Name: cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, spotiton
Uploaded: 2021-02-25T14:00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton at JoVE.com

We willen Peter A. Kahn en Terry Rohde van Engineering Arts LLC (Arizona, VS) bedanken voor het eerste ontwerp en de daaropvolgende ontwikkeling van het Spotiton-systeem. We bedanken het personeel van het Simons Electron Microscopy Center van het New York Structural Biology Center voor hulp en technische ondersteuning. Het hier gepresenteerde werk werd uitgevoerd in de National Resource for Automated Molecular Microscopy in het New York Structural Biology Center, ondersteund door subsidies van de NIH (GM103310) en de Simons Foundation (SF349247).

1. De Spotiton machine en software instellen
<ol><li>Bereid het systeem voor op de dispense(figuur 1).<ol>
<li>Open de hoofdklep van de stikstoftoevoertank. Zorg ervoor dat het systeemreservoir is gevuld met ontgast, ultraplein water. Schakel de computer in. Schakel het Spotiton-systeem in bij de multioutlet powerstrip.</li>
		<li>Klik op het bureaubladpictogram (Figuur 2A)om de gebruikersinterface (UI) van de Spotiton-software te openen(Figuur 2B). Selecteer in het menu Extra de optie Stadia initialiseren om de 3-assige robots (rastertrap en pipettrap) en de roterende dispenserkopassemblage (thetatrap) te initialiseren en thuis te zetten. Zorg ervoor dat de dispenserpunten naar beneden wijzen voordat ze worden geïnitialiseerd en ge homing.</li>
		<li>Klik in het hoofdvenster op Ga naar SafePosition om de robots naar de SafePosition te sturen(Figuur 3). OPMERKING: De overgang naar SafePosition kan worden gedaan met robots in elke positie zonder risico op botsingen.</li>
		<li>Selecteer op het tabblad Aspirate de optie Prime om de dispenserkoppen meerdere keren door te spoelen met water uit het reservoir. Ga door totdat ononderbroken waterstromen te zien zijn die uit de twee uiteinden komen. OPMERKING: Dit moet mogelijk worden herhaald als een aanzienlijk volume lucht de vloeistofleidingen binnendrong toen de uiteinden bij de laatste uitschakeling met methanol werden gespoeld.</li>
	</ol></li>
	<li>Inspecteer de prestaties van de dispenser<ol>
<li>Stuur op het tabblad Inspecteren elke tip naar de inspectiecamera om water te testen en het patroon van druppelproductie van de twee dispensers te matchen(figuur S1). OPMERKING: Als een tip niet brandt als gevolg van een bel(figuur S2A)of vuil, reinigt u de uiteinden bij het wasstation(figuur S2B)met behulp van de ultrasone wasfunctie die toegankelijk is op het tabblad Aspiraat. </li>
		<li>Pas de vuuramplitude (unitless) voor elke dispenser en monster aan om een stroom discrete druppels van consistente grootte te bereiken.</li>
		<li>Bevestig visueel de equivalente druppelproductie door de twee dispensers.<ol>
<li>Druk op de opnameknop in de bovenste cameramonitor om een video op te nemen van het afvuren van Tip 1. Speel de video af van Tip 1 die in de rechter monitor afvuurt op hetzelfde moment dat Tip 2 wordt afgevuurd in de bovenste cameramonitor(Figuur S1). OPMERKING: Video's van elke tip worden opgenomen en opgeslagen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dispensers zijn nu klaar om te testen-vuur op een rooster. OPMERKING: Dit protocol gaat ervan uit dat de juiste uitlijning van het rooster en de pipetfasen op hun respectieve duikposities is geverifieerd. Het niet bevestigen van de juiste uitlijning kan leiden tot een botsing, waardoor de tips of de robots worden beschadigd.</li>
	</ol></li>
	<li>Test-vuur water op een rooster.<ol>
<li>Zorg ervoor dat robots bij de SafePosition zijn.</li>
		<li>Verwijder het pincet van de houder op de rasterrobot met behulp van de meegeleverde inbussleutel.</li>
		<li>Plaats op een nabijgelegen tafelblad een testrooster, nanodraadzijde naar boven, aan de rand van het rasterblok. Pak voorzichtig de rand van het rooster vast, plaats het pincet correct in (figuur S3) en monteer het pincet opnieuw.</li>
		<li>Klik op het tabblad Cryo op Tip naar camera om de tips naar het gezichtsveld van de bovenste duikpadcamera(bovenste camera)te verplaatsen. Zorg ervoor dat Live is geselecteerd op de bovenste cameramonitor en dat het bovenste cameralampje is ingeschakeld (draaiknop voor de machinekast (afbeelding 1).</li>
		<li>Monteer het pincet op de rasterrobot. Plaats tip 1, zichtbaar in de bovenste cameramonitor, door met de muis in de monitor te klikken. OPMERKING: Alleen tip 1 is zichtbaar en wordt verplaatst naar de locatie van de klik.</li>
		<li>Klik op Raster naar camera om het raster voor de bovenste camera te plaatsen. Pas tip 1-positie aan zoals voorheen, indien nodig.</li>
		<li>Kies Tip1, Tip2of Tip1 en Tip2 om een of beide dispensers te selecteren om vuur te testen. OPMERKING: Wanneer u de uiteinden afzonderlijk test, gebruikt u de muis om tip 1 in de bovenste cameramonitor op verschillende laterale locaties op het raster te plaatsen. Dit deponeert vloeibare strepen van de twee uiteinden in een niet-overlappend patroon en stelt de gebruiker in staat om te bevestigen dat elke tip is geschoten.</li>
		<li>Zorg er op het tabblad Cryo voor dat Vitrify Grid niet is geselecteerd, klik op Wachtrijdoelen vervolgens op Plunge. OPMERKING: De pipettrap zal iets stijgen, gevolgd door de rastertrap. De rasterrobot stort het raster vervolgens langs de schietdispensers en bovenste en onderste camera's en komt net boven het dek tot rust. Een opname van een afbeelding van de bovenste camera wordt weergegeven boven een opname van de onderste camera aan de linkerkant van de gebruikersinterface.</li>
		<li>Evalueer de bovenste en onderste afbeeldingen: is elke tip gevuren toen deze werd geselecteerd? Wanneer ze samen werden gebakken, overlapte de vloeistof van de twee uiteinden volledig, waardoor een merkbaar dikkere streep ontstond dan wanneer ze afzonderlijk werden gebakken?<ol>
<li>Als een van beide tips niet kan worden gevuren, voer dan een of meerdere ultrasone wascycli uit totdat duidelijk vuren wordt waargenomen.</li>
			<li>Als de monsterstrips elkaar niet volledig overlappen, past u de zijdelingse uitlijning van een van de dispensers aan met behulp van een inbussleutel om de laterale stelschroef op een van de dispensers een kwart keer te draaien en een testduik uit te voeren. Herhaal dit totdat de strepen elkaar volledig overlappen. OPMERKING: Als beide tips met succes en zoals verwacht zijn afgevuurd, is het systeem klaar om monsterroosters voor te bereiden.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Bereid gemengde roosters met twee monsters
<ol><li>Werk de versnellings-, vertragings- en snelheidswaarden in het XML-bestand Machineparameters bij om de mengtijd van belang te bereiken. OPMERKING: Tabellen die deze waarden correleren met mengtijden zijn eerder gemeld15.</li>
	<li>Maak het monster en de rasters klaar. OPMERKING: Vanaf dit punt in het protocol verstrijkt 20-30 minuten voordat het eerste raster wordt voorbereid en moeten monsters gedurende dit tijdsinterval op een geschikte temperatuur worden bewaard.<ol>
<li>Verdun twee monsters (d.w.z. eiwit en ligand of een andere interagerende partner) tot de gewenste concentraties met een geschikte buffer, idealiter hetzelfde voor beide. OPMERKING: Spotiton-roosters vereisen 1,5-2 keer hogere concentraties eiwit dan meestal wordt gebruikt voor automatische dompelvriezers. Dit kan te wijten zijn aan de minimale tijd die het eiwit tijdens een duik in een dunne waterige laag op het rasteroppervlak doorbrengt, waardoor deeltjes minder gelegenheid hebben om zich te concentreren op het lucht-water-grensvlak.</li>
		<li>Vul de cryogene kom met vloeibare stikstof.</li>
		<li>Plasma reinigen 3-4 nanodraad roosters. Gebruik 5 W, waterstof en zuurstof, 1,5 min als uitgangspunt. OPMERKING: De meest effectieve plasmareinigingsduur en recept kan van dag tot dag veranderen op basis van omgevingstemperatuur en vochtigheid en de gebruikte partij nanodraadroosters. Alternatieve gasmengsels of een gloedafscheider kunnen ook effectief zijn, maar zijn niet voor dit doel getest. Omdat water en eiwit in bufferoplossing vaak met verschillende snelheden door nanodraden worden ontvoerd, is het het beste om de afvoer van de roosters te evalueren die die dag moeten worden gebruikt bij een duik waarin het eigenlijke monster wordt opgegeven.</li>
	</ol></li>
	<li>Stel de vochtigheidsgraad in het systeem in. OPMERKING: Naast de omstandigheden die worden gebruikt om de roosters te reinigen en plasma te reinigen, is vochtigheid een andere primaire factor die van invloed is op de afvoersnelheid van nanodraadroosters. Hoewel het streefpercentage vochtigheid voor een bepaalde sessie empirisch wordt bepaald voor elke dag en batch roosters, is 90-95% een goed startpunt.<ol>
<li>Zorg ervoor dat de vernevelaar voldoende gevuld is met ultrapijn water. Sluit de vernevelaar aan en observeer de damp die de centrale poort op de verneveldingsdop verlaat.</li>
		<li>Observeer de live vochtigheidsmonitor in het hoofdvenster of open de omgevingsvochtigheidstracker onder Rapporten | Omgevingstemperatuur (figuur S4). Controleer de luchtvochtigheid in de twee zones: Kamer en Lijkwade. OPMERKING: Kamer omvat alle gebieden binnen de Spotiton-behuizing. Shroud is het gebied dat onmiddellijk de "at camera" -posities van het rooster en de dispensertips omvat. De zwarte harsmantel handhaaft de ingestelde vochtigheidsgraad wanneer de behuizingsdeuren worden geopend om een rooster te laden.</li>
		<li>Zodra de streefwaarden voor vochtigheid zijn bereikt, handhaaft u deze waarden automatisch of handmatig vanaf het tabblad Vochtigheid. Selecteer Automatisch besturingselementen kies een instelpunt en drempelwaarde om het instelpunt binnen de gekozen drempelwaarde te houden. U kunt ook Handmatige bedieningselecteren en de vochtigheidsgraad aanpassen met behulp van de twee ventilatorregelaars: kamerventilator en lijkwadeventilator. OPMERKING: Als u de kamerventilator inschakelt, wordt de damp door een filter in de linkerpoort getrokken en wordt voorkomen dat grotere waterdruppels de kamer binnenkomen, waardoor een verdere toename van de omgevingsvochtigheid wordt voorkomen. Zolang de kamerdeuren gesloten blijven, stabiliseert de luchtvochtigheid zich op het gewenste percentage. Als u de lijkwadeventilator inschakelt, wordt de damp door de rechterpoort in de lijkwade getrokken. Dit vermindert zowel de dampafgifte in de kamer als verhoogt de luchtvochtigheid in de lijkwade.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats het monster in de dispensers.<ol>
<li>Voeg 5 μL van elk monster toe aan de monsterbekers. OPMERKING: Om te voorkomen dat er bubbels worden geïntroduceerd, geeft u het volume heel voorzichtig af op de binnenste zijwand van de beker en schudt u vervolgens naar beneden om het monster naar de bodem van de beker te dwingen.</li>
		<li>Plaats de monsterbekers in de opberglade, het monster voor tip 1 aan de linkerkant en voor tip 2 aan de rechterkant. Duw de lade terug in het apparaat totdat deze zit.</li>
		<li>Selecteer op het tabblad Aspiraat 3 μL voor het volume dat door elke punt moet worden aangezogen. Zorg ervoor dat de monsterlade goed is geplaatst, klik vervolgens op Aspirate en observeer hoe de pipettrap de dispenserkoppen in de monsterbekers beweegt.</li>
		<li>Controleer de succesvolle aspiratie van beide monsters door de monsterbekers te verwijderen en een daling van het vloeistofniveau te observeren.</li>
		<li>Stuur op het tabblad Inspecteren elke tip naar de inspectiecamera om de onbelemmerde afgifte te bevestigen. Pas de amplitude zo nodig aan om de druppelvorming van elke punt te evenaren (zie rubriek 1.2). OPMERKING: Amplitude moet waarschijnlijk worden verhoogd voor de punt die het eiwitmonster afgeeft.</li>
		<li>Het systeem is nu klaar om een monsterrooster voor te bereiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbeeldrasters bevriezen<ol>
<li>Laad een vers plasma gereinigd rooster in het pincet, maar monteer het pincet nog niet. Zorg ervoor dat de luchtvochtigheid verhoogd is, ~ 90-95%. Vul de ethaanbeker.</li>
		<li>Voer een laatste test-fire van beide tips uit voor de inspectiecamera, waarbij wordt bevestigd dat er geen obstakels zijn. Klik op het tabblad Cryo op Tip naar camera.</li>
		<li>Vul ethaanbeker. Als ethaanijs zich vormt, smelt dan indien nodig met extra ethaangas. OPMERKING: Stap 2.5.4 en 2.5.5 moeten relatief snel worden voltooid (<20 s) om (i) verzadiging van de nanodraden in de hoge luchtvochtigheid van de kamer te minimaliseren en (ii) de waarschijnlijkheid dat de punt die het eiwitmonster afvuurt, verstopt raakt.</li>
		<li>Monteer het pincet met het rooster op de rastertrap. Klik op het tabblad Cryo op Raster naar camera. Zorg ervoor dat tip 1 correct is geplaatst in de bovenste cameramonitor (zie stappen 1.3.4-1.3.5).</li>
		<li>Klik op Vitrify Grid, Queue Targeten vervolgens plunge. Klik op OK wanneer u wordt gevraagd de rasterrobot opdracht te geven om het raster van ethaan in vloeibare stikstof te hoppen en op de ondergedompelde plank vrij te geven. OPMERKING: Het pincet stijgt dan terug in de kamer. Na de hop naar vloeibare stikstof verschijnt er een prompt met de vraag of het rooster uit het pincet is gevallen. Als het niet is gedaald, klikt u op Neeen het pincet gaat meerdere keren open en dicht om het rooster los te maken.</li>
		<li>Onderzoek afbeeldingen van het raster (figuur S5) om te beslissen of het moet worden bewaard of weggegooid.</li>
		<li>Als u het rooster bewaart, breng het dan over naar de voorgekoelde rasterdoos. U kunt ook volgende rasters plaatsen en vervolgens alle rasters tegelijk overbrengen naar de rasterbox, waarbij u ervoor zorgt dat elk raster kan worden geïdentificeerd aan de lichting op zijn positie in het rustgebied.</li>
		<li>Om het raster over te brengen naar een rasterdoos, koelt u de tang met fijne punt vooraf af, pakt u het raster voorzichtig bij de rand vast en plaatst u het in een rastervaksleuf, te beginnen met de eerste sleuf links van de inkeping met de klok mee.</li>
		<li>Wanneer alle roosters zijn geladen, bevestigt u het deksel van de roosterdoos aan het dekselgereedschap en koelt u voor in vloeibare stikstof. Schroef het deksel op de roosterdoos en draai vast met een dekselgereedschap of een voorgekoelde schroevendraaier.</li>
		<li>Gebruik een grote tang om de gesloten rasterdoos snel over te brengen naar een kleine dewar voor beeldvorming of langdurige opslag.</li>
	</ol></li>
	<li>Evalueer de geschiktheid van het raster voor downstream EM-beeldvorming.<ol>
<li>Bekijk de beelden van de bovenste en onderste duikpadcamera's die aan de linkerkant van de gebruikersinterface worden weergegeven onmiddellijk nadat een raster is gedompeld. Gebruik deze afbeeldingen om de vochtafvoersnelheid, het succesvol afvuren van beide uiteinden en de mate van overlap van de twee monstersstrepen te evalueren.</li>
		<li>Bekijk en vergelijk de rasterbeelden van de bovenste en onderste camera's samen met de machine-instellingen en vochtigheidsmetingen op het moment van de duik met behulp van de experimentviewer: Rapporten | Experimenteer.</li>
		<li>Selecteer rasters voor beeldvorming in de elektronenmicroscoop die bewijs van goede wicking aantonen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Berriman, J., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transient+structures+by+cryo-microscopy+combined+with+rapid+mixing+of+spray+droplets.">Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets.</a> Ultramicroscopy. 56 (4), 241-252 (1994).</li><li>Dubochet, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+pure+water+for+electron+microscopy.">Vitrification of pure water for electron microscopy.</a> Journal of microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).</li><li>White, H. D., Walker, M. L., Trinick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-controlled+spraying-freezing+apparatus+for+millisecond+time-resolution+electron+cryomicroscopy.">A computer-controlled spraying-freezing apparatus for millisecond time-resolution electron cryomicroscopy.</a> Journal of Structural Biology. 121 (3), 306-313 (1998).</li><li>White, H. D., Thirumurugan, K., Walker, M. L., Trinick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+generation+apparatus+for+time-resolved+electron+cryo-microscopy+using+stepper+motors+and+electrospray.">A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray.</a> Journal of Structural Biology. 144 (1-2), 246-252 (2003).</li><li>Kontziampasis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-EM+grid+preparation+device+for+time-resolved+structural+studies.">A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies.</a> IUCrJ. 6, 1024-1031 (2019).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-assisted+annular+microsprayer+for+sample+preparation+for+time-resolved+cryo-electron+microscopy.">Gas-assisted annular microsprayer for sample preparation for time-resolved cryo-electron microscopy.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 24 (11), 115001 (2014).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy.">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23 (6), 1097-1105 (2015).</li><li>Kaledhonkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+steps+in+bacterial+translation+initiation+visualized+using+time-resolved+cryo-EM.">Late steps in bacterial translation initiation visualized using time-resolved cryo-EM.</a> Nature. 570 (7761), 400-404 (2019).</li><li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+for+release-factor+activation+during+translation+termination+revealed+by+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy.">The structural basis for release-factor activation during translation termination revealed by time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Nature Communications. 10 (1), 2579 (2019).</li><li>M&#228;eots, M. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microfluidics+enables+kinetic+insight+from+time-resolved+cryo-EM.">Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM.</a> Nature Communications. 11 (1), 3465 (2020).</li><li>Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+cryo-electron+microscopy+using+a+microfluidic+chip.">Time-resolved cryo-electron microscopy using a microfluidic chip.</a> Methods in Molecular Biology. 1764, 59-71 (2018).</li><li>Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotiton:+a+prototype+for+an+integrated+inkjet+dispense+and+vitrification+system+for+cryo-TEM.">Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM.</a> Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).</li><li>Razinkov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+vitrifying+samples+for+cryoEM.">A new method for vitrifying samples for cryoEM.</a> Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).</li><li>Dandey, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotiton:+New+features+and+applications.">Spotiton: New features and applications.</a> Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).</li><li>Dandey, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+cryo-EM+using+Spotiton.">Time-resolved cryo-EM using Spotiton.</a> Nature Methods. 17, 897-900 (2020).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+"self-wicking"+nanowire+grids.">Optimizing "self-wicking" nanowire grids.</a> Journal of Structural Biology. 202 (2), 170-174 (2018).</li><li>Ravelli, R. B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structures+from+sub-nl+volumes+using+pin-printing+and+jet+vitrification.">Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification.</a> Nature Communications. 11 (1), 2563 (2020).</li></ol>

B.C./C.S.P. hebben een commerciële relatie met SPT Labtech, een bedrijf dat een commercieel verkrijgbaar instrument produceert, chameleon, dat is gebaseerd op het Spotiton prototype.

Dit protocol schetst het gebruik van het Spotiton-robotsysteem om rasters voor cryo-EM-beeldvorming voor te bereiden die twee monsters dragen, over het algemeen een eiwit van belang en een activerend ligand, die gedurende 90-500 ms zijn gemengd. Hoewel de workflow eenvoudig is, zijn er een paar overwegingen die de gebruiker in gedachten moet houden om een productieve sessie voor het maken van rasters te garanderen. Ten eerste is het niet ongebruikelijk dat een van de piëzo-elektrische dispensertips verstopt raakt of geblokkeerd raakt, waardoor deze niet kan vuren. Zo'n storing zal resulteren in een vloeibare streep, te zien op beeldopnamen van de bovenste of onderste camera, die zichtbaar smaller is dan die gezien nadat beide tips zijn afgevuurd. Een verstopping kan het gevolg zijn van een luchtbel in de punt, waardoor de vorming van druppels wordt verstoord, of van eiwitmonster dat is uitgedroogd en de smalle puntopening heeft afgesloten. Hoewel het aangezogen monster tijdens het proces verloren gaat, kunnen beide problemen worden opgelost door een ultrasone wassing van de uiteinden en heraspiratie van het monster. Om daaropvolgende verstopping en monsterverspilling te voorkomen, is het van cruciaal belang om de vloeistofleidingen grondig te primen (spoelen) voorafgaand aan de monsteraspiratie en om een hoge en consistente luchtvochtigheid in de kamer en de lijkwade te handhaven. Bovendien kan een eiwitmonster met een bijzonder hoge concentratie het bakken van de punt beïnvloeden, ondanks een goed onderhouden vochtigheid. Hoewel het verhogen van de stookamplitude op het tabblad Inspect gedeeltelijk kan compenseren voor zwak vuren als gevolg van een hoge eiwitconcentratie, zal het verdunn van het monster ten minste 1: 2 het bakken van de punt verbeteren en verstopping voorkomen.
Ten tweede kan het moeilijk zijn om de ideale afvoersnelheid te bereiken die nodig is om ijs van optimale dikte te genereren voor de beoogde mengduur. Over het algemeen vereisen snellere mengtijden een snellere afvoer, langzamere mengtijden vereisen een langzamere afvoer. Voor het idealiter slechte raster is een vloeibare streep duidelijk waarneembaar in het bovenste camerabeeld, terwijl in de onderste camera slechts een zeer lichte verdikking van de rasterbalken op de locatie van de streep zichtbaar blijft. Langzame wicking, aangegeven door een donkere streep op het onderste camerabeeld, laat over het algemeen ijs achter dat te dik is voor beeldvorming. Afwezigheid van een streep op beide afbeeldingen duidt op een snelle afvoer die mogelijk geen water in de gaten heeft achtergelaten(figuur S5). Verschillende factoren zoals nanodraaddichtheid, plasmareinigingsinstellingen en -duur en tijd van blootstelling aan en ingestelde kamervochtigheid kunnen de afvoersnelheid beïnvloeden. Slechte (langzame) afvoer kan het gevolg zijn van een schaarse coating van nanodraden op het rooster. Door de tijd van blootstelling aan de nanodraadoplossing licht te verdunnen en te verlengen16, zal de dichtheid en dekking van nanodraden op de roosterbalken toenemen, waardoor snellere afvoer mogelijk wordt. Als de nanodraaddichtheid voldoende is, zal het verhogen van de wattage-instelling of de duur van plasmareiniging ook de afvoer verbeteren. De instellingen die hier worden aanbevolen, zijn relatief laag vermogen en lange duur, maar kunnen indien nodig worden gewijzigd.
Als echter zowel de specifieke batch roosters als plasmareinigingsinstellingen goed hebben gewerkt in een eerdere sessie, kunnen langzame afvoerprestaties het gevolg zijn van overmatige blootstelling van de nanodraden aan een hoge luchtvochtigheid in de kamer, wat leidt tot hun verzadiging met vocht en verminderde vloeistofvasthoudende capaciteit. Het rasterverzadigende effect van de luchtvochtigheid in de kamer kan worden verminderd door de verstreken tijd tussen pincetmontage en roosterduiken te minimaliseren of door de luchtvochtigheid van het systeem voorafgaand aan een duik te verlagen. Opgemerkt moet echter worden dat dit laatste het bijbehorende risico met zich meebrengt dat de tip geladen met eiwitmonster verstopt zal zijn. Om dit risico te compenseren, kan het vasthouden van de uiteinden in de lijkwade waar een hoge luchtvochtigheid wordt gehandhaafd, de toegestane hoeveelheid tijd verlengen om een pincet te monteren met een nieuw rooster. Ten slotte moet worden opgemerkt dat een kortere duiktijd (bereikt door het verhogen van de netversnelling en / of maximale snelheid) kan resulteren in rasters met dunner ijs zonder de afvoerkarakteristieken van het raster daadwerkelijk te veranderen. Omdat de mengtijd van de twee monsters echter ook zal worden verkort, is de duiktijd geen factor die meestal wordt gewijzigd om langzame wicking aan te pakken. Om de afvoer aan te pakken die te snel is, met ijs tot gevolg dat te dun of afwezig is in de roostergaten, kan het tegenovergestelde van de hierboven geschetste maatregelen worden genomen.
Spotiton presenteert bepaalde voor- en nadelen in vergelijking met andere technieken die zijn ontwikkeld voor subseconde tijd-opgeloste studies. Aangezien de gemengde monsterstreep slechts 2-4 nL vloeistof uit elke dispenser bevat, is een enkele aliquot van 3 μL van elk monster voldoende om veel roosters te bereiden - een belangrijk voordeel wanneer het monster beperkt is. Bovendien is observatie van monsterafzetting met behulp van geïntegreerde camera's, hoewel niet helemaal uniek voor Spotiton17,geen kenmerk van andere mengapparaten en maakt het mogelijk om ondergedompelde roosters te onderwerpen aan een ruwe pass / fail-evaluatie, waardoor de screeningstijd aanzienlijk wordt verkort. Een belangrijk nadeel van het systeem is een minimale mengtijd van 90 ms, beperkt door de fysieke beperkingen van de mechanische componenten, waardoor het ondervragen van snellere biologische reacties buiten bereik is. Ter vergelijking: tijden minder dan 10 ms worden routinematig bereikt op bestaande microfluïdische systemen. Op het op Spotiton gebaseerde, in de handel verkrijgbare kameleonsysteem hebben ontwerp- en constructieverbeteringen de minimale duiktijd teruggebracht tot 54 ms en de mogelijkheid vergroten dat toevoeging van een tweede dispenser snellere mengtijden mogelijk zou kunnen maken dan Spotiton momenteel kan bieden.
Tot op heden is een reeks experimenten uitgevoerd om vroege, kortstondige moleculaire toestanden te onderzoeken met behulp van Spotiton, waaronder assemblage van het 70S-ribosoom, calcium-geactiveerde conformatieveranderingen in een transmembraanionkanaal en vernauwing van dynamin als reactie op GTP-hydrolyse15. Sinds de publicatie van deze resultaten zijn er verschillende wijzigingen in het systeem aangebracht om de doorvoer, reproduceerbaarheid en rapportage van Spotiton-rastersessies te verbeteren. Deze omvatten onder andere het dual-zone, automatische vochtigheidsbewakings- en besturingssysteem, de experiment viewer-functie, de side-by-side tip inspectiefunctie en verschillende kleine upgrades voor de gebruikersinterface. Het verbeterde systeem zal toekomstige mengexperimenten met twee monsters beter ondersteunen die vergelijkbaar zijn met die eerder gerapporteerd, evenals snelle bindingstests, zoals tussen een therapeutisch klein molecuul en zijn eiwitdoel of zelfs de vorming van antilichaam-antigeencomplex. Hoewel de huidige en toekomstige tijd-opgeloste experimenten met twee samenwerkende partners zeker zullen doorgaan, zou de toevoeging van een derde piëzo-elektrische dispenser en bijbehorende hardware het scala aan mogelijke experimenten verder kunnen verbreden. Bijvoorbeeld, de eerste afzetting van een detergens gevolgd door het eiwit van belang, gevolgd door het interagerende of activerende ligand kan elk potentieel negatief effect van langdurige blootstelling aan het detergens wegnemen, vaak nodig om gemeenschappelijke suboptimale beeldvormingsresultaten zoals voorkeursoriëntatie te voorkomen. In het licht van zowel het reeds gepubliceerde werk als mogelijke toekomstige toepassingen, vertegenwoordigt Spotiton een belangrijk hulpmiddel voor de cryo-EM-gemeenschap om het uitvoeren van subseconde tijd-opgeloste studies te vergemakkelijken.

Het potentieel voor cryo-EM om voorbijgaande conformatietoestanden van eiwitten op de subseconde tijdschaal (tijd-opgeloste cryo-EM) vast te leggen en te onthullen, is gerealiseerd door verschillende groepen, te beginnen met Berriman en Unwin1, waarvan de techniek is gebaseerd op de standaard plunge freezing-methode ontwikkeld door Dubochet voor het bereiden van cryo-EM-rasters2. Ze voegden een verstuiver toe net boven de cryogene beker die samengeperst stikstofgas gebruikte om een fijne nevel van een tweede monster op een kelderend EM-rooster te spuiten met een eerste monster dat was aangebracht en uitgeveegd op een dunne waterige laag. Hoewel dit systeem mengtijden tot 1 ms kon bereiken, vereiste het nog steeds handmatige vloeiing van het eerste monster door de gebruiker - een technisch uitdagende taak - en een relatief hoog volume van het tweede monster. Bovendien was het in de praktijk moeilijk om te weten waar vermenging van de twee monsters had plaatsgevonden, waardoor ferritine nanodeeltjes als fiduciële marker in het gemengde monster moesten worden gebruikt. Latere inspanningen van Howard White en collega's verbeterden de controle en reproduceerbaarheid van deze spuit-mengbenadering door computerbesturing van de devlott- en spuitstappen3,4opte nemen. Om aan te pakken hoe goed en waar de monsters mengen, zijn dezelfde groep5 en anderen6,7,8,9,10 overgestapt op een meng-spuitbenadering11 waarbij twee monsters worden gemengd in smalle capillaire buizen onder druk van spuitpompen of in microgefabriceerde, microfluïdische chips aangedreven door stikstofgas. Deze voormengsystemen zorgen niet alleen voor een volledige menging, maar maken ook de fijnafstelling van mengtijden mogelijk om de resolutie van tijdsgeo opgeloste studies te verhogen.
De introductie van piëzo-elektrische dispensers als een alternatieve manier om monsters toe te passen op EM-rasters in het Spotiton-systeem maakte zowel de precieze targeting van monsterdepositie mogelijk als de vereiste van een veel kleiner monstervolume om een raster te maken12. Later nam het gebruik van nanodraadroosters en en-route monstertoepassing ("on-the-fly" spotting) de noodzaak van een blotting-stap weg en verminderde toepassing-naar-vitrificatietijden13,14. Voor de nieuwe benadering van tijd-opgeloste cryo-EM die hier wordt beschreven, werd een tweede dispenser samen met de nodige besturingshardware en software-upgrades toegevoegd aan het Spotiton-systeem om de levering van een tweede monster op een bewegend nanodraadraster vrijwel onmiddellijk na afzetting van de eerste15mogelijk te maken . De twee overlappende monsters mengen zich op het rooster omdat ze door de nanodraden in een dunne waterige laag worden gebracht voorafgaand aan vitrificatie. Mengtijden zo laag als 90 ms kunnen worden bereikt. Dit protocol is bedoeld om praktische informatie te verstrekken over het uitvoeren van tijd-opgeloste experimenten met behulp van piëzo-elektrische dispensing en nanodraadroosters. Aangezien de hardware en software worden aangepast om het gebruiksgemak, de consistentie en de doorvoer te verbeteren, dient dit protocol ook als een up-to-date beschrijving van de eerder gerapporteerde methode15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryogenic grid storage boxes</td>
			<td>EMS (Hatfield, PA; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu/Rh 300 mesh EM grids</td>
			<td>EMS (Hatfield, PA; USA)</td>
			<td>EMS300-Cu-Rh</td>
			<td>treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethane gas</td>
			<td>TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid-handling forceps</td>
			<td>EMS (Hatfield, PA; USA)</td>
			<td>78320-5B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picosystem</td>
			<td>Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>water purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein/other sample</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solarus 950 plasma cleaner</td>
			<td>Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, spotiton

Het vastleggen van kortstondige moleculaire toestanden veroorzaakt door de vroege ontmoeting van twee of meer interagerende deeltjes blijft een experimentele uitdaging van groot belang voor het gebied van cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM). Er zijn een paar methodologische strategieën ontwikkeld die deze "tijd-opgeloste" studies ondersteunen, waarvan er één, Spotiton - een nieuw robotsysteem - de afgifte van picoliter-sized monsterdruppels combineert met nauwkeurige temporele en ruimtelijke controle. De tijd-opgeloste Spotiton-workflow biedt een unieke efficiënte aanpak om vroege structurele herschikkingen te ondervragen vanuit een minimaal monstervolume. Gebakken vanuit onafhankelijk gecontroleerde piëzo-elektrische dispensers, landen twee monsters en mengen zich snel op een nanodraad EM-raster terwijl het naar het cryogene water stort. Mogelijk kunnen honderden roosters snel achter elkaar worden bereid uit slechts enkele microliters van een monster. Hier wordt een gedetailleerd stap-voor-stap protocol van de werking van het Spotiton-systeem gepresenteerd met een focus op het oplossen van specifieke problemen die zich voordoen tijdens de voorbereiding van het net.

Figuur 4 toont beelden van rasters die tijdens een enkele tijd-opgeloste Spotiton-sessie zijn voorbereid door RNA-polymerase en een 105 bp DNA-oligomeer te mengen met een promotorsequentie gedurende 150 ms voorafgaand aan vitrificatie15. In de figuur zijn beelden te zien die zijn gemaakt door de twee hogesnelheidscamera's van zes rasters op twee tijdstippen na monstertoepassing. Deze camera's, uniek onder de vriezers in plunge-stijl, stellen de gebruiker in staat om onmiddellijk te beslissen of hij een raster wil behouden of weggooien op basis van de waargenomen mate van wicking door de nanodraden en de waarschijnlijkheid dat de vloeibare monsters in een waterige laag zijn getrokken die dun genoeg is voor EM-beeldvorming. Hoewel een enkel raster voldoende ijs kan leveren voor een volledige dataset, zijn, zodra optimale omstandigheden zijn bereikt, verschillende rasters voorbereid om bij de hand te houden in het geval dat een of meer verloren gaan of verontreinigd zijn. Van de zes rasters die in deze sessie zijn voorbereid, tonen de beeldopnamen er slechts één met suboptimale afvoer(figuur 4F).
De getoonde roosters werden (stappen 2.5.1 tot en met 2.5.8) na elkaar voorbereid gedurende een periode van 40 minuten na een uur om de monsters en de machine klaar te maken zoals beschreven in het protocol (stappen 1.1.1 tot en met 2.4.6). Van de zes rasters werden er twee gebruikt voor het verzamelen van gegevens en de rest werd opgeslagen voor latere analyse indien nodig. Het patroon van ijs op een verglaasd raster (figuur 5C) komt nauw overeen met het patroon van afgezette vloeistof dat te zien is in het bovenste camerabeeld (figuur 5B). Effectieve afvoer van de gemengde monsters, duidelijk gemaakt door het ontbreken van een zichtbare vloeistofstreep in het onderste camerabeeld (figuur 5A), vindt plaats langs de met nanodraad bedekte rasterbalken en het monster stroomt zelden over in vierkanten naast die waarin het landde. Binnen met ijs gevulde vierkanten is het ijs meestal het dikst in gaten in het midden van het vierkant en wordt het dunner in gaten dichter bij de rasterbalken (Figuur 5E). Vaak zijn gaten direct naast de rasterbalken leeg door de nabijheid van de nanodraden(figuur 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig01.jpg"> Figuur 1: Het tijd-opgeloste Spotiton systeem. 1. De werkplek van de exploitant; 2. Milieukamer; 3. Stikstofvoorziening; 4. Ethaanvoorziening 5. Backlight controle voor bovenste duikpad camera 6. Piëzo-elektrische dispenserregelaars; 7. Spuitpompen; 8. Vacuümpomp; 9. Waswatervoorziening en afvalflessen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig02.jpg"> Figuur 2: Spotiton software user interface. (A) Bureaublad pictogram en welkomstscherm. (B)De hoofdgebruikersinterface bestaat uit zes gebieden: 1. weergavegebied voor bovenste duikpad ("bovenste") en tipinspectiecamera's; 2. weergavegebied voor lagere duikpad ("lagere") camera; 3. Afspeelgebied voor tipinspectievideo's; 4. Multifunctioneel tabbladgebied; 5. Live vochtigheidsmonitor; 6. Live systeemlogbestand. Afkorting: UI = user interface. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig03.jpg"> Figuur 3: Binnenaanzicht van Spotiton kamer (robots in SafePosition). 1. Grid robot (rood); 2. Dispenser robot (geel); 3. Bovenste duikpadcamera (roze); 4. Onderste duikpad camera (lichtblauw); 5. Tip inspectie camera (oranje); 6. Vochtigheidsmantel (groen); 7. monsterlade; 8. Vernevelaar montage (donkerblauw); 9. Systeemreservoir en waterleidingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig04.jpg"> Figuur 4: Representatieve systeemcamerabeelden van een tijdsopoeste Spotiton-rastersessie. (Een -F) Bovenste (links) en onderste (rechts) plunge path camerabeelden van zes rasters waarop RNA polymerase en een promotor DNA-sequentie werden aangebracht met behulp van Spotiton. Schaalbalk = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig05.jpg"> Figuur 5: Patroon van ijsafzetting op een door Spotiton geprepareerd raster. Delen van de (A) onderste en (B) bovenste camerabeelden en (C) atlas van het raster weergegeven in figuur 4F. Geschatte locaties van ijs als gevolg van monsterafzetting en mengen zijn gekleurde lavendel. Gebieden binnen het vierkant gemarkeerd met een gele pijlpunt zijn afgebeeld in (E-G). Het gebied dat in (E) wordt weergegeven, is geel ingepakt in (D). Representatieve vierkants- (E), gat (F) en (G) belichtingsbeelden verzameld uit het raster weergegeven in (A-D). De ingepakte gebieden in de vierkante en holeafbeeldingen komen overeen met respectievelijk de hole- en belichtingsafbeeldingen. Schaalstaven = 100 μm (A-D), 5 μm (E), 2 μm (F), 100 nm (G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Figuur S1: Inspectie van het stoken van de punt. Een live weergave van Tip 2-afvuren is te zien in de bovenste cameramonitor aan de linkerkant van de gebruikersinterface, terwijl een opname die eerder is gemaakt van Tip 1-afvuren wordt afgespeeld op een lus ter vergelijking in het videoweergavegebied aan de rechterkant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S1.jpg" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Figuur S2: Ultrasoon reinigen van dispensertips. Een luchtbel in de (A) punt zal de druppelvorming verstoren en tipvuren voorkomen. (B)Tips ondergedompeld in water bij het ultrasone reinigingsstation om een luchtbel of helder gedroogd eiwit te verwijderen dat de tipopening blokkeert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S2.jpg" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Figuur S3: Laadrooster in pincet. (A) Een raster geplaatst nanodraadzijde omhoog op de rand van het rasterblok. (B) Een rooster dat correct in het zelfsluitende pincet is geplaatst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S3.jpg" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Figuur S4: Vochtigheid tracker. Het percentage relatieve vochtigheid in de kamer (donkerblauw) en lijkwade (lichtblauw) zoals geregistreerd tijdens een typische rastersessie. De tijden van rasterduiken (groene vierkanten) zijn uitgezet op de grafiek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S4.jpg" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Figuur S5: Wicking op nanodraadroosters tijdens een duik. Representatieve bovenste (A, C, E) en onderste (B, D, F) dompelpad camerabeelden van wicking op nanodraadroosters die te langzaam (A, B), ideaal (C, D) en te snel (E, F) is. Een lichte verdikking (witte pijlpunten) duidt op rasterbalken met nanodraden die verzadigd zijn door monster. Vierkanten in deze regio's bevatten meestal ijs van de juiste dikte voor elektronenmicroscopische beeldvorming. Schaalbalk = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S5.jpg" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton at JoVE.com

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van Spotiton, een nieuw robotsysteem, om twee interessante monsters af te leveren op een zelfafvoerend nanodraadrooster dat zich minimaal 90 ms mengt voorafgaand aan vitrificatie in vloeibaar cryogeen.

Cryo-Elektron Microscopische Rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste studies met behulp van een nieuw robotsysteem, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Met behulp van het Spotiton-robotsysteem kan men een interessant eiwit mengen en vitrificeren met een interagerende partner op een elektronenmicroscoopraster in slechts 90 milliseconden. Dit protocol maakt het mogelijk om tussenliggende eiwitbevestigingen vast te leggen die te vergankelijk zijn om te worden vastgelegd met standaard rastervoorbereidingstechnieken. Time resolved Spotiton kan sub-seconde biologische of biochemische systemen informeren, zoals membraankanaalactivatie, DNA- of RNA-synthese, of vroege interactie van een geneesmiddel of antilichaam met zijn doeleiwit.De gebruiker moet tegelijkertijd verschillende componenten beheren die rechtstreeks van invloed zijn op de kwaliteit van een raster. Het is belangrijk om het systeem te begrijpen voordat u het gebruikt en geduld te hebben bij het voorbereiden van rasters. Open om te beginnen de hoofdklep op de stikstoftoevoertank en zorg ervoor dat het systeemreservoir wordt gevuld met ontgast ultrapijn water.Schakel de computer en het Spotiton-systeem in bij de stekkerdoos met meerdere stopcontacten. Klik op het bureaubladpictogram om de gebruikersinterface van de Spotiton-software te openen. Selecteer in het menu Extra de optie Stadia initialiseren om de drieassige robots en roterende dispenserkopassemblage te initialiseren en te huiselen, zodat de dispenserpunten naar beneden wijzen voordat ze worden geïnitialiseerd en gehuldigd.Klik in het hoofdmenu op Ga naar veilige positie om de robots naar de veilige positie te sturen. Selecteer op het tabblad Aspirate de optie Prime om de dispenserkoppen meerdere keren door te spoelen met water uit het reservoir. Ga door totdat er twee ononderbroken stromen water te zien zijn die uit de uiteinden komen.Stuur op het tabblad Inspecteren tip één naar de inspectiecamera en test het bluswater, waarbij u de amplitude aanpast totdat discrete druppels worden geproduceerd. Druk op de opnameknop in de bovenste cameramonitor om een video op te nemen van het afvuren van tip één. Stuur tip twee naar de inspectiecamera.Speel de video af van tip één die in de rechter monitor afvuurt op hetzelfde moment dat tip twee wordt afgevuurd in de bovenste cameramonitor, passend bij het patroon van druppelproductie van de twee dispensers. Verwijder het pincet van de houder op de rasterrobot met behulp van de meegeleverde inbussleutel. Plaats op een nabijgelegen tafelblad een nanodraad van het testraster aan de rand van het rasterblok.Pak voorzichtig de rand van het rooster vast en plaats deze correct in het pincet. Monteer vervolgens het pincet opnieuw. Klik op het tabblad Cryo op Tip naar camera om tip één naar het gezichtsveld van de bovenste duikpadcamera te verplaatsen, zodat Live is geselecteerd in de bovenste cameramonitor.Schakel het bovenste cameralampje in en pas het aan. Plaats tip één zichtbaar in de bovenste cameramonitor door met de muis in de monitor te klikken. Klik op Raster naar camera om het raster voor de bovenste camera te plaatsen en pas indien nodig de positie van tip één positie opnieuw aan.Zorg er op het tabblad Cryo voor dat Vitrified Grid niet is geselecteerd, klik op Wachtrijdoel en vervolgens op Plunge. Evalueer de bovenste en onderste afbeeldingen om te bevestigen dat de dispensers normaal functioneren. Verdun twee monsters tot de gewenste concentraties met een geschikte buffer, idealiter met dezelfde voor beide, en vul de cryogene kom met vloeibare stikstof.Plasma reinigt drie tot vier nanodraadroosters met vijf watt waterstof en zuurstof, en 1,5 minuut als uitgangspunt. Sluit de vernevelaar aan en observeer de damp die de centrale poort van de vernevelaardop verlaat. Observeer de Live Humidity Monitor in het hoofdvenster of open de Ambient Humidity Tracker onder Reports and Ambient.Controleer de luchtvochtigheid in de kamer en de lijkwadezones. Voeg vijf microliter van elk monster toe aan de monsterbekers. Plaats de monsterbekers in de ophoudlade met een monster voor tip één aan de linkerkant en voor tip twee aan de rechterkant.Duw vervolgens de lade terug in de machine totdat deze zit. Selecteer op het tabblad Aspirate drie microliters voor het volume dat door elke punt moet worden aangezogen. Zorg ervoor dat de monsterlade goed is geplaatst, klik op Aspirate en observeer hoe de pipettrap de dispenserkoppen in de monsterbekers verplaatst.Controleer de succesvolle aspiratie van beide monsters door de monsterbekers te verwijderen en een daling van de vloeistofniveaus te observeren. Stuur op het tabblad Inspecteren elke tip naar de inspectiecamera om de onbelemmerde afgifte te bevestigen. Pas de amplitude indien nodig aan om de druppelvorming van elke punt te evenaren.Laad een vers plasma gereinigd rooster in het pincet, maar monteer het pincet nog niet. Zorg ervoor dat de luchtvochtigheid wordt verhoogd tot ongeveer 90 tot 95%Vul de ethaanbeker en voer een laatste testvuur van beide tips uit voor de inspectiecamera, waarbij wordt bevestigd dat er geen obstructie is. Klik op het tabblad Cryo op Tip naar camera.Controleer ethaanbeker. Als ethaanijs zich heeft gevormd, smelt dan indien nodig met extra ethaangas. Monteer het pincet met het rooster op de rastertrap.Klik op het tabblad Cryo op Raster naar camera en zorg ervoor dat tip één correct in de bovenste cameramonitor is geplaatst. Klik op Vitrified Grid, Queue Target en vervolgens Plunge. Klik op OK wanneer u wordt gevraagd de rasterrobot opdracht te geven om het raster van ethaan in vloeibare stikstof te hoppen en op de ondergedompelde plank vrij te geven.Onderzoek afbeeldingen van het raster om te beslissen of het moet worden bewaard of weggegooid. Als u het rooster houdt, koelt u de tang met fijne punt vooraf, pakt u het raster voorzichtig bij de rand en plaatst u het in een roosterkastsleuf, te beginnen met de eerste sleuf aan de linkerkant van de inkeping en met de klok mee. Gebruik de experimenteerviewer om de rasterbeelden van de bovenste en onderste camera's te bekijken en te vergelijken, samen met de apparaatinstellingen en vochtigheidsmetingen op het moment van de duik door Rapporten en experiment te selecteren.Beelden van rasters die tijdens een enkele tijd opgeloste Spotiton-sessie zijn gemaakt door RNA-polymerase te mengen in een DNA-oligomeer van 105 basenparen dat gedurende 150 milliseconden voorafgaand aan vitrificatie een promotorsequentie draagt, worden hier getoond. Van de zes rasters vertoont er slechts één suboptimale wicking. Het patroon van ijsafzetting op een verglaasd raster komt nauw overeen met het patroon van afgezette vloeistof dat te zien is in het bovenste camerabeeld.Effectieve afvoer van de gemengde monsters vindt plaats langs de met nanodraad bedekte rasterbalken waar het monster zelden overloopt in vierkanten naast die waarin het is geland. In met ijs gevulde vierkanten is het ijs meestal het dikst in gaten in het midden van het vierkant en wordt het dunner in gaten dichter bij de rasterbalken. Gaten direct naast de rasterbalken zijn vaak leeg, vanwege de nabijheid van de nanodraden.Een goede voorbereiding en behandeling van de nanodraadroosters zorgt voor een goede ijsdikte op gemengde monsterroosters. Het Spotiton-systeem stelt de gebruiker ook in staat om de twee monsters afzonderlijk op één rooster te deponeren, waardoor een ongemengde regeling tijdens dezelfde netonderhoudssessie kan worden verzameld. Spotiton heeft het mogelijk gemaakt om de eerste tussenproducten in bacteriële genexpressie in realtime vast te leggen.Omdat ze zich vormen op een tijdschaal van minder dan een seconde, waren hun structuren tot nu toe onbekend.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

Voorbereiding van de Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron en Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Genetische studies van het menselijk DNA Repair eiwitten met behulp van gist als een model-systeem

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

De voorbereiding van Adult Drosophila Ogen voor Thin Sectioning en microscopisch onderzoek

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Cryo-elektron microscopie Specimen Voorbereiding door middel van een Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Do&#39;s en Don&#39;ts van cryo-elektronenmicroscopie: A Primer op Monstervoorbereiding en hoge kwaliteit Data Collection voor Macromolecular 3D Wederopbouw

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisatie van DNA verdichting in cyanobacteriën door hoogspannings-Cryo-Elektronentomografie

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Monstervoorbereiding door 3D-correlatieve gefocuste ionenbundelfrezen voor cryo-elektronentomografie met hoge resolutie

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Cryo-elektronentomografie Gegevensverzameling op afstand en subtomogrammiddeling

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Deep Learning-Based Segmentation of Cryo-Electron Tomograms

Deep learning-gebaseerde segmentatie van cryo-elektronentomogrammen

Cryo-electron tomography (cryo-ET) allows researchers to image cells in their native, hydrated state at the highest resolution currently possible. The ...