقق من الطموح الناجح لكلا العينتين عن طريق إزالة أكواب العينة ومراقبة انخفاض في مستويات السائل. في علامة التبويب فحص، أرسل كل طرف إلى كاميرا الفحص للتأكد من الاستغناء دون عائق. ضبط السعة حسب الحاجة لمطابقة تشكيل القطيرات من كل طرف.تحميل البلازما الطازجة تنظيف الشبكة في ملاقط، ولكن لا جبل ملاقط حتى الآن. تأكد من رفع مستوى الرطوبة إلى حوالي 90 إلى 95٪ ملء كأس الإيثان وإجراء اختبار نهائي لاطلاق النار من كل من نصائح أمام الكاميرا التفتيش، مما يؤكد عدم وجود عرقلة. في علامة التبويب كريو، انقر على تلميح إلى الكاميرا.تحقق من كأس الإيثان. إذا تشكل جليد الإيثان، تذوب حسب الحاجة مع غاز الإيثان إضافية. جبل ملاقط مع الشبكة على مرحلة الشبكة.في علامة التبويب Cryo، انقر على الشبكة إلى الكاميرا، لضمان وضع طرف واحد بشكل صحيح في شاشة الكاميرا العلوية. انقر على الشبكة Vitrified ، هدف قائمة الانتظار ، ثم يغرق. انقر على موافق عندما يطلب منه الأمر الروبوت الشبكة للقفز الشبكة من الإيثان إلى النيتروجين السائل والإفراج عنه على الرف المغمورة.فحص صور الشبكة لتحديد ما إذا كان يجب الاحتفاظ بها أو التخلص منها. إذا حفظ الشبكة، قبل بارد ملقط غرامة يميل، فهم بلطف الشبكة من الحافة، ووضعها في فتحة مربع الشبكة، بدءا من الفتحة الأولى على يسار الشق والذهاب في اتجاه عقارب الساعة. استخدم عارض التجارب لمراجعة صور الشبكة ومقارنتها من الكاميرات العلوية والسفلية إلى جانب إعدادات الجهاز وقياسات الرطوبة في وقت الهبوط عن طريق تحديد التقارير والتجربة.تظهر هنا صور الشبكات التي تم إعدادها خلال جلسة Spotiton واحدة تم حلها زمنيا عن طريق خلط بوليميراز الحمض النووي الريبي في أوليجومر الحمض النووي ثنائي الأساس 105 يحمل تسلسل مروج لمدة 150 مللي ثانية قبل التزجيج. من بين الشبكات الست، يظهر واحد فقط فتل دون المستوى الأمثل. يتطابق نمط ترسب الجليد على شبكة مهززة بشكل وثيق مع نمط السائل المودع الذي يظهر في صورة الكاميرا العلوية.يحدث فتل فعال للعينات المختلطة على طول قضبان الشبكة المغطاة بأسلاك النانو حيث نادرا ما تفيض العينة إلى مربعات مجاورة لتلك التي هبطت فيها. في المربعات المليئة بالجليد ، يكون الجليد عادة أكثر سمكا داخل الثقوب في وسط الساحة ويصبح أرق في الثقوب الأقرب إلى قضبان الشبكة. غالبا ما تكون الثقوب المجاورة مباشرة لقضبان الشبكة فارغة ، بسبب قربها من الأسلاك النانوية.الإعداد السليم والتعامل مع شبكات الأسلاك النانوية سيضمن سمك الجليد الجيد على شبكات العينة المختلطة. كما يسمح نظام Spotiton للمستخدم بإيداع العينتين بشكل منفصل على شبكة واحدة ، مما يتيح جمع عنصر تحكم غير مطلق أثناء جلسة صيانة الشبكة نفسها. Spotiton مكنت من التقاط وسيطة الأولى في التعبير الجيني البكتيري في الوقت الحقيقي.ولأنها تتشكل على مقياس زمني دون ثانية، فإن هياكلها لم تكن معروفة حتى الآن.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

التحضير للثقافات الجرذ الحصى الدماغ العصبية للتنمية والدراسات الدبقية

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

الدراسات الجينية البشرية البروتينات إصلاح الحمض النووي باستخدام خميرة كنظام النموذجي

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

إعداد الكبار ذبابة الفاكهة لعيون Sectioning رقيقة والتحليل المجهري

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

البرد الإلكترون المجهري عينة التحضير عن طريق المركزة ايون شعاع

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

ما يفعل وما يترك من المجهري البرد الإلكترون: وهو أول كتاب عن تحضير العينة وجمع البيانات عالية الجودة للتعمير الجزيئات 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

التصور للضغط الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء بالتصوير المقطعي الفولت العالي Cryo-إلكترون

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

إعداد العينة بواسطة طحن شعاع الأيونات المركز 3D للتصوير المقطعي عالي الدقة للإلكترون بالتبريد

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

التصوير المقطعي بالتبريد الإلكتروني جمع البيانات عن بعد ومتوسط التصوير المقطعي الفرعي

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Deep Learning-Based Segmentation of Cryo-Electron Tomograms

التجزئة القائمة على التعلم العميق للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد

Cryo-electron tomography (cryo-ET) allows researchers to image cells in their native, hydrated state at the highest resolution currently possible. The ...