Name: cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, spotiton
Uploaded: 2021-02-25T14:00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton at JoVE.com

我们要感谢彼得A.卡恩和特里罗德在工程艺术有限责任公司（亚利桑那州，美国）的初始设计和随后开发的Spotiton系统。我们感谢纽约结构生物学中心的西蒙斯电子显微镜中心的工作人员的帮助和技术支持。这里介绍的工作是在位于纽约结构生物学中心的国家自动分子显微镜资源中心进行的，得到了国家卫生研究院（GM103310）和西蒙斯基金会（SF349247）的资助。

1. 设置斯波蒂顿机器和软件
<ol><li>准备系统分配（图1）。<ol>
<li>打开氮气供应罐上的主阀。确保系统储层充满脱气超纯水。打开计算机。在多出电源条纹上打开 Spotiton 系统。</li>
		<li>单击桌面图标（图 2A）以打开 Spotiton 软件 （图 2B）的用户界面 （UI）。在工具菜单中，选择初始化阶段，以初始化和家用 3 轴机器人（网格级和移液器级）和旋转分配器头装配（该阶段）。确保分配器提示在初始化和归入之前指向下。</li>
		<li>在主窗口上，单击"转到安全定位"将机器人发送到安全定位（图3）。 注意：移动到安全定位可以在任何位置的机器人上完成，而不会有碰撞的风险。</li>
		<li>在 吸气 标签上，选择 Prime 将分配器头多次冲洗到水库中的水中。继续，直到从这两个提示中可以看到不间断的水流。 注：如果大量空气在上次关闭时用甲醇冲洗时进入流体线，则可能需要重复此情况。</li>
	</ol></li>
	<li>检查分配器性能<ol>
<li>在检查选项卡上，将每个提示发送到检查摄像机以测试火水，并匹配两个分配器的滴流生产模式（图 S1）。 注意：如果由于气泡（图 S2A）或碎屑而无法开火，请使用Aspirate选项卡上访问的超声波洗涤功能在洗涤站（图 S2B）清洁尖端。</li>
		<li>调整每个分配器和样品的发射振幅（无单位），以实现一致大小的离散液滴流。</li>
		<li>视觉上确认两个分配器的等效滴滴生产。<ol>
<li>按上部摄像机监视器中的 "记录 "按钮以录制提示 1 发射的视频。在右侧监视器中播放提示 1 射击的视频，同时在上部摄像机监视器（图 S1）中播放提示 2。 注：记录并存储每个尖端射击的视频。</li>
		</ol>
</li>
		<li>分配器现已准备好在网格上试火。 注：此协议假定在各自的暴跌位置正确对齐网格和移液器阶段已得到验证。如果无法确认正确的对齐，可能会导致碰撞，损坏尖端或机器人。</li>
	</ol></li>
	<li>网格上的试火水。<ol>
<li>确保机器人处于安全定位。</li>
		<li>使用提供的 Allen 密钥从网格机器人的安装件中取出钳子。</li>
		<li>在附近的台面上，将测试网格放置在网格块边缘的纳米线侧面。小心地抓住网格的边缘，正确地放置在钳子（图S3），并重新安装钳子。</li>
		<li>在Cryo选项卡上，单击"提示到相机"，将提示移入上跳路径摄像头（上部摄像头）的视图区域。确保在上部摄像机监视器中选择Live，并打开上部摄像机灯（在机柜前拨号（图 1）。</li>
		<li>将钳子安装在网格机器人上。位置提示 1，通过单击监视器内的鼠标在上部摄像机监视器中可见。 注意：只有提示 1 将可见，并将移动到单击的位置。</li>
		<li>单击 "网格到相机 "以将网格放置在上置摄像头前方。如果需要，调整提示 1 位置，如有必要。</li>
		<li>选择提示 1、提示 2或提示 1 和提示 2来选择一个或两个分配器来测试火。 注：单独试用提示时，使用鼠标将提示 1 放置在上置摄像机监视器中网格上的不同横向位置。这将以非重叠模式将两个提示中的液体条纹沉积，并允许用户确认每个提示已发射。</li>
		<li>在Cryo选项卡上，确保未选择Vitrify 网格，单击队列目标，然后点击Plunge。 注：移液器阶段将略有上升，其次是网格阶段。然后，网格机器人将网格从发射分配器和上下摄像机上跳过，在甲板上方休息。上部摄像机的图像捕获显示在 UI 左侧下部摄像头的图像捕获上方。</li>
		<li>评估上下图像：选择每个提示是否开火？当一起发射时，两个尖端的液体是否完全重叠，形成明显较厚的条纹，而不是单独发射时？<ol>
<li>如果尖端无法开火，则执行一个或多个超声波洗涤周期，直到观察到清晰的射击。</li>
			<li>如果样品条纹没有完全重叠，则使用 Allen 键调整其中一个分配器的横向对齐，将一个分配器上的横向调整螺丝打开一个四分之一转，并执行测试跳动。重复，直到条纹完全重叠。 注意：如果两个提示发射成功并如预期的那样，系统已准备好准备示例网格。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. 准备双样本混合网格
<ol><li>更新 机器参数 XML 文件中的加速度、减速和速度值，以达到感兴趣的混合时间。 注：将这些值与混合时间关联的表以前已报告15。</li>
	<li>准备好样品和网格。 注：从协议的这一点开始，在第一个网格准备之前，20-30 分钟将过去，在此时间间隔内，样品应保持在适当的温度。<ol>
<li>将两个样本（即蛋白质和配体或其他相互作用的伙伴）稀释到所需的浓度上，并具有适当的缓冲，理想情况下，两者相同。 注：Spotiton网格需要比通常用于自动跳冰柜的蛋白质浓度高1.5-2倍。这可能是由于蛋白质在跳槽时在网格表面的薄水层中花费的时间最少，使颗粒在空气-水接口集中的机会减少。</li>
		<li>用液氮填充低温碗。</li>
		<li>等离子清洁 3-4 纳米线网格。使用5W，氢和氧，1.5分钟作为起点。 注：最有效的等离子清洁持续时间和配方可能会根据环境温度和湿度以及使用的纳米线网格的批次而改变。替代气体混合物或发光放电器也可能有效，但尚未为此目的进行测试。由于缓冲液中的水和蛋白质通常以不同速度被纳米线恶搞，因此最好在分配实际样品的暴跌中评估当天使用的网格的恶恶。</li>
	</ol></li>
	<li>设置系统中的湿度水平。 注：除了用于制作和等离子清洁网格的条件外，湿度是影响纳米线网格的回烁速度的另一个主要因素。虽然特定会话的目标百分比湿度是根据每天和一批网格的经验确定的，但 90-95% 是一个很好的起点。<ol>
<li>确保雾化器充满超纯水。插入雾化器，观察雾化器盖上的中央端口的蒸汽出口。</li>
		<li>观察主窗口的实时湿度监测器，或打开报告下的环境湿度跟踪器 |环境 （图 S4）。检查两个区域的湿度水平： 室 和 罩。 注： 会议厅 包括斯波蒂顿外壳内的所有区域。 护罩 是立即包含网格和分配器提示的"相机"位置的区域。当外壳门打开以加载网格时，黑色树脂罩会保持设置的湿度水平。</li>
		<li>达到目标湿度值后，从 湿度 选项卡自动或手动维护这些值。选择 自动控制，并选择一个设置点和阈值，以保持设置点在阈值限制内选择。或者，选择 手动控制，并调整湿度水平使用两个风扇控制： 室风扇 和 罩风扇。 注意：打开室内风扇会通过左端口的过滤器拉出蒸汽，防止较大的水滴进入腔室，防止环境湿度进一步增加。只要室门保持关闭状态，湿度水平将稳定在预期百分比。打开护罩风扇将蒸汽通过右端口拉入罩中。这既减少了蒸汽释放到室内，又增加了罩内的湿度水平。</li>
	</ol></li>
	<li>将样品加载到分配器中。<ol>
<li>将每个样品的 5 μL 加入样品杯中。 注意：为了避免引入气泡，将音量非常小心地分配到杯子的内侧壁上，然后摇动下来，将样品强制到杯子底部。</li>
		<li>将样品杯加载到托盘中，取样器为左侧提示 1，右侧为提示 2。将托盘推回机器，直到其就座。</li>
		<li>在 吸气 选项卡上，选择 3 μL，以便每个提示都吸气体积。确保样品托盘已安全就位，然后单击 Aspirate 并观察移液器阶段如何将分配器头移入样品杯中。</li>
		<li>通过取出样品杯并观察液体水平下降来验证两个样品的成功愿望。</li>
		<li>在 检查 选项卡上，将每个提示发送到检查摄像机以确认畅通无阻的配药。根据需要调整振幅，以匹配每个尖端的滴状（参见第 1.2 节）。 注意：对于分配蛋白质样本的尖端，可能需要增加振幅。</li>
		<li>系统现已准备好准备示例网格。</li>
	</ol></li>
	<li>冻结示例网格<ol>
<li>将新鲜等离子清洁的网格加载到钳子中，但尚未安装钳子。确保湿度水平升高，+90-95%。装满乙烷杯。</li>
		<li>在检查摄像头前对两个尖端进行最后的试射，确认没有阻碍。在 Cryo 选项卡上，单击 "提示"到相机。</li>
		<li>装满乙烷杯。如果乙烷冰形成，根据需要用额外的乙烷气体融化。 注：步骤 2.5.4 和 2.5.5 应相对较快地完成（<20s），以最大限度地减少 （i） 纳米线在室内高湿度下饱和度，（ii） 尖端发射蛋白质样品堵塞的可能性。</li>
		<li>将带网格的钳子安装到网格舞台上。在 Cryo 选项卡上，单击 网格到相机。确保提示 1 正确定位在上部摄像机监视器中（参见步骤 1.3.4-1.3.5）。</li>
		<li>点击 Vitrify网格， 队列目标，然后 普朗格。当提示命令网格机器人将网格从乙烷跳入液氮并释放到水下搁板上时，单击 "确定 "。 注：钳子然后上升回房间。跳到液氮后，会出现提示，询问网格是否从钳子上掉落。如果它没有下降，点击 否，钳子将打开和关闭几次，以分离网格。</li>
		<li>检查网格图像（图S5），以决定是应保留还是丢弃。</li>
		<li>如果保留网格，则将其转移到预冷却网格盒。或者，发现后续网格，然后立即将所有网格传输到网格框，注意每个网格可以由其在休息区域的位置进行识别。</li>
		<li>要将网格传输到网格盒，请预先冷却细尖钳，轻轻抓住边缘的网格，并将其放入网格框插槽中，从槽左侧的第一个插槽顺时针开始。</li>
		<li>当所有网格加载时，将网格盒盖连接到盖具上，并在液氮中预热。将盖子拧到网格盒上，然后用盖子工具或预制螺丝刀拧紧。</li>
		<li>使用大钳子将封闭的网格盒快速转移到小型除战中进行成像或长期存储。</li>
	</ol></li>
	<li>评估下游 EM 成像的网格适宜性。<ol>
<li>观察在网格跳入后立即显示在 UI 左侧的上下俯冲路径摄像机的图像。使用这些图像来评估恶速、两个尖端的成功发射以及两个样品条纹的重叠程度。</li>
		<li>使用实验查看器查看器查看上下摄像机的网格图像以及机器设置和湿度测量： 报告|实验。</li>
		<li>选择电子显微镜中的成像网格，以证明良好的恶芯证据。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Berriman, J., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transient+structures+by+cryo-microscopy+combined+with+rapid+mixing+of+spray+droplets.">Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets.</a> Ultramicroscopy. 56 (4), 241-252 (1994).</li><li>Dubochet, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+pure+water+for+electron+microscopy.">Vitrification of pure water for electron microscopy.</a> Journal of microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).</li><li>White, H. D., Walker, M. L., Trinick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-controlled+spraying-freezing+apparatus+for+millisecond+time-resolution+electron+cryomicroscopy.">A computer-controlled spraying-freezing apparatus for millisecond time-resolution electron cryomicroscopy.</a> Journal of Structural Biology. 121 (3), 306-313 (1998).</li><li>White, H. D., Thirumurugan, K., Walker, M. L., Trinick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+generation+apparatus+for+time-resolved+electron+cryo-microscopy+using+stepper+motors+and+electrospray.">A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray.</a> Journal of Structural Biology. 144 (1-2), 246-252 (2003).</li><li>Kontziampasis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-EM+grid+preparation+device+for+time-resolved+structural+studies.">A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies.</a> IUCrJ. 6, 1024-1031 (2019).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-assisted+annular+microsprayer+for+sample+preparation+for+time-resolved+cryo-electron+microscopy.">Gas-assisted annular microsprayer for sample preparation for time-resolved cryo-electron microscopy.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 24 (11), 115001 (2014).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy.">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23 (6), 1097-1105 (2015).</li><li>Kaledhonkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+steps+in+bacterial+translation+initiation+visualized+using+time-resolved+cryo-EM.">Late steps in bacterial translation initiation visualized using time-resolved cryo-EM.</a> Nature. 570 (7761), 400-404 (2019).</li><li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+for+release-factor+activation+during+translation+termination+revealed+by+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy.">The structural basis for release-factor activation during translation termination revealed by time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Nature Communications. 10 (1), 2579 (2019).</li><li>M&#228;eots, M. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microfluidics+enables+kinetic+insight+from+time-resolved+cryo-EM.">Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM.</a> Nature Communications. 11 (1), 3465 (2020).</li><li>Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+cryo-electron+microscopy+using+a+microfluidic+chip.">Time-resolved cryo-electron microscopy using a microfluidic chip.</a> Methods in Molecular Biology. 1764, 59-71 (2018).</li><li>Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotiton:+a+prototype+for+an+integrated+inkjet+dispense+and+vitrification+system+for+cryo-TEM.">Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM.</a> Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).</li><li>Razinkov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+vitrifying+samples+for+cryoEM.">A new method for vitrifying samples for cryoEM.</a> Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).</li><li>Dandey, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotiton:+New+features+and+applications.">Spotiton: New features and applications.</a> Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).</li><li>Dandey, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+cryo-EM+using+Spotiton.">Time-resolved cryo-EM using Spotiton.</a> Nature Methods. 17, 897-900 (2020).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+"self-wicking"+nanowire+grids.">Optimizing "self-wicking" nanowire grids.</a> Journal of Structural Biology. 202 (2), 170-174 (2018).</li><li>Ravelli, R. B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structures+from+sub-nl+volumes+using+pin-printing+and+jet+vitrification.">Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification.</a> Nature Communications. 11 (1), 2563 (2020).</li></ol>

B.C/C.S.P.与SPT Labtech公司有商业关系，该公司生产一种基于Spotiton原型的商用仪器变色龙。

该协议概述了使用Spotiton机器人系统为低温-EM成像准备网格，这些网格携带两个样本，通常是感兴趣的蛋白质和激活配体，混合了90-500ms。虽然工作流程简单明了，但用户必须牢记一些考虑因素，以确保具有高效的网格制作会话。首先，压电分配器提示之一被堵塞或阻塞以防止其发射的情况并不少见。这样的故障将导致液体条纹，从上部或下部相机的图像捕获中看到，这明显比两个尖端发射后看到的要窄。堵塞可能是由于气泡在尖端的宿放，破坏水滴的形成，或蛋白质样品已经干涸并密封了狭窄的尖端孔。虽然在过程中丢失了吸气样品，但两个问题都可以通过超声波清洗尖端和重新吸气来解决。为了防止随后的堵塞和样品浪费，在样品吸入之前彻底（冲洗）流体线，并在腔室和罩子内保持高且一致的湿度水平至关重要。此外，浓度特别高的蛋白质样本可能会影响尖端发射，尽管湿度维护良好。虽然增加 检查 标签上的点火振幅可以部分补偿由于高蛋白质浓度导致的弱发射，但稀释样品至少1：2将改善尖端发射并避免堵塞。
其次，很难达到理想的回滑速度，即在目标混合持续时间内产生最佳厚度的冰。一般来说，更快的混合时间需要更快的芯，较慢的混合时间需要更慢的芯。对于理想中邪恶的网格，液体条纹在上部摄像机图像中清晰可见，而在下部摄像机中，只有条纹位置的网格条稍微变厚一点。下部相机图像上的暗条纹表示的慢芯通常会留下太厚而无法成像的冰。两张图像上均未出现条纹，表明快速的恶芯可能没有在孔中留下任何水（图S5）。纳米奥维尔密度、等离子体清洁设置和持续时间以及暴露在室湿度和设定水平下的时间等几个因素会影响回转速度。不良（缓慢）的恶芯可能是电网上纳米线涂层稀疏的结果。通过稍微稀释和增加接触纳米线溶液16的时间，网格条上的纳米线的密度和覆盖范围将增加，从而促进更快的回波。如果纳米奥维尔密度足够，增加等离子体清洁的功率设置或持续时间也将改善芯。此处建议的设置功率相对较低，持续时间较长，但如果需要，可能会更改。
但是，如果特定批次的网格和等离子清洁设置在前一个会话中都运行良好，则纳米线过度暴露在腔室内的高湿度下可能会产生缓慢的回吸性能，导致其水分饱和，液体保持能力降低。室湿度的网格饱和效应可以通过最小化钳子安装和网格暴跌之间的过去时间或在暴跌前降低系统湿度水平来降低。然而，应该指出的是，后者带来了相关的风险，即装有蛋白质样本的尖端会堵塞。为了抵消这种风险，将尖端保持在保持高湿度水平的罩子中，可以增加安装持有新网格的钳子的允许时间。最后，应该指出的是，减少暴跌时间（通过增加网格加速度和/或最大速度实现）可以导致网格与更薄的冰，而实际上不会改变网格的邪恶特征。但是，由于两个样本的混合时间也会减少，因此暴跌时间通常不会因处理慢速问题而改变。为了解决过快的恶行，导致冰层太薄或网格孔中缺失，可以采取与上述措施相反的措施。
与为次秒时间解决研究开发的其他技术相比，Spotiton 具有某些优点和缺点。由于混合样品条纹只包含每个分配器的 2-4 nL 液体，因此每个样品的单个 3 μL aliquot 足以准备许多网格-当样品有限时，这是一个关键优势。此外，使用集成摄像机观察样品沉积，虽然并非Spotiton17所独有，但并非其他混合装置的一个特征，它允许对下陷的网格进行粗略的通过/故障评估，大大缩短了筛选时间。该系统的一个关键缺点是，由于机械部件的物理限制，最短混合时间为90ms，这使得对更快的生物反应的审讯遥不可及。相比之下，在现有的微流体系统上，通常达到小于 10 ms 的次数。在Spotiton的基础上，市售变色龙系统，设计和施工改进已经将最低跳投时间缩短到54ms，并增加了增加第二个分配器可以比Spotiton目前提供的更快的混合时间的可能性。
迄今为止，已经进行了一系列的实验，以调查早期，短寿命分子状态使用Spotiton，包括组装70S核糖体，钙触发的构象变化在跨膜离子通道，和收缩发电机民响应GTP水解15。自这些结果公布以来，系统已进行了若干更改，以提高 Spotiton 网格制作会话的吞吐量、可重复性和报告性。其中包括双区、自动湿度监测和控制系统、实验查看器功能、并排提示检查功能以及对 UI 的几次小升级。升级后的系统将更好地支持未来的双样本混合实验，类似于之前报告的实验，以及快速结合的测定，如小分子治疗与其蛋白质靶点，甚至抗体抗原复合形成之间的分析。虽然目前和将来涉及两个交互伙伴的定时实验肯定会继续下去，但增加第三个压电分配器和相关硬件可以进一步扩大可能的实验范围。例如，洗涤剂的初始沉积，然后是感兴趣的蛋白质，然后是相互作用或激活配体，可以消除长时间接触洗涤剂的任何潜在负面影响，这通常是防止常见的次优成像结果（如首选方向）所必需的。鉴于已经发表的工作和潜在的未来应用，Spotiton 是低温-EM 社区促进进行次秒时间解决研究的重要工具。

从贝里曼和Unwin1开始，多个组已经实现了Cryo-EM在次秒时间尺度（时间解析的低温-EM）上捕获和揭示蛋白质瞬态构象状态的潜力，其技术基于杜博切特为制备低温-EM网格2而开发的标准跳动冻结方法。他们在低温杯上方添加了一个雾化剂，该雾化器使用压缩氮气将第二个样品的细雾喷洒到一个凹陷的EM网格上，其中含有第一个样品，该样品已被应用并涂抹在薄水层上。虽然该系统可以实现低至1ms的混合时间，但它仍然要求用户手动涂抹第一个样品，这是一项技术上具有挑战性的任务，第二个样品的体积相对较高。此外，在实践中，很难知道两个样品的混合在哪里发生，需要在混合样品中使用铁蛋白纳米粒子作为纤维标记。霍华德·怀特和同事随后的努力，通过将计算机控制印迹和喷洒步骤3、4，改善了这种喷洒混合方法的控制和可重复性。为了解决样品混合的程度和位置，同一组5和其他6、7、8、9、10组已经采用混合喷洒方法11，其中两个样品在注射器泵的压力下混合在狭窄的毛细管中，或在氮气驱动的微制微流体芯片中混合。这些预混系统不仅确保了完全的混合，而且使混合时间的微调能够提高时间解决研究的分辨率。
在Spotiton系统中引入压电分配器作为将样品应用于EM网格的替代方法，既实现了样品沉积的精确定位，也实现了使格栅12成为小得多的样品体积的要求。后来，使用纳米线网格和途中样品应用（"飞行"发现）消除了需要的印迹步骤，并减少了应用到病毒化时间13，14。对于此处描述的解决时间问题低温-EM的新方法，在 Spotiton 系统中添加了第二个分配器以及必要的控制硬件和软件升级，以便在前15个样本沉积后几乎立即将第二个示例传送到移动的纳米线网格中。两个重叠的样品混合在网格上，因为它们被纳米线恶搞成一层薄水，在葡萄化之前。混合时间低至90ms可以实现。本协议旨在提供实用信息，说明如何使用压电配电和纳米线网格进行时间解决实验。此外，由于硬件和软件正在修改，以提高易用性，一致性和吞吐量，此协议还作为以前报告的方法15的最新描述。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryogenic grid storage boxes</td>
			<td>EMS (Hatfield, PA; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu/Rh 300 mesh EM grids</td>
			<td>EMS (Hatfield, PA; USA)</td>
			<td>EMS300-Cu-Rh</td>
			<td>treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethane gas</td>
			<td>TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid-handling forceps</td>
			<td>EMS (Hatfield, PA; USA)</td>
			<td>78320-5B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picosystem</td>
			<td>Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>water purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein/other sample</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solarus 950 plasma cleaner</td>
			<td>Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, spotiton

捕获由早期遇到两个或两个以上相互作用的粒子触发的短寿命分子状态仍然是低温电子显微镜（Cryo-EM）领域极为关注的实验挑战。已经制定了一些方法策略来支持这些"时间解决"的研究，其中之一，Spotiton-一种新型的机器人系统，将分配皮科利特大小的样品液滴与精确的时间和空间控制相结合。时间解决的 Spotiton 工作流程提供了一种独特的高效方法，可以从最小样本量中询问早期结构重新排列。从独立控制的压电分配器发射，两个样品降落，并迅速混合在纳米线EM网格，因为它暴跌到低温。可能，仅从样品的少数微升器中即可快速连续制备数百个网格。在此，详细的 Spotiton 系统操作分步协议，重点是排除电网准备过程中出现的特定问题。

图4显示在单个时间解决的Spotiton会话中通过混合RNA聚合酶和105bDNA寡聚物在病毒化15之前携带150ms的促进器序列而准备的网格图像。图中看到的是两个高速摄像机在样品应用后在两个时间点拍摄的六个网格的高速摄像机拍摄的图像。这些相机在跳水式冰柜中独一无二，允许用户根据观察到的纳米线的起震程度以及液体样品被抽入足够薄的水层进行 EM 成像的可能性，立即决定是否保留或丢弃网格。虽然单个网格可以为完整的数据集提供足够的冰，但一旦达到最佳条件，一旦丢失或超过一个网格或被污染，多个网格就准备随时保持原位。在本会话中准备的六个网格中，图像捕获仅显示一个具有次优电芯（图 4F）。
显示的网格在一小时后 40 分钟内连续准备（步骤 2.5.1 至 2.5.8），以准备协议中描述的示例和机器（步骤 1.1.1 至 2.4.6）。在六个网格中，两个用于数据收集，其余的用于以后的分析（如果需要）。网格上的冰模式（图5C）与上部相机图像（图5B）中看到的沉积液体图案非常吻合。由于下部相机图像（图 5A）中缺少可见液体条纹，混合样品的有效恶芯沿着纳米线覆盖的网格条发生，样本很少溢出到与着陆的方块相邻的正方形中。在充满冰的正方形内，冰通常最厚，在广场中央的孔内，在靠近网格条的孔中变薄（图5E）。由于靠近纳米线（图 5F），紧邻网格条的孔通常空无一人。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig01.jpg"> 图1：时间解决的斯波蒂顿系统。 1. 操作员工作站：2. 环境室：3. 氮供应：4. 乙烷供应 5.上跳路径摄像头的背光控制 6。压电分配器控制器;7. 注射器泵;8. 真空泵;9. 洗净供水和废瓶。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig02.jpg"> 图2： Spotiton 软件用户界面 。 （A） 桌面图标和飞溅屏幕。（B） 主要UI由六个区域组成：1. 上跳路径（"上部"）和尖端检查摄像机的显示区域：2. 下跳路径（"下"）摄像机的显示区域：3. 提示检查视频的播放区域;4. 多功能选项卡区域：5. 实时湿度监测器;6. 实时系统日志文件。缩写：UI = 用户界面。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig03.jpg"> 图3： 斯波蒂顿室的内部视图 （安全定位中的机器人）。1. 网格机器人（红色）：2. 分配器机器人（黄色）：3. 上跳路径摄像头（粉红色）：4. 下跳路径摄像头（浅蓝色）：5. 提示检查相机（橙色）：6. 湿度罩（绿色）：7. 样品托盘;8. 雾化器装配（深蓝色）：9. 系统水库和水线。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig04.jpg"> 图4：代表系统相机图像从时间解决Spotiton网格制作会议。（A-F） 上（左）和下（右）俯冲路径相机图像的六个网格，其中RNA聚合酶和促进DNA序列应用使用Spotiton。缩放栏 = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig04large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig05.jpg"> 图5：在斯波蒂顿准备的网格上冰沉积模式。图4F中显示的（A）下部和（B）上部摄像机图像和（C）网格地图集的部分。样品沉积和混合产生的冰的大致位置是彩色薰衣草。广场内标有黄色箭头的区域以（E-G）为图像。（E）中显示的区域以黄色（D）包装。代表方（E）、孔（F）和（G）从（A-D）显示的网格中收集的曝光图像。方形和孔图像中的盒装区域分别对应孔和曝光图像。刻度条 = 100 μm（A-D），5 μm（E），2 μm（F），100 nm（G）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig05large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
图S1：检查尖端射击。 提示 2 射击的实时视图在用户界面左侧的上摄像头监视器中看到，而之前录制的提示 1 射击在循环中播放，以便在右侧的视频播放区域进行比较。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S1.jpg" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
图 S2：分配器尖端的超声波清洁。（A）尖端的气泡会破坏水滴的形成，防止尖端发射。（B） 浸入超声波清洗站水中的提示，以去除气泡或阻塞尖端孔的透明干蛋白。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S2.jpg" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
图 S3：在钳子中加载网格。 （A） 网格将纳米线侧放在网格块的边缘。（B） 正确定位在自闭钳子中的网格。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S3.jpg" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
图 S4：湿度跟踪器。 房间（深蓝色）和罩子（浅蓝色）的相对湿度百分比（浅蓝色），如典型的网格制作会话中记录的那样。网格暴跌（绿色正方形）的时间绘制在图表上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S4.jpg" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
图 S5： 在暴跌期间在纳米线网格上发威。 代表上部（A、C、E）及下部（B、D、F）在纳米线网格上闪烁的俯冲路径相机图像，速度太慢（A、B）、理想（C、D）及太快（E、F）。轻微变厚（白色箭头）表示带纳米线的网格条已由样品饱和。这些区域的方块通常含有适合电子微观成像的厚度的冰。缩放栏 = 500 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S5.jpg" target="_blank">请单击此处下载此文件。</a>

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Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

这里提出的协议描述了使用Spotiton，一种新型的机器人系统，将两个感兴趣的样品送到一个自吸的纳米线网格上，在液体低温素的化之前混合至少90ms。

使用新型机器人系统 Spotiton 进行时间解决研究的低温电子微观网格准备

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

使用Spotiton机器人系统，人们可以在90毫秒内与电子显微镜网格上的相互作用伙伴混合并使感兴趣的蛋白质变色。此协议允许捕获过于瞬息万变的中间蛋白确认，而标准网格制备技术无法捕获这些确认。时间解决Spotiton可以通知亚秒生物或生化系统，如膜通道活化，DNA或RNA合成，或药物或抗体与其目标蛋白的早期相互作用。用户必须同时管理直接影响网格质量的多个组件。在使用之前了解系统并耐心准备网格非常重要。首先，打开氮气供应罐上的主阀，确保系统储层充满脱气超纯水。打开多插座电源条上的计算机和 Spotiton 系统。单击桌面图标以打开 Spotiton 软件的用户界面。在工具菜单中，选择初始化阶段来初始化和将三轴机器人和旋转分配器头组件放回家，确保分配器提示在初始化和归入之前指向下。在主菜单上，单击"前往安全位置"将机器人发送到安全位置。在吸气标签上，选择 Prime 将分配器头多次冲洗到水库中的水中。继续，直到两个不间断的水流可以看到从尖端出现。在检查选项卡上，将提示一发送到检查摄像头并测试火水，调整振幅，直到产生离散液滴。按上部摄像机监视器中的"记录"按钮以录制一次发射提示的视频。将提示二发送到检查摄像机。播放右侧监视器中提示一点射击的视频，同时在上部摄像机监视器中播放提示一射击的视频，与两个分配器的滴流生产模式相匹配。使用提供的 Allen 密钥从网格机器人的安装件中取出钳子。在附近的台面上，将测试网格纳米线侧放在网格块的边缘。小心地抓住网格的边缘，并正确地将其放置在钳子中。然后重新安装钳子。在 Cryo 选项卡上，单击"提示到相机"，将提示一移到上部俯冲路径摄像头的视图区域，确保在上部摄像机监视器中选择 Live。打开并调整上部摄像机灯。通过单击监视器内的鼠标，在上部摄像机监视器中显示一个位置提示。单击"网格到相机"以将网格定位在上部摄像机前，然后在需要时再次调整一个位置的尖端。在 Cryo 选项卡上，确保未选择 Vitr 化网格，单击队列目标，然后点击 Plunge。评估上下图像，以确认分配器正常工作。将两个样品稀释到所需的浓度与适当的缓冲，理想情况下，使用相同的两个，并填补低温碗液氮。等离子体使用五瓦氢和氧气清洁三到四个纳米线网格，并以1.5分钟为起点。插入雾化器并观察蒸汽从雾化器盖的中心端口退出。在主窗口中观察实时湿度监视器，或在"报告"和"环境"下打开环境湿度跟踪器。检查房间和遮罩区的湿度水平。将每个样品的五微升添加到样品杯中。将样品杯装入托盘中，样品在左侧为提示一，右侧为提示二。然后将托盘推回机器，直到它坐下。在吸气选项卡上，选择三个微升，以便每个尖端吸气体积。确保样品托盘已安全就位，单击吸气器，并观察移液器阶段将分配器头移入样品杯中。通过取出样品杯并观察液体水平下降来验证两个样品的成功愿望。在检查选项卡上，将每个提示发送到检查摄像机以确认畅通无阻的配药。根据需要调整振幅，以匹配每个尖端的滴状。将新鲜等离子清洁的网格加载到钳子中，但尚未安装钳子。确保湿度提升到约 90 至 95% 填充乙烷杯，并在检查摄像头前对两个尖端进行最后的测试，确认没有阻碍。在 Cryo 选项卡上，单击"相机提示"。检查乙烷杯。如果乙烷冰已经形成，则根据需要用额外的乙烷气体融化。将带网格的钳子安装到网格舞台上。在 Cryo 选项卡上，单击"网格到相机"，确保提示一端正确定位在上置摄像机监视器中。单击"已电气化网格"、队列目标，然后单击"俯冲"。当提示命令网格机器人将网格从乙烷跳入液氮并释放到水下搁板上时，单击"确定"。检查网格的图像，以决定是应保留还是丢弃网格。如果保持网格，预冷细尖钳，轻轻抓住网格的边缘，并把它放入一个网格框插槽，从槽左侧的第一个插槽开始，顺时针前进。使用实验查看器通过选择报告和实验来查看和比较来自上下摄像机的网格图像以及暴跌时的机器设置和湿度测量。此处显示在单个时间解决 Spotiton 会话期间准备的网格图像，通过将 RNA 聚合酶混合在 105 个碱基对 DNA 寡聚物中，在病毒化之前携带一个促进器序列 150 毫秒。在六个网格中，只有一个显示次优的恶芯。在有光的网格上沉积冰的模式与上部摄像机图像中看到的沉积液体模式非常吻合。混合样品的有效排芯沿纳米线覆盖的网格条进行，样品很少溢出到与其着陆的方块相邻的正方形中。在充满冰的正方形中，冰通常最厚，在广场中央的孔内，在靠近网格条的孔中变得更薄。紧邻网格条的孔通常空着，因为靠近纳米线。适当准备和处理纳米线网格将确保混合样品网格的冰厚度良好。Spotiton 系统还允许用户将两个样本单独存放在单个网格上，从而能够在同一网格维护会话期间收集未混合的控件。斯波蒂顿能够实时捕获细菌基因表达中的第一批中间体。因为它们形成于次秒时间尺度上，因此它们的结构至今还不得而知。

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