Name: cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, spotiton
Uploaded: 2021-02-25T14:00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton at JoVE.com

우리는 초기 디자인과 Spotiton 시스템의 후속 개발에 대한 엔지니어링 아트 LLC (애리조나, 미국)에서 피터 A. 칸과 테리 로데에게 감사드립니다. 우리는 도움과 기술 지원을 위해 뉴욕 구조 생물학 센터의 사이먼 전자 현미경 센터의 직원에게 감사드립니다. 여기에 제시 된 작품은 NIH (GM103310)와 시몬스 재단 (SF349247)의 보조금에 의해 지원, 뉴욕 구조 생물학 센터에 위치한 자동화 된 분자 현미경 검사법을위한 국가 자원에서 실시되었다.

1. 스포티톤 기계 및 소프트웨어 설정
<ol><li>디스펜스 시스템을 준비합니다(그림1).<ol>
<li>질소 공급 탱크의 주 밸브를 엽니다. 시스템 저장소가 탈가스, 초순수물로 채워져 있는지 확인하십시오. 컴퓨터를 켭니다. 멀티 아울렛 파워 스트립에서 Spotiton 시스템을 켭니다.</li>
		<li>스팟 소프트웨어(그림 2B)의 사용자 인터페이스(UI)를 열어 바탕 화면 아이콘(그림2A)을클릭합니다. 도구 메뉴에서 스테이지 초기화를 선택하여 3축 로봇(그리드 스테이지 및 파이펫 스테이지)과 회전 디스펜서 헤드 어셈블리(테타 스테이지)를 초기화하고 홈으로 설정합니다. 디스펜서 팁이 초기화 및 호밍 전에 아래로 가리키고 있는지 확인합니다.</li>
		<li>메인 창에서 안전 위치로 이동을 클릭하여 로봇을 SafePosition(그림3)로보냅니다. 참고: SafePosition로 이동하는 것은 충돌 위험 없이 어떤 위치에서든 로봇으로 수행할 수 있습니다.</li>
		<li>흡인 탭에서 프라임을 선택하여 디스펜서 헤드를 저수지의 물로 여러 번 플러시합니다. 두 가지 팁에서 중단없는 물 줄기가 나타나기 전까지는 계속됩니다. 참고: 팁이 마지막 종료 시 메탄올로 플러시되었을 때 상당한 양의 공기가 유체 선에 진입한 경우 반복해야 할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>디스펜서 성능 검사<ol>
<li>검사 탭에서 각 팁을 검사 카메라로 보내 물을 테스트하고 두 디스펜서(그림S1)에서물방울 생산 패턴과 일치합니다. 참고:거품(도 S2A)또는 이물질로 인해 팁이 발사되지 않으면 흡인 탭에 액세스하는 초음파 세척 기능을 사용하여 세척스테이션(도면S2B)에서팁을 청소하십시오. </li>
		<li>일관된 크기의 개별 액적 스트림을 달성하기 위해 각 디스펜서 및 샘플에 대한 발사 진폭 (unitless)을 조정합니다.</li>
		<li>두 디스펜서에 의한 동등한 물방울 생산을 시각적으로 확인합니다.<ol>
<li>상단 카메라 모니터의 레코드 버튼을 눌러 팁 1 발사 비디오를 녹화합니다. 팁 2가 상부 카메라모니터(그림 S1)에서발사되는 동시에 오른쪽 모니터에서 발사한 팁 1의 비디오를 재생합니다. 참고: 각 팁 발사 동영상이 기록되고 저장됩니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>디스펜서는 이제 그리드에서 시전할 준비가 되었습니다. 참고: 이 프로토콜은 각 플런지 위치에서 그리드 및 파이펫 스테이지의 올바른 정렬이 확인되었다고 가정합니다. 올바른 정렬을 확인하지 못하면 충돌이 발생하여 팁이나 로봇이 손상될 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>그리드에서 시판물을 테스트합니다.<ol>
<li>로봇이 세이프포지션에 있는지 확인합니다.</li>
		<li>제공된 Allen 키를 사용하여 그리드 로봇의 마운트에서 핀셋을 제거합니다.</li>
		<li>근처 벤치탑에 테스트 그리드, 나노와이어 면을 위쪽으로 배치하여 그리드 블록의 가장자리에 배치합니다. 조심스럽게 그리드의 테두리를 잡고 핀셋(그림 S3)에올바르게 배치하고 핀셋을 다시 장착합니다.</li>
		<li>Cryo 탭에서 팁 to Camera를 클릭하여 팁을 상단 플런지 경로 카메라(위카메라)의시야로 이동합니다. 상단 카메라 모니터에서 라이브를 선택하고 상단 카메라 표시등이 켜집니다(컴퓨터 캐비닛 앞의다이얼(그림 1).</li>
		<li>그리드 로봇에 핀셋을 장착합니다. 모니터 내의 마우스를 클릭하여 상단 카메라 모니터에 표시되는 위치 팁 1입니다. 참고: 팁 1만 표시되며 클릭 위치로 이동합니다.</li>
		<li>카메라를 클릭하여 위 카메라 앞에 그리드를 배치합니다. 필요한 경우 팁 1 위치를 이전과 같이 조정합니다.</li>
		<li>Tip1, Tip2또는 Tip1 및 Tip2를 선택하여 테스트발사시 하나 또는 둘 다 디스펜서를 선택합니다. 참고: 팁을 개별적으로 테스트할 때 마우스를 사용하여 그리드의 다른 측면 위치에 상단 카메라 모니터에 팁 1을 배치합니다. 이렇게 하면 두 가지 팁에서 두 가지 팁에서 액체 줄무늬가 겹치지 않는 패턴으로 입금되고 각 팁이 발사되었는지 확인할 수 있습니다.</li>
		<li>Cryo 탭에서 Vitrify 그리드가 선택되지 않았는지 확인하고 큐 대상을클릭한 다음 플런지에서 클릭합니다. 참고: 파이펫 스테이지가 약간 상승하고 그리드 스테이지가 나타납니다. 그런 다음 그리드 로봇이 발사 디스펜서와 상부 및 하부 카메라를 지나 그리드를 급락하여 갑판 바로 위에 휴식을 취합니다. 위 카메라에서 캡처된 이미지 캡처가 UI 왼쪽의 아래 카메라에서 캡처된 이미지 위에 나타납니다.</li>
		<li>상하 이미지 평가: 각 팁이 선택했을 때 불이 붙었습니까? 함께 발사했을 때 두 가지 팁의 액체가 완전히 겹쳐서 개별적으로 발사했을 때보다 눈에 띄게 두꺼운 줄무늬가 생겼습니까?<ol>
<li>팁이 발사되지 않으면 명확한 발사가 관찰될 때까지 하나 또는 여러 개의 초음파 세척 주기를 수행합니다.</li>
			<li>샘플 스트라이프가 완전히 겹치지 않으면 Allen 키를 사용하여 디스펜서 중 하나의 측면 정렬을 조정하여 디스펜서 중 하나에 측면 조정 나사를 1쿼터 회전으로 돌리고 테스트 플런지를 수행합니다. 줄무늬가 완전히 겹칠 때까지 반복합니다. 참고: 두 팁이 성공적으로 그리고 예상대로 발사되면 시스템은 샘플 그리드를 준비할 준비가 되었습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. 두 샘플, 혼합 그리드 준비
<ol><li>기계 매개 변수 XML 파일의 가속, 감속 및 속도 값을 업데이트하여 관심 의 혼합 시간을 달성합니다. 참고: 이러한 값을 혼합 시간과 연관짓는 테이블은 이전에15로보고되었습니다.</li>
	<li>샘플 및 그리드를 준비합니다. 참고: 프로토콜의 이 시점부터 첫 번째 그리드가 준비되기 전에 20-30분이 경과하며 이 시간 간격 동안 샘플을 적절한 온도로 유지해야 합니다.<ol>
<li>두 샘플(즉, 단백질 및 리간드 또는 기타 상호 작용 파트너)을 적절한 완충액으로 원하는 농도로 희석하여 두 가지 모두에 대해 동일합니다. 참고: Spotiton 그리드는 일반적으로 자동 플런지 냉동고에 사용되는 것보다 1.5-2배 더 높은 단백질 농도를 필요로 합니다. 이는 단백질이 플런지 동안 그리드 표면에 얇은 수성 층에서 보내는 최소한의 시간 때문일 수 있으므로 입자가 공기-물 인터페이스에 집중할 기회가 적기 때문일 수 있습니다.</li>
		<li>저온그릇을 액체 질소로 채웁니다.</li>
		<li>플라즈마 청정 3-4 나노 와이어 그리드. 5W, 수소 및 산소를 사용하여 1.5 분을 출발점으로 사용하십시오. 참고: 가장 효과적인 플라즈마 세척 지속 시간 및 레시피는 주변 온도와 습도 및 사용되는 나노와이어 그리드 배치에 따라 일상에서 변경될 수 있습니다. 대체 가스 혼합물 또는 글로우 방전기도 효과적일 수 있지만 이러한 목적을 위해 테스트되지 않았습니다. 완충액의 물과 단백질은 나노와이어에 의해 다른 속도로 사악하기 때문에, 실제 시료가 분배되는 급락에 그날 사용될 그리드의 사악을 평가하는 것이 가장 좋습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>시스템의 습도 수준을 설정합니다. 참고: 그리드를 세척하고 플라즈마를 청소하는 데 사용되는 조건 외에도 습도는 나노 와이어 그리드의 위킹 속도에 영향을 미치는 또 다른 주요 요소입니다. 특정 세션의 목표 퍼센트 습도는 매일 및 그리드 배치에 대해 경험적으로 결정되지만 90-95 %는 좋은 출발점입니다.<ol>
<li>분무기가 초순수물로 충분히 채워지도록 하십시오. 분무기에 연결하고 분무기 캡의 중앙 포트를 빠져나가는 증기를 관찰한다.</li>
		<li>메인 창에서 라이브 습도 모니터를 관찰하거나 보고서 | 아래 주변 습도 추적기를 엽니다. 주변 (그림 S4). 챔버와 슈라우드 : 두 영역에서 습도 수준을 확인합니다. 참고: 챔버에는 스팟톤 인클로저 내의 모든 영역이 포함됩니다. 슈라우드는 그리드와 디스펜서 팁의 "카메라" 위치를 즉시 포괄하는 영역입니다. 검은 색 수지 덮개는 인클로저 도어가 열리면 그리드를 로드할 때 설정된 습도 수준을 유지합니다.</li>
		<li>대상 습도 값에 도달하면 습도 탭에서 이러한 값을 자동으로 또는 수동으로 유지관리합니다. 자동 제어를선택하고 설정된 점과 임계값을 선택하여 선택한 임계값 제한 내에서 설정점을 유지합니다. 또는 수동 컨트롤을선택하고 챔버 팬과 덮개 팬이라는 두 개의 팬 컨트롤을 사용하여 습도 수준을 조정합니다. 참고: 챔버 팬을 켜면 왼쪽 포트의 필터를 통해 증기를 끌어당기고 더 큰 물방울이 챔버로 유입되는 것을 방지하여 주변 습도가 더 증가하지 않습니다. 챔버 도어가 닫혀 있는 한 습도 수준은 원하는 백분율로 안정화됩니다. 슈라우드 팬을 켜면 오른쪽 포트를 통해 증기를 슈라우드로 끌어당깁니다. 이 둘 다 챔버로 증기 방출을 감소시키고 덮개 내의 습도 수준을 증가시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>샘플을 디스펜서에 로드합니다.<ol>
<li>샘플 컵에 각 샘플의 5 μL을 추가합니다. 참고: 거품을 도입하지 않으려면 컵 의 내부 사이드 월에 볼륨을 매우 신중하게 분배한 다음 샘플을 컵 바닥으로 강제로 내립니다.</li>
		<li>샘플 컵을 왼쪽 팁 1의 샘플인 홀딩 트레이에 로드하여 오른쪽에 있는 팁 2의 경우 로드합니다. 트레이가 앉을 때까지 다시 기기에 밀어 넣습니다.</li>
		<li>흡인 탭에서 각 팁에서 볼륨을 흡인할 수 있도록 3 μL을 선택합니다. 샘플 트레이가 안전하게 앉아 있는지 확인하고, 흡인을 클릭하고 파이펫 스테이지가 디스펜서 헤드를 샘플 컵으로 이동하는 방법을 관찰합니다.</li>
		<li>샘플 컵을 제거하고 액체 수준에서 드롭을 관찰하여 두 샘플모두의 성공적인 포부를 확인합니다.</li>
		<li>검사 탭에서 각 팁을 검사 카메라로 보내 방해받지 않는 디스펜싱을 확인합니다. 각 팁의 액적 형성과 일치하도록 필요에 따라 진폭을 조정합니다(섹션 1.2 참조). 참고: 단백질 샘플을 분배하는 팁에 대해 진폭을 늘려야 할 것입니다.</li>
		<li>이제 시스템이 샘플 그리드를 준비할 준비가 되었습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>샘플 그리드 동결<ol>
<li>핀셋에 갓 플라즈마 청소 그리드를 로드하지만 아직 핀셋을 장착하지 않습니다. 습도 수준이 상승되어 ~90-95%를 유지하십시오. 에탄 컵을 채웁니다.</li>
		<li>검사 카메라 앞에서 두 팁의 최종 테스트 파이어를 수행하여 방해가 없음을 확인합니다. Cryo 탭에서 팁을 클릭하여 카메라로 클릭합니다.</li>
		<li>에탄 컵을 채웁니다. 에탄 얼음이 형성되면 필요에 따라 에탄 가스를 추가로 녹입니다. 참고: 단계 2.5.4 및 2.5.5는 챔버의 습도가 높은 나노 와이어의 (i) 포화를 최소화하고 (ii) 단백질 샘플을 발사하는 팁이 막히게 될 가능성을 최소화하기 위해 비교적 빨리 완료되어야합니다(<20s).</li>
		<li>그리드 스테이지에 그리드가 있는 핀셋을 장착합니다. Cryo 탭에서 그리드를 클릭하여 카메라를 클릭합니다. 팁 1이 상단 카메라 모니터에 올바르게 배치되었는지 확인합니다(1.3.4-1.3.5 단계 참조).</li>
		<li>진동 그리드,큐 대상을클릭한 다음 플런지합니다. 그리드 로봇을 명령하여 에탄에서 액체 질소로 그리드를 홉하고 잠긴 선반에 놓도록 명령할 때 확인을 클릭합니다. 참고 : 핀셋은 챔버로 다시 상승. 액체 질소에 홉 후, 그리드가 핀셋에서 떨어졌는지 묻는 프롬프트가 나타납니다. 떨어뜨리지 않으면 아니오를클릭하면 핀셋이 여러 번 열리고 닫히면 그리드를 분리합니다.</li>
		<li>그리드(그림 S5)의이미지를 검사하여 보관할지 폐기할지 여부를 결정합니다.</li>
		<li>그리드를 유지하면 미리 냉각된 그리드 상자로 전송합니다. 또는 후속 그리드를 발견한 다음 모든 그리드를 그리드 박스로 한 번에 전송하여 각 그리드를 휴게 영역의 위치로 식별할 수 있습니다.</li>
		<li>그리드 박스로 그리드를 전송하려면 미리 냉각된 미세 팁 집게를 가장자리로 부드럽게 잡고 시계 방향으로 가는 노치의 첫 번째 슬롯에서 시작하여 그리드 박스 슬롯에 배치합니다.</li>
		<li>모든 그리드가 로드되면 그리드 박스 뚜껑을 뚜껑 도구에 연결하고 액체 질소에서 미리 냉각합니다. 뚜껑을 그리드 박스에 나사로 조이고 뚜껑 도구 또는 미리 냉각된 드라이버로 조입니다.</li>
		<li>대형 집게를 사용하여 닫힌 그리드 박스를 이미징 또는 장기 저장을 위해 작은 디워트로 빠르게 전송합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>다운스트림 EM 이미징의 그리드 적합성평가.<ol>
<li>그리드가 급락한 직후 UI의 왼쪽에 표시되는 상부 및 하부 플런지 경로 카메라의 이미지를 관찰합니다. 이러한 이미지를 사용하여 위킹 속도, 두 팁의 성공적인 발사 및 두 샘플 줄무늬의 중첩 정도를 평가합니다.</li>
		<li>실험 뷰어를 사용하여 급락 시 기계 설정 및 습도 측정과 함께 상부 및 하부 카메라의 그리드 이미지를 검토하고 비교합니다 |. 실험.</li>
		<li>좋은 사악한의 증거를 보여주는 전자 현미경에서 이미징을 위한 그리드를 선택합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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B.C./C.S.P.는 Spotiton 프로토타입을 기반으로 하는 상업적으로 이용 가능한 악기인 카멜레온을 생산하는 회사인 SPT Labtech와 상업적 관계를 맺고 있습니다.

이 프로토콜은 90-500 ms에 혼합된 2개의 견본, 일반적으로 관심있는 단백질 및 활성화 리간드를 전송하는 저온-EM 화상 진찰을 위한 그리드를 준비하기 위하여 Spotiton 로봇 시스템의 사용을 설명합니다. 워크플로우는 간단하지만 생산적인 그리드 메이킹 세션을 보장하기 위해 사용자가 염두에 두어야 하는 몇 가지 고려 사항이 있습니다. 첫째, 압전 디스펜서 팁 중 하나가 막히거나 발사되지 못하도록 막는 것은 드문 일이 아닙니다. 이러한 오류로 인해 위쪽 또는 아래 카메라에서 이미지 캡처에서 볼 수 있는 액체 줄무늬가 발생하며, 이는 두 팁이 모두 발사된 후 볼 수 있는 것보다 눈에 띄게 좁습니다. 막힘은 끝에 있는 기포 숙박, 물방울 형성 을 방해하거나 좁은 팁 오리피스를 건조하고 밀봉한 단백질 샘플에서 발생할 수 있습니다. 흡입 된 샘플은 과정에서 손실되지만, 두 문제는 팁의 초음파 세척및 샘플의 재포부시에 의해 해결 될 수있다. 후속 막힘 및 샘플 폐기물을 방지하기 위해, 시료 포부 전에 유체 라인을 철저히 (플러시)하고 챔버 및 덮개 내에서 높고 일관된 습도 수준을 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 특히 농도가 높은 단백질 샘플은 습도가 잘 유지되음에도 불구하고 팁 발사에 영향을 줄 수 있습니다. 검사 탭에서 발사 진폭을 증가하면 고단백 농도로 인해 약한 발사를 부분적으로 보상할 수 있지만, 샘플을 1:2 이상 희석하면 팁 발사가 향상되고 막힘을 피할 수 있습니다.
둘째, 표적 혼합 지속 시간에 최적의 두께의 얼음을 생성하는 데 필요한 이상적인 위킹 속도를 달성하기 어려울 수 있습니다. 일반적으로, 더 빠른 혼합 시간은 더 빠른 사악이 필요합니다, 느린 혼합 시간은 느린 사브가 필요합니다. 이상적으로 사악한 그리드의 경우, 액체 줄무늬는 상부 카메라 이미지에서 명확하게 식별 할 수 있으며, 아래 카메라에는 줄무늬의 위치에있는 그리드 막대가 약간 두꺼워집니다. 낮은 카메라 이미지에 어두운 줄무늬로 표시된 느린 위킹은 일반적으로 이미징에 너무 두꺼운 얼음을 남깁니다. 양쪽 이미지에 줄무늬가 없으면 구멍에 물을 남기지 않았을 수 있는 빠른 위빙(그림S5)을나타냅니다. 나노 와이어 밀도, 플라즈마 세척 설정 및 지속 시간, 챔버 습도의 수준 및 설정 수준에 노출의 시간과 같은 몇 가지 요인은 사악 속도에 영향을 미칠 수 있습니다. 불량 (느린) 위킹 그리드에 나노 와이어의 희소 코팅의 결과 일 수있다. 나노와이어용액(16)에대한 노출 시간을 약간 희석하고 증가시킴으로써 그리드 바의 나노와이어의 밀도와 커버리지가 증가하여 더 빠른 위력을 촉진합니다. 나노 와이어 밀도가 충분하면 플라즈마 세척의 와트 설정 또는 지속 시간을 늘리면 위킹이 향상됩니다. 여기에 권장되는 설정은 상대적으로 낮은 전력과 긴 기간이지만 필요한 경우 변경될 수 있습니다.
그러나, 그리드와 플라즈마 세척 설정의 특정 배치가 이전 세션에서 잘 작동한 경우, 느린 위빙 성능은 챔버 내의 높은 습도에 나노 와이어의 과도한 노출에서 발생할 수 있습니다, 수분과 감소 액체 보유 용량으로 자신의 포화로 이어지는. 챔버 습도의 그리드 포화 효과는 트위저 장착과 그리드 급락 사이의 경과 시간을 최소화하거나 급락 하기 전에 시스템 습도 수준을 감소시킴으로써 감소 될 수 있습니다. 그러나 후자는 단백질 샘플로 로드된 팁이 막힘일 관련 위험을 가져온다는 점에 유의해야 합니다. 이러한 위험을 상쇄하기 위해 습도수준이 높은 슈라우드의 팁을 보유하면 새 그리드를 들고 핀셋을 장착하는 데 허용되는 시간을 늘릴 수 있습니다. 마지막으로, 전력망 가속 및/또는 최대 속도를 증가시킴으로써 급락 시간이 감소하면 실제로 그리드의 위킹 특성을 변경하지 않으면서 얼음이 더 얇은 그리드가 발생할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 그러나 두 샘플의 혼합 시간도 감소하므로 급락 시간은 일반적으로 느린 담기를 해결하기 위해 변경되는 요인이 아닙니다. 너무 빠른 위킹을 해결하기 위해 그리드 구멍에 너무 얇거나 없는 얼음을 생성하여 위에서 설명한 조치의 반대값을 취할 수 있습니다.
Spotiton은 초시간 해결 연구를 위해 개발된 다른 기술과 비교할 때 특정 장점과 단점을 제시합니다. 혼합 시료 스트라이프는 각 디스펜서로부터 2-4nL의 액체만 함유되어 있기 때문에, 각 시료의 단일 3 μL 알리쿼트만으로도 샘플이 제한될 때 많은 그리드-주요 이점을 준비하기에 충분하다. 또한, Spotiton17에완전히 고유하지는 않지만 통합 카메라를 사용하여 샘플 증착을 관찰하는 것은 다른 믹싱 장치의 특징이 아니며 급락 된 그리드가 조잡한 패스 / 실패 평가를 받을 수 있으므로 선별 시간을 크게 줄입니다. 시스템의 한 가지 주요 단점은 기계 성분의 물리적 한계에 의해 제한되는 90 ms의 최소 혼합 시간이며, 이는 더 빠른 생물학적 반응에 대한 심문을 손이 닿지 않는 곳에 두는 것입니다. 이에 비해 기존 미세 유체 시스템에서 10ms 미만의 시간이 일상적으로 달성됩니다. Spotiton 기반의, 시판되는 카멜레온 시스템에서 설계 및 시공 개선은 최소 급락 시간을 54ms로 단축하고 두 번째 디스펜서를 추가하면 Spotiton이 현재 제공 할 수있는 것보다 더 빠른 혼합 시간을 허용할 수 있다는 가능성을 제기합니다.
현재까지 70S 리보솜의 조립, 칼슘 트리거된 반막 이온 채널의 칼슘 트리거 된 형태 변화, GTP 가수분해(15)에대한 응답으로 다이너민의 수축을 포함하여 Spotiton을 사용하여 초기, 단명 분자 상태를 조사하기 위한 다양한 실험이 수행되었다. 이러한 결과가 발표된 이후, 스팟톤 그리드 메이킹 세션의 처리량, 재현성 및 보고를 향상시키기 위해 시스템에 몇 가지 변경 사항이 통합되었습니다. 여기에는 이중 영역, 자동 습도 모니터링 및 제어 시스템, 실험 뷰어 기능, 나란히 팁 검사 기능 및 UI에 대한 몇 가지 사소한 업그레이드가 포함됩니다. 업그레이드된 시스템은 이전에 보고된 것과 유사한 미래의 2시 혼합 실험뿐만 아니라 소분자 치료와 단백질 표적 또는 항체-항원 복합 형성 과 같은 신속한 결합 소심을 더 잘 지원할 것입니다. 두 상호 작용 파트너와 관련된 현재 및 향후 시간 해결 실험은 확실히 계속될 것이지만, 세 번째 압전 디스펜서와 관련 하드웨어를 추가하면 가능한 실험 의 범위를 더욱 넓힐 수 있습니다. 예를 들어, 관심있는 단백질에 이어 세제의 초기 증착은 상호 작용 또는 활성화 리간드에 이어 세제에 대한 확장 된 노출의 잠재적 부정적인 영향을 제거 할 수 있으며, 종종 바람직한 방향과 같은 일반적인 최적이 아닌 이미징 결과를 방지하는 데 필요한. 이미 게시된 작업과 향후 잠재적 애플리케이션에 비추어 Spotiton은 극저온-EM 커뮤니티가 초중 시간 해결 연구의 수행을 용이하게 하는 중요한 도구를 나타냅니다.

극저온-EM이 극저온-EM 그리드2를준비하기 위해 더보체트가 개발한 표준 플런지 동결 법에 기초한 베리만과 언윈1을 시작으로 여러 그룹에서 단백질의 일시적인 형성 상태를 포착하고 드러낼 수 있는 가능성을 입증하였다. 그들은 압축 질소 가스를 사용하여 두 번째 샘플의 미세한 안개를 얇은 수성 층에 적용하고 블랜트한 첫 번째 샘플을 포함하는 급락 EM 그리드에 분사하는 극저온 컵 바로 위에 분토제를 추가했습니다. 이 시스템은 1ms의 낮은 혼합 시간을 달성 할 수 있지만, 그것은 여전히 사용자가 기술적으로 도전적인 작업 -과 두 번째 샘플의 상대적으로 높은 볼륨에 의해 첫 번째 샘플의 수동 블로팅을 요구했다. 더욱이, 실제로, 두 샘플의 혼합이 어디에서 일어났는지 알기 어려웠으며, 혼합 시료의 서메이션 마커로서 페리틴 나노입자를 사용해야 했다. 하워드 화이트와 동료에 의한 후속 노력은 블로팅 및 스프레이 단계3,4의컴퓨터 제어를 통합하여이 살포 혼합 접근 법의 제어 및 재현성을 향상시켰습니다. 샘플이 얼마나 잘 혼합되는지 를 해결하기 위해 동일한 그룹5 및 기타6,7,8,9,10은 주사기 펌프의 압력하에 좁은 모세관 튜브 또는 질소 가스에 의해 구동되는 미세 섬유 칩에서 두 개의 샘플이 혼합되는 혼합 살포접근법(11)으로 이동했습니다. 이러한 프리믹싱 시스템은 완전한 혼합을 보장할 뿐만 아니라 믹싱 시간을 미세 조정하여 시간 해결 된 연구의 해상도를 높일 수 있습니다.
Spotiton 시스템에서 EM 그리드에 샘플을 적용하는 대체 방법으로 압조전 디스펜서를 도입함으로써 샘플 증착을 정밀하게 타겟팅하고 훨씬 더 작은 샘플 볼륨의 요구 사항을 모두 사용하여그리드(12)를만들 수 있습니다. 나중에, 나노와이어 그리드와 도중 시료 애플리케이션("즉석" 스포팅)의 사용은 블로팅 단계의 필요성을 제거하고 적용-대 바이피션 시간13,14를감소시켰습니다. 여기에 설명된 시간 해결 극저온-EM에 대한 새로운 접근법의 경우, 필요한 제어 하드웨어 및 소프트웨어 업그레이드와 함께 두 번째 디스펜서가 Spotiton 시스템에 추가되어 처음15의증착 직후 움직이는 나노 와이어 그리드에 두 번째 샘플을 전달할 수 있게 되었다. 두 개의 겹치는 샘플은 나노 와이어에 의해 멸망되어 유리화 전에 얇은 수성 층으로 사악할 때 그리드에 혼합됩니다. 90ms의 낮은 혼합 시간을 달성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 압전 디스펜싱 및 나노 와이어 그리드를 사용하여 시간 해결 실험을 수행하는 방법에 대한 실용적인 정보를 제공 할 계획입니다. 또한 사용 편의성, 일관성 및 처리량을 향상시키기 위해 하드웨어 및 소프트웨어가 수정됨에 따라 이 프로토콜은 이전에 보고된메서드(15)에대한 최신 설명역할을 합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryogenic grid storage boxes</td>
			<td>EMS (Hatfield, PA; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu/Rh 300 mesh EM grids</td>
			<td>EMS (Hatfield, PA; USA)</td>
			<td>EMS300-Cu-Rh</td>
			<td>treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethane gas</td>
			<td>TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid-handling forceps</td>
			<td>EMS (Hatfield, PA; USA)</td>
			<td>78320-5B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picosystem</td>
			<td>Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>water purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein/other sample</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solarus 950 plasma cleaner</td>
			<td>Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, spotiton

두 개 이상의 상호 작용하는 입자의 초기 만남에 의해 트리거 단기 분자 상태의 캡처는 극저온 전자 현미경 검사 (극저온-EM)의 필드에 큰 관심의 실험 적인 도전이 계속. 이러한 "시간 해결" 연구를 지원하는 몇 가지 방법론 적 전략이 개발되었으며, 그 중 하나는 Spotiton-a 새로운 로봇 시스템으로 피콜리터 크기의 샘플 방울의 분배와 정밀한 시간적 및 공간 제어가 결합되어 있습니다. 시간 해결된 Spotiton 워크플로우는 최소한의 샘플 볼륨에서 초기 구조 재배열을 심문하는 고유하고 효율적인 접근 방식을 제공합니다. 독립적으로 제어되는 압전 디스펜서에서 발사된 두 개의 샘플은 나노와이어 EM 그리드에서 빠르게 혼합되어 극저온을 향해 떨어지게 됩니다. 잠재적으로 수백 개의 그리드를 샘플의 몇 마이크로리터만 에서 빠르게 연속적으로 준비할 수 있습니다. 여기서, Spotiton 시스템의 작동에 대한 상세한 단계별 프로토콜은 그리드 준비 중에 발생하는 특정 문제를 해결하는 데 중점을 두고 있습니다.

도 4는 RNA 폴리머라제와 105 bp DNA 올리고머를 혼합하여 단 하나의 시간 해결 스팟라이트 세션 동안 제조된 그리드의 이미지를 나타내며, 150ms에 대한 프로모터 시퀀스를 운반하는 150ms 의진동화(15)전에. 그림에서 볼 수 샘플 응용 프로그램 다음 두 타임 포인트에서 여섯 그리드의 두 고속 카메라에 의해 촬영 된 이미지입니다. 플런지 스타일의 냉동고 중에서 고유한 이 카메라는 사용자가 나노와이어에 의한 담기의 관찰된 정도와 EM 이미징을 위한 수성 층으로 그려질 가능성에 따라 그리드를 유지하거나 버릴지 여부를 즉시 결정할 수 있도록 합니다. 단일 그리드는 완전한 데이터 집합에 충분한 얼음을 제공할 수 있지만 최적의 조건이 달성되면 하나 이상의 그리드가 분실되거나 오염될 경우 여러 그리드가 계속 준비됩니다. 이 세션에서 준비된 6개의 그리드 중 이미지 캡처는 최적이 아닌 위킹(그림4F)을가진 그리드를 보여줍니다.
표시된 그리드는 프로토콜에 설명된 바와 같이 시료와 기계를 준비하기 위해 1시간 후 40분 동안 연속적으로 준비되었다(단계 1.1.1.1 ~ 2.4.6). 6개의 그리드 중 2개는 데이터 수집에 사용되었으며, 나머지는 필요한 경우 나중에 분석을 위해 저장되었습니다. 유리화 격자에 얼음의 패턴(도 5C)밀접하게 상부 카메라 이미지에서 볼 증착 액체의 패턴과 일치(도 5B). 하부 카메라이미지(도 5A)에서눈에 보이는 액체 줄무늬의 부재로 명백하게 드러나는 혼합 시료의 효과적인 사악함( 도 5A)은 나노와이어로 덮인 그리드 바를 따라 발생하며, 샘플은 착륙한 샘플에 인접한 사각형으로 거의 오버플로되지 않습니다. 얼음으로 채워진 사각형 내에서 얼음은 일반적으로 사각형중앙의 구멍 내에서 가장 두껍고 그리드바(그림 5E)에가까운 구멍이 얇아집니다. 종종 그리드 바에 인접한 구멍은 나노 와이어(도 5F)에근접하기 때문에 비어 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig01.jpg"> 그림 1: 시간 해결 된 Spotiton 시스템. 1. 작업자의 워크스테이션; 2. 환경 챔버; 3. 질소 공급; 4. 에탄 공급 5. 상부 플런지 경로 카메라 6용 백라이트 컨트롤. 압전 디스펜서 컨트롤러; 7. 주사기 펌프; 8. 진공 펌프; 9. 물 공급 및 폐기물 병을 씻으시면 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig02.jpg"> 그림 2: 스팟 소프트 사용자 인터페이스. (A)데스크탑 아이콘 및 스플래시 스크린. (B)메인 UI는 상부 플런지 경로("위쪽") 및 팁 검사 카메라의 디스플레이 영역 1. 6가지 영역으로 구성됩니다. 2. 낮은 플런지 경로 ("아래") 카메라표시 영역; 3. 팁 검사 비디오 재생 영역; 4. 다기능 탭 영역; 5. 라이브 습도 모니터; 6. 라이브 시스템 로그 파일. 약어: UI = 사용자 인터페이스. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig03.jpg"> 그림 3: 스포티턴 챔버의 내부 보기 (안전 위치의 로봇). 1. 그리드 로봇 (빨간색); 2. 디스펜서 로봇 (노란색); 3. 어퍼 플런지 경로 카메라 (핑크); 4. 낮은 플런지 경로 카메라 (밝은 파란색); 5. 팁 검사 카메라 (주황색); 6. 습도 덮개 (녹색); 7. 샘플 트레이; 8. 분무기 조립 (진한 파란색); 9. 시스템 저수지및 수로. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig04.jpg"> 그림 4: 시간 해결 된 Spotiton 그리드 만들기 세션에서 대표 시스템 카메라 이미지. (A -F) 상부(왼쪽) 및 하부(오른쪽) 플런지 경로 카메라 이미지는 6개의 그리드를 상회하여 RNA 폴리머라제 및 프로모터 DNA 서열을 Spotiton을 사용하여 적용하였다. 스케일 바 = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig04large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig05.jpg"> 그림 5: 스팟이 준비된 그리드의 얼음 증착 패턴입니다. (A)하부 및(B)상부 카메라 이미지와(C)아틀라스의 일부가 도 4F에도시되어 있다. 샘플 증착 및 혼합으로 인한 대략적인 얼음 위치는 라벤더색으로 착색되어 있습니다. 노란색 화살표헤드로 표시된 사각형 내영역이 이미지화됩니다(E-G). (E)에 표시된 영역은 노란색으로 상자에 들어있습니다(D). 대표적인정사각형(E),구멍(F)및(G)에 도시된 그리드로부터 수집된 노출 이미지(A-D). 정사각형 및 구멍 이미지의 박스 영역은 각각 구멍 및 노출 이미지에 해당합니다. 스케일 바 = 100 μm(A-D),5 μm(E),2 μm(F),100 nm(G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그림 S1: 팁 발사 검사. 팁 2 발사의 라이브 보기는 사용자 인터페이스의 왼쪽에 있는 상부 카메라 모니터에서 볼 수 있으며, 팁 1 발사 이전에 만든 레코딩은 오른쪽의 비디오 재생 영역에서 비교하기 위해 루프에서 재생됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S1.jpg" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그림 S2: 디스펜서 팁의 초음파 세척. (A)팁의 기포는 액적 형성을 방해하고 팁 발사를 방지합니다. (B)초음파 청소 스테이션의 물에 담근 팁은 기포를 제거하거나 팁 오리피스를 차단하는 맑은 말린 단백질을 제거합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S2.jpg" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그림 S3: 핀셋에 그리드를 로드합니다. (A)그리드 블록의 가장자리에 나노와이어 면을 올려 놓은 그리드. (B)자체 닫는 핀셋에 올바르게 배치된 그리드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S3.jpg" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그림 S4: 습도 추적기. 일반적인 그리드 메이킹 세션 동안 기록된 챔버(다크 블루)와 슈라우드(라이트 블루)의 백분율 상대 습도입니다. 그리드 급락 시간(녹색 사각형)이 그래프에 플롯됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S4.jpg" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그림 S5: 급락 하는 동안 나노 와이어 그리드에 위킹. 대표적인어퍼(A, C, E)및 하부(B,D, F)급진경로 카메라 이미지가 너무 느리다(A,B),이상적(C,D),너무 빠르다(E,F). 약간 두껍게(흰색 화살표헤드)는 샘플에 의해 포화된 나노와이어가 있는 그리드 바를 나타냅니다. 이 지구에 있는 제곱은 전형적으로 전자 현미경 화상 진찰을 위한 적당한 두께의 얼음을 포함합니다. 스케일 바 = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S5.jpg" target="_blank">이 파일을 다운로드하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton at JoVE.com

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

여기에 제시된 프로토콜은 새로운 로봇 시스템인 Spotiton의 사용을 설명하며, 액체 저온기에서 진동하기 전에 최소 90ms를 혼합하는 나노 와이어 그리드에 관심 있는 두 샘플을 전달합니다.

새로운 로봇 시스템, 스포티폰을 사용하여 시간 해결 연구를 위한 극저온 전자 현미경 그리드 준비

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Spotiton 로봇 시스템을 사용하면 90밀리초 빠른 속도로 전자 현미경 그리드에서 상호 작용하는 파트너와 관심 있는 단백질을 혼합하고 진동시킬 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 표준 그리드 준비 기술에 의해 캡처하기에너무 일시적인 중간 단백질 확인을 캡처할 수 있습니다. 시간 해결 Spotiton은 막 채널 활성화, DNA 또는 RNA 합성과 같은 초 생물학적 또는 생화학 적 시스템을 알릴 수 있거나, 표적 단백질과 약물 또는 항체의 조기 상호 작용을 알릴 수 있습니다.사용자는 그리드의 품질에 직접적인 영향을 미치는 여러 구성 요소를 동시에 관리해야 합니다. 그리드를 준비할 때 사용하기 전에 시스템을 이해하고 인내심을 갖는 것이 중요합니다. 먼저 질소 공급 탱크의 주 밸브를 열고 시스템 저장소가 가스가 드인 초순수물로 채워지도록 하십시오.멀티 콘센트 전원 스트립에서 컴퓨터와 Spotiton 시스템을 켭니다. 데스크톱 아이콘을 클릭하여 Spotiton 소프트웨어의 사용자 인터페이스를 엽니다. 도구 메뉴에서 스테이지 초기화를 선택하여 3축 로봇을 초기화하고 홈으로 이동하여 디스펜서 팁이 초기화 및 호밍 전에 아래로 가리키도록 합니다.메인 메뉴에서 안전한 위치로 이동을 클릭하여 로봇을 안전한 위치로 보냅니다. 흡인 탭에서 프라임을 선택하여 디스펜서 헤드를 저수지의 물로 여러 번 플러시합니다. 팁에서 두 개의 중단없는 물 줄기가 나타나기 전까지는 계속하십시오.검사 탭에서 팁 하나를 검사 카메라로 보내고 화재 수를 테스트하여 이산 물방울이 생성될 때까지 진폭을 조정합니다. 상단 카메라 모니터의 레코드 버튼을 눌러 팁 1 발사 비디오를 녹화합니다. 검사 카메라에 팁 2를 보냅니다.두 디스펜서에서 액적 생산 패턴과 일치하는 상부 카메라 모니터에서 2개의 티프가 발사되는 동시에 오른쪽 모니터에서 발사한 팁 1의 비디오를 재생합니다. 제공된 Allen 키를 사용하여 그리드 로봇의 마운트에서 핀셋을 제거합니다. 근처 벤치탑에 테스트 그리드 나노와이어 면을 그리드 블록 의 가장자리에 배치합니다.조심스럽게 그리드의 가장자리를 잡고 핀셋에 올바르게 배치합니다. 그런 다음 핀셋을 다시 마운트합니다. Cryo 탭에서 팁 to Camera를 클릭하여 팁 하나를 상단 플런지 경로 카메라의 시야로 이동하여 상단 카메라 모니터에서 라이브를 선택하도록 합니다.켜고 상단 카메라 조명을 조정합니다. 모니터 내의 마우스를 클릭하여 상단 카메라 모니터에 표시되는 위치 팁 1개. 카메라를 클릭하면 그리드를 카메라로 이동하여 위 카메라 앞에 그리드를 배치한 다음 필요한 경우 팁 한 위치를 다시 조정합니다.Cryo 탭에서 바이트 그리드가 선택되지 않았는지 확인하고 큐 대상을 클릭한 다음 플런지에서 클릭합니다. 디스펜서가 정상적으로 작동하는지 확인하기 위해 상하 이미지를 평가합니다. 두 샘플을 적절한 버퍼로 원하는 농도로 희석하고, 이상적으로도 동일하게 사용하고, 냉동원 그릇을 액체 질소로 채웁니다.플라즈마는 5와트 수소와 산소를 사용하여 3~4나노와이어 그리드를, 1.5분 간 시작점으로 청소합니다. 분무기를 연결하고 분무기 캡의 중앙 포트를 빠져나가는 증기를 관찰한다. 메인 창에서 라이브 습도 모니터를 관찰하거나 보고서 및 주변 환경에서 주변 습도 추적기를 엽니다.챔버 및 덮개 영역의 습도 수준을 확인합니다. 샘플 컵에 각 샘플의 5 마이크로리터를 추가합니다. 샘플 컵을 왼쪽에 있는 팁 1과 오른쪽에 있는 팁 2의 샘플과 함께 홀딩 트레이에 로드합니다.그런 다음 트레이를 좌석이 앉을 때까지 다시 기기에 밀어 넣습니다. 흡인 탭에서 각 팁에서 흡량할 볼륨에 대해 세 개의 마이크로리터를 선택합니다. 샘플 트레이가 안전하게 앉아 있는지 확인하고, 흡인을 클릭하고, 파이펫 스테이지가 디스펜서 헤드를 샘플 컵으로 이동하도록 관찰합니다.샘플 컵을 제거하고 액체 수준에서 드롭을 관찰하여 두 샘플모두의 성공적인 포부를 확인합니다. 검사 탭에서 각 팁을 검사 카메라로 보내 방해받지 않는 디스펜싱을 확인합니다. 각 팁의 액적 형성과 일치하도록 필요에 따라 진폭을 조정합니다.핀셋에 갓 플라즈마 청소 그리드를 로드하지만 아직 핀셋을 장착하지 않습니다. 습도 수준이 약 90~95%로 상승하여 에탄 컵을 채우고 검사 카메라 앞에서 두 팁의 최종 테스트 화재를 수행하여 방해가 없음을 확인합니다. Cryo 탭에서 팁 에서 카메라로 클릭합니다.에탄 컵을 확인하십시오. 에탄 얼음이 형성되면 필요에 따라 에탄 가스를 추가로 녹입니다. 그리드 스테이지에 그리드가 있는 핀셋을 장착합니다.Cryo 탭에서 그리드를 클릭하여 카메라로 이동하여 상단 카메라 모니터에 팁 이 면이 올바르게 배치되도록 합니다. 바이트 그리드, 큐 대상을 클릭한 다음 플런지합니다. 그리드 로봇을 명령하여 에탄에서 액체 질소로 그리드를 홉하고 잠긴 선반에 놓도록 명령할 때 확인을 클릭합니다.그리드의 이미지를 검사하여 그리드를 유지하거나 버릴지 여부를 결정합니다. 그리드를 유지하면 미리 냉각된 미세 팁 집게를 가장자리로 부드럽게 잡고 노치 왼쪽의 첫 번째 슬롯부터 시계 방향으로 가는 그리드 박스 슬롯에 배치합니다. 실험 뷰어를 사용하여 보고서 및 실험을 선택하여 플런지 시의 기계 설정 및 습도 측정과 함께 상부 및 하부 카메라의 그리드 이미지를 검토하고 비교합니다.RNA 폴리머라제를 105개의 베이스 페어DNA 올리고머에 혼합하여 단 하나의 시간 해결 스포티톤 세션 동안 제조된 그리드의 이미지가 150밀리초 전에 프로모터 서열을 운반하는 것으로 나타났다. 6개의 그리드 중 하나만 최적이 아닌 사악한 것을 보여줍니다. 유리화된 그리드의 얼음 증착 패턴은 상부 카메라 이미지에서 볼 수 있는 증착된 액체패턴과 밀접하게 일치합니다.혼합 된 샘플의 효과적인 사악이는 나노 와이어 덮인 그리드 바를 따라 발생하며 샘플이 착륙한 것과 인접한 사각형으로 거의 오버플로되지 않습니다. 얼음으로 채워진 사각형에서 얼음은 일반적으로 사각형 중앙의 구멍 내에서 가장 두껍으며 그리드 바에 가까운 구멍에서 얇아집니다. 그리드 바에 즉시 인접한 구멍은 나노 와이어에 근접하기 때문에 종종 비어 있습니다.나노와이어 그리드의 적절한 준비 와 처리는 혼합 샘플 그리드에 좋은 얼음 두께를 보장합니다. Spotiton 시스템은 또한 사용자가 동일한 그리드 유지 보수 세션 동안 혼합되지 않은 컨트롤의 컬렉션을 가능하게, 하나의 그리드에 별도로 두 샘플을 증착 할 수 있습니다. Spotiton은 세균성 유전자 발현에서 제1 중간제의 포획을 실시간으로 가능하게 했습니다.그들은 하위 초 기간에 형성하기 때문에, 그들의 구조는 지금까지 알려지지 않았습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

신경 세포와 Glia 개발 연구 랫 두뇌 집계 문화의 준비

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

연구

생물학

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인간의 DNA 수리 단백질의 유전자 연구는 모델 시스템으로 효모를 사용하여

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

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이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

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성인의 준비 Drosophila</em씬 Sectioning 및 현미경 분석을위한> 눈

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Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

집중 이온 빔의 극저온 전자 현미경 표본 준비하여 의미

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

거대 분자 3D 재건을위한 샘플 준비에 프라이머 높은 품질 데이터 수집 : 곳을 알아내는 - 전자 현미경의 것과하지 말아야를 수행

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

고분해능 극저온 전자 단층촬영을 위한 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling을 이용한 시료 전처리

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집 및 서브 단층 촬영 평균화

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Deep Learning-Based Segmentation of Cryo-Electron Tomograms

Deep Learning-based segmentation of Cryo-Electron Tomograms(극저온 전자 단층 촬영의 딥러닝 기반 분할)

Cryo-electron tomography (cryo-ET) allows researchers to image cells in their native, hydrated state at the highest resolution currently possible. The ...