Name: cryo-structured illumination microscopic data collection from cryogenically preserved cells
Uploaded: 2021-05-28T15:00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells at JoVE.com

وقد تلقى هذا المشروع تمويلا من مشروع أفق المفوضية الأوروبية 2020 iNEXT-Discovery. ويعترف .M دوبي بتمويل صندوق ويلكوم الاستئماني (107457/Z/15/Z). وقد نفذ هذا العمل بدعم من مصدر ضوء الماس، الصك B24 (الاقتراح BI25512). شكرنا لموظفي Micron وجميع مستخدمينا ومتعاونينا الممتازين لمساعدتنا في إنشاء cryoSIM وإمكاناته المترابطة.

<ol>
	<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Ball, G., Demmerle, J., Kaufmann, R., Davis, I., Dobbie, I. M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+A+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: A toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).</li><li>Kounatidis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Correlative+cryo-structured+illumination+fluorescence+and+soft+X-ray+microscopy+elucidates+reovirus+intracellular+release+pathway.">3D Correlative cryo-structured illumination fluorescence and soft X-ray microscopy elucidates reovirus intracellular release pathway.</a> Cell. 182 (2), 515-530 (2020).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Rego, E. H., Shao, L., Rego, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+structured+illumination+microscopy.">Practical structured illumination microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1251 (2015).</li><li>Phillips, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoSIM:+super-resolution+3D+structured+illumination+cryogenic+fluorescence+microscopy+for+correlated+ultrastructural+imaging.">CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging.</a> Optica. 7 (7), 802 (2020).</li><li>Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+fiducial-marker-free+correction+for+three-dimensional+chromatic+shift+in+biological+fluorescence+microscopy.">Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 8, 7583 (2018).</li><li>Kaufmann, R., Hagen, C., Gr&#252;newald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+cryo-microscopy:+current+challenges+and+prospects.">Fluorescence cryo-microscopy: current challenges and prospects.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20, 86-91 (2014).</li><li>Phillips, M. A., Pinto, D. M. S., Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPEKcheck-fluorescence+microscopy+spectral+visualisation+and+optimisation:+a+web+application,+javascript+library,+and+data+resource.">SPEKcheck-fluorescence microscopy spectral visualisation and optimisation: a web application, javascript library, and data resource.</a> Wellcome Open Research. 3, 92 (2018).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li></ol>

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.

3D SIM في درجات الحرارة المبردة لديها العديد من المزايا على تقنيات التصوير ريال أخرى لتصوير المواد البيولوجية المهزوسة. فإنه يتطلب صورا أقل بكثير لكل شريحة ض مقارنة مع غيرها من أساليب ريال، مما أدى إلى تشعيع أقل وفرصة أقل لتشكيل الكريستال الجليدي للعينات تهتز. كما أنها قادرة على تصوير خلايا كاملة ويمكن ربطها بالتصوير المقطعي بالأشعة السينية لمطابقة الهيكل مع الوظيفة. ومن المثير للاهتمام، أن معظم الفلوروفوريس المتاحة تجاريا وعلامات الفلورسينس تبيض أقل في ظل ظروف التبريد مما كانت عليه في درجة حرارة الغرفة. ومع ذلك ، نظرا لارتفاع غلة الكم من الفلوروفوريس الأكثر شيوعا في درجة حرارة الغرفة (أكثر من 80 ٪ في بعض الحالات) ، فإن الكسب المطلق الذي تم اكتشافه في الفوتونات لا يرجع إلى التغيرات في غلة الكم ، ولكن بسبب انخفاض في عمليات التبييض المعقدة. ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات حول غلة الفلوروفوريس في درجات الحرارة المبردة في 8.
ومن الأهمية بمكان أن العينات التي تصل إلى cryoSIM قد تم premapped باستخدام المجهر التبريد التقليدية مع قدرة brightfield لإنتاج شبكة "خريطة" التي تشمل تسليط الضوء على جميع AOIs المحتملة لمزيد من التصوير (الشكل 5). يتم تخصيص وقت الوصول في cryoSIM من خلال عملية تنافسية تنطوي على تقديم اقتراح ، والذي يتم تقييمه لاحقا لجدوى التقنية والتأثير الطبي الحيوي. الوقت في المعدات، لذلك، هو دائما "في قسط"، والشبكات premapped تسمح باستخدام الأكثر كفاءة من التخصيص. ومن الضروري أيضا أن تبقى العينة مهززة، لا سيما أثناء نقل العينة من حامل العينة إلى منصة التصوير، لتقليل تكوين بلورات الجليد والأضرار اللاحقة للعينة. يجب أن تكون العينة ذات نوعية جيدة لإنتاج أفضل صور SIM. وتتميز عينة معدة إعدادا جيدا بالسمات التالية: (أ) لن يكون لها تلوث بلوري جليدي، (ب) الشبكة المستخدمة ستكون شبكة مكتشف، (ج) الناقل سيكون مسطحا، (د) شبكة الشبكة وسطح الركيزة لن يكونا فلوريين تلقائيا، و(ه) لن تكون هناك فواصل في غشاء الدعم. ويمكن تحقيق هذه الشروط المسبقة عن طريق المعالجة الدقيقة للعينات وضمان بقاء العينات دائما في حيرة من العمر.
من المهم التحقق مسبقا مما إذا كانت عينات الفلوروفور المقترحة ستعطي إشارة كافية في مجهر cryoSIM. أدوات مثل SPEKCheck9 يمكن أن تساعد مع اختيار الفلوروفور الأمثل وتركيبات التصفية. إذا كانت هناك مشاكل في جمع البيانات الخام أو عملية إعادة الإعمار، يمكن أن تظهر القطع الأثرية في الصور بعد إعادة الإعمار. تم توثيق أمثلة من القطع الأثرية المختلفة من قبل Demmerle et al.10 يمكن مراجعة معلمات إعادة بناء الصورة في ملف سجل SoftWoRx إذا لم يكن إعادة الإعمار الأمثل عن طريق فتح ملف ملخص إعادة الإعمار. يجب أن يكون هناك تباعد أسطر متناسق عبر زوايا في قناة معينة واتساع متناسق نسبيا. يجب إجراء تحقيق أكثر وثيقة في التباين الذي يزيد عن 30٪ والقيم التي تزيد بشكل كبير عن 1 (إذا تم تطبيق تعويض حجم الخرز) ومن المرجح أن يشير إلى فشل عمليات إعادة الإعمار. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا استخدام برنامج SIMcheck2 في فيجي لإجراء فحوصات مختلفة على البيانات الخام وإعادة بنائها لتشخيص سبب الأخطاء في إعدادات معلمة التصوير أو إعادة البناء. يمكن أن يساعد فحص SIM وخريطة تباين التشكيل الخاصة به أيضا في تقييم جودة البيانات المعاد بناؤها من خلال تفسير المناطق التي من المرجح أن تكون هياكل حقيقية مقابل قطع أثرية.
انخفاض تباين التشكيل (يظهر بالألوان الداكنة، في الشكل 5E)داخل المنطقة النووية يعني أن هذه المنطقة ستكون أكثر عرضة للقطع الأثرية إعادة الإعمار، مما يعني أن أنماط التجزئة المبينة في النواة يمكن تصنيفها(الشكل 5D)كمصنوع فني. ومن الأرجح أن تعكس مناطق الإشارات الفلورية القوية بدقة الهياكل الأصلية في البيانات المجهزة. وفي المناطق ذات الإشارات الضعيفة التي توزع فيها الفلوروفوريس على مناطق أوسع، مثل السطح الكلي للحوزة، من المرجح أن تتعايش الإشارة الحقيقية مع تجهيز القطع الأثرية، وينبغي توخي الحذر في تفسير تلك البيانات. بعد فحص البيانات المعاد بناؤها كاملة المدى للتأكد من عدم وجود قطع أثرية غريبة ، وأن الخلفية هي غاوسية بشكل عام وتتركز بالقرب من الصفر ، يتم قص البيانات بشكل عام عند الصفر ، أو يجب أن تكون القيمة مشروطة - ذروة إشارة الخلفية - قريبة جدا من الصفر. وهذا يضمن أن النطاق الديناميكي للصورة المعروضة لا تهيمن عليه القطع الأثرية الخلفية السلبية. عندما يتوقع إشارة أضعف، ينبغي توخي المزيد من الحذر في تحليل الميزات وضمان أنها هياكل حقيقية بدلا من التحف إعادة الإعمار.
هناك بعض القيود على نظام التصوير. لأن مرحلة العينة مسطحة، فإن العينات ذات السماكة المتغيرة أو الشبكات غير المسطحة ليست مواضيع مثالية للتصوير. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان سيتم التصوير المترابط باستخدام التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة، لا ينبغي تصوير الخلايا القريبة من حدود الشبكة لأن هذه لن تكون مرئية في مجهر الأشعة السينية أثناء اكتساب سلسلة الميل. وأخيرا، فإن كمية النشاف للعينة قبل الهبوط في التجميد لها تأثير كبير على جودة التصوير؛ نتائج النشاف القليل جدا في العينات التي هي سميكة جدا، وإعطاء صور SIM دون المستوى الأمثل مع الضوضاء الخلفية العالية، في حين أن الكثير من النشاف يمكن أن يسبب الخلايا لتصبح مشوهة، وبالتالي أكثر عرضة للتلف الحرارة من شعاع الليزر الحادث. وباختصار، فإن cryoSIM هي أداة مجهرية مضانة قوية لتصوير العينات البيولوجية في مرحلة شبه أصلية ولها تطبيقات واسعة النطاق في العديد من المناطق.

أصبحت تقنيات التصوير ريال على نطاق واسع في متناول علماء الأحياء على مدى العقد الماضي1. وهي تسمح بتصوير عالي الدقة للعينات الموسومة بالفلورسنت بما يتجاوز حد الحيود. ومع ذلك ، فقد كان من الصعب تكييف طرق الفحص المجهري SR للعمل مع العينات في درجات الحرارة المبردة2. وهذا سيكون مفيدا للتصوير المترابط بالاشتراك مع التصوير المقطعي للإلكترون أو الأشعة السينية. في الآونة الأخيرة ، تم تكييف SIM للاستخدام مع عينات التبريد ، وقد ثبت بنجاح لتمكين الدراسات المترابطة للخلايا البيولوجية بالتزامن مع التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة (SXT)3 في خط الحزمة المترابط للتصوير بالتبريد B24 في مصدر الضوء الماسي Synchrotron (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html). يمكن لبطاقة SIM مضاعفة دقة المجهر التقليدي واسع المجال من خلال إضاءة العينة بأنماط مخططة للضوء (هامش Moiré) في ثلاث زوايا وعلى خمس مراحل. التداخل بين هذه الأنماط الخفيفة وفلورسينس عينة يمكن استخدامها لكشف حسابيا معلومات إضافية حول هياكل تحت الحيود4،5.
هناك العديد من مزايا SIM على تقنيات SR الأخرى للتطبيقات المبردة. أولا، يمكن أن تعمل دون الفلوروفورات وامض مصممة خصيصا. يمكن استخدام الفلوروفوريس التقليدية، مما يتيح الوصول إلى مجموعة واسعة من عوامل وضع العلامات الفلورية المحتملة6. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يتطلب فقط 15 صورة لكل شريحة z (في 3D ؛ 9 صور ل2D) ، في حين أن أساليب SR الأخرى تأخذ ما يقرب من 1000 صورة لكل شريحة ، مما يزيد من فرصة تسخين العينة وبالتالي يزيد من خطر تكوين بلورة الجليد ، والتي يمكن أن تسبب القطع الأثرية. وأخيرا، يمكن لهذه التقنية صورة عينات بيولوجية أكثر سمكا من أكثر من 10 ميكرومتر، مما يسمح للخلايا بأكملها أن تكون مصورة في حالتها شبه الأصلية6. وقد تم بناء cryoSIM باستخدام المكونات البصرية القياسية ومع برنامج مفتوح الوصول للتصوير، مما يجعل من السهل توثيق وتكرار إذا رغبتفي 6. و cryoSIM لديه 100x/0.9 هدف الفتحة العددية (انظر جدول المواد)؛ مزيد من المعلومات حول مكوناته البصرية، معلمات التصميم، والأداء وقد وصفت فيليبس وآخرون6 هنا، هذا البروتوكول يوضح كيفية استخدام المجهر cryoSIM بما في ذلك كيفية تحميل وتفريغ العينات على مرحلة التبريد، وكيفية جمع البيانات على المجهر، وكيفية إعادة بناء الصور SIM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Auto grids</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCT142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cockpit Software</td>
			<td>Oxford University</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/MicronOxford/cockpit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo compatible polyurethane container</td>
			<td>Jena bioscience</td>
			<td>CC-FD-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo TEM grid storage box</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Model#AutoGrid</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-SIM microscope</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made, see following reference for the design:&#160; Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, &#34;CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging,&#34; Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostage system</td>
			<td>Linkam Scientific Instruments</td>
			<td>CMS196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip surgical forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red FM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python Microscope Software</td>
			<td>Oxford University</td>
			<td></td>
			<td>https://www.python-microscope.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific dry paper wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark 7551</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIM Reconstruction Software</td>
			<td>softWoRx, GE Healthcare</td>
			<td>Version&#160; 6.5.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StitchM Software</td>
			<td>Diamond Light Source</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/DiamondLightSource/StitchM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids for samples</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools</td>
			<td>G200F1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-structured illumination microscopic data collection from cryogenically preserved cells

يسمح المجهر ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) المجسم للإضاءة (SIM) بتصوير الهياكل الخلوية ذات العلامات الفلورية بدقة أعلى من المجهر الفلوري التقليدي. هذه التقنية فائقة الدقة (SR) تمكن من تصور العمليات الجزيئية في خلايا كاملة ولديها القدرة على استخدامها جنبا إلى جنب مع المجهر الإلكتروني والتصوير المقطعي بالأشعة السينية لربط المعلومات الهيكلية والوظيفية. تم مؤخرا تشغيل مجهر SIM للعينات المحفوظة بالتبريد (cryoSIM) في خط الحزمة المترابط للتصوير بالتبريد B24 في السنكروترون في المملكة المتحدة. 
وقد صمم خصيصا للتصوير ثلاثي الأبعاد للعينات البيولوجية في درجات حرارة المبردة بطريقة تتوافق مع التصوير اللاحق لنفس العينات عن طريق طرق الفحص المجهري بالأشعة السينية مثل التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة. توفر هذه المقالة الفيديو أساليب مفصلة وبروتوكولات التصوير الناجح باستخدام cryoSIM. بالإضافة إلى التعليمات المتعلقة بتشغيل مجهر cryoSIM ، تم تضمين توصيات بشأن اختيار العينات والفلوروفوريس وإعدادات المعلمة. يتم عرض البروتوكول في عينات خلايا U2OS التي تم وضع علامة فلورية على الميتوكوندريا والتوبيولين.

كانت عينة تحتوي على خلايا U2OS ملطخة بمزيج من صبغ الهيكل الخلوي الأخضر microtubule وصبغ الميتوكوندريا الحمراء ، مما أدى إلى تلطيخ مكون microtubule من الهيكل الخلوي (الأخضر) والميتوكوندريا (الأحمر). أظهر التصوير اللاحق توطين الميتوكوندريا داخل الخلية وكذلك ترتيب الخلايا الدقيقة ، مما يسلط الضوء على الإطار الهيكلي الذي توفره للخلية وتجميع الهيكل الخلوي حول العضيات مثل النواة. القرار في cryoSIM أعلى بكثير من ذلك في المجهر epifluorescence القياسية (الشكل 5). يوضح الشكل 6 كيف يمكن استخدام "الخريطة" الفلورية من المجهر الفلوروري التقليدي لتحديد المناطق ذات الأهمية للتصوير والصورة المقابلة التي أعيد بناؤها بالتبريد من موقع على الشبكة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig01.jpg"> الشكل 1:مخطط تدفق يوضح مراحل بروتوكول التصوير cryoSIM. اختصار: cryoSIM = المجهر الإضاءة منظم كريو. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig02.jpg"> الشكل 2: مرحلة التبريد. (أ) الإعداد مرحلة التبريد. (ب) شبكة عينة تظهر التي تحتفظ بها ملقط مقلوب. (ج) مكونات مرحلة التبريد. وصفت منافذ الاتصال، مع الألوان المقابلة للبرتقالي: إمدادات الطاقة، الأصفر: غطاء المرحلة ساخنة، الأزرق: ديوار الخارجية، الأخضر: اتصال إلى جهاز الكمبيوتر. الاختصارات: PC = الكمبيوتر الشخصي; LN2 = النيتروجين السائل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig03.jpg"> الشكل 3: وجهات النظر من لوحات برنامج قمرة القيادة. (أ) لوحة رئيسية, (ب) الماكرو المرحلة XY, (C) عرض الفسيفساء, (D) مشاهدات الكاميرا. اختصار: SLM = المغير الضوء المكاني. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig04.jpg"> الشكل 4: وجهات النظر من لوحات برنامج قمرة القيادة. (أ) Z كومة تجربة موقع واحد. (ب) تجربة موقع واحد SI. (C) اختصارات لوحة المفاتيح لبرنامج cockpit المستخدم أثناء الحصول على الصورة. (د)المجهر cryoSIM في الموقع في بي 24 الحزمة في سينكروترون مصدر الضوء الماس. اختصار: cryoSIM = المجهر الإضاءة منظم كريو. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig05.jpg"> الشكل 5: قرار cryoSIM. (أ) عرض الفسيفساء لشبكة قيد الفحص. (ب) صورة برايتفيلد لمنطقة الاهتمام (AOI). (ج) صورة عريضة النطاق مقارنة مع صورة(D)SIM التي تظهر الزيادة في الدقة. يشير السهم الأبيض إلى قطع SIM اليدوية لإعادة الإعمار. (E) خريطة التباين التشكيل الجمع بين المعلومات كثافة بكسل من الصورة المعاد بناؤها مع معلومات اللون من نسبة التباين إلى الضوضاء التشكيل المعنية (MCNR) قيم البيانات الخام التي تم إنشاؤها بواسطة SIMCheck2. المناطق الساطعة والمظلمة تظهر تباينا عاليا ومنخفضا على التوالي. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. إعدادات التصوير CryoSIM: أطوال موجية مثيرة /انبعاثات: 488/525 نانومتر، قوة ليزر 50 ميجاوات، 50 مللي ثانية وقت التعرض و647/655 نانومتر، طاقة ليزر 20 ميجاوات، 5 مللي ثانية وقت التعرض. اختصار: cryoSIM = المجهر الإضاءة منظم كريو. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig06.jpg"> الشكل 6:إعادة بناء الصورة في cryoSIM من موقع على الشبكة في خريطة مضان من خريطة الفلورة التقليدية. (A، B) تراكب من خرائط الصور مشرق ومضان ولدت مع المجهر epifluorescence التقليدية. تستخدم هذه الخريطة لتحديد المناطق التي تهم الصورة لاحقا في cryoSIM. (ج)صورة cryoSIM المعاد بناؤها التي تم الحصول عليها في الموقع المبين في (B). اختصار: cryoSIM = المجهر الإضاءة منظم كريو. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells at JoVE.com

Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

يوضح هذا البروتوكول كيفية تصوير العينات البيولوجية المحفوظة بالتبريد باستخدام المجهر الإضاءة منظم التبريد. نحن نثبت المنهجية من خلال تصوير الهيكل الخلوي لخلايا U2OS.

جمع البيانات المجهرية للإضاءة المهيكلة بالتبريد من الخلايا المحفوظة بالتبريد

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

هذه الطريقة تجعل التصوير بالتبريد فائق الدقة ممكنا على الخلايا البيولوجية الكاملة لتحديد الهياكل الخلوية بدقة. ويمكن أيضا أن تستخدم جنبا إلى جنب مع غيرها من الطرائق كجزء من سير عمل التصوير المترابط. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أن التصوير فائق الدقة يمكن القيام به بسرعة في ظروف التبريد باستخدام الفلوروفوريس التقليدية وجرعات الضوء المنخفض نسبيا.CyroSIM هو أداة قوية توفر نظرة ثاقبة نحو فهم ديناميات البنية التحتية الخلوية استجابة للإشارات الداخلية أو الخارجية. ويشمل تطبيقه إنتاج اللقاحات ونشرها، ومراقبة الجودة، ومراقبة ما بعد السوق، وهندسة الأجسام المضادة وتحسينها، فضلا عن توصيف جزيئات النانو. مناورة عينات داخل مرحلة التبريد يأخذ الممارسة لضمان سلامة الشبكة.من الأفضل أيضا التعرف على عناصر التحكم في نافذة Cockpit قبل جمع البيانات. للبدء، قم بإزالة الغطاء من ديوار الخارجي لمرحلة التبريد وصب النيتروجين السائل المصفا حتى يصبح ممتلئا بالربع تقريبا. انتظر حتى يهدأ الغليان الأولي قبل صب المزيد وملء السفينة إلى حوالي ثلثي كامل.استبدال الغطاء بعناية، مشيرا فوهة بعيدا عن معالج كما يغلي النيتروجين السائل. بمجرد توقف النيتروجين السائل عن الخروج من المنفذ ، ضع أنبوب المنفذ على خشبة المسرح ديوار على مرحلة التبريد. قم بتوصيل مصدر الطاقة وتوصيل كابل USB وتوصيل ديوار الخارجي بالمرحلة.بعد تسليم النيتروجين السائل، اضغط على زر الإفراج على مرحلة التبريد للسماح لها بدخول غرفة العينة والانتظار لمدة 30 إلى 45 دقيقة حتى يبرد النظام ويستقر قبل البدء في الحصول على الصورة. استخدم مفتاح سداسي ال اكس على أداة كاسيت لفتح لوحتين من كاسيت نقل العينة. فتح لوحات واسعة بما يكفي لإسقاط الشبكة بين لوحات اثنين، ولكن لا تفتح إلى أقصى موقف.استخدام ملقط طويلة لرفع مربع الشبكة عينة من النيتروجين السائل. بدوره بحيث الشق محاذاة مع موقف التخزين داخل المرحلة ووضعه على خشبة المسرح. استخدم الجهاز المناسب لفتح غطاء صندوق التخزين إلى موضع العينة الصحيح.باستخدام ملقط مقلوب، وإزالة الشبكة TEM من حامل العينة، تزج داخل النيتروجين السائل ضمان أن يتم وضع الجانب فيلم الكربون بحيث أنها سوف تواجه في نهاية المطاف الهدف على جسر العينة وإسقاطه في موقف في شريط نقل العينة. أغلق خرطوشة العينة باستخدام مفتاح سداسي الهيكس الموجود على أداة الكاسيت. استخدم نقطة المغناطيس الموجودة على أداة الكاسيت لرفع الخرطوشة التي تحتوي على الشبكة وتركيبها على جسر العينة.يبقيه مغمورة أو قريبة من النيتروجين السائل وفي الاتجاه السليم. ضع شريط كاسيت مسطحا داخل دبابيس تحديد موضع الجسر وادفعه برفق لضمان إصلاحه. أغلق صندوق التخزين وأزله مع أي عينات متبقية.حرك فتحة غطاء مرحلة التبريد إلى موضع التصوير وأطفئ ضوء غرفة العينة. حرك المرحلة نحو البصريات لمحاذاتها تحت العدسة الموضوعية ، ثم أسقط الهدف برفق في موضعه باستخدام الرافعة ، مع ضمان أن تقع داخل غطاء مرحلة التبريد ، ولكنها لا تلمسها. تغطية المرحلة والبصريات مع ستارة سوداء مبهمة، ثم بدء تشغيل برنامج التحكم قمرة القيادة على جهاز الكمبيوتر cryoSIM. انقر على زر وضع القراءة لكل كاميرا وتعيينه إلى CONV3 ميغاهيرتز.تأكد من أن درجة حرارة كل كاميرا هي 80 درجة مئوية وأن مروحة الكاميرا خارج. بدوره على الكاميرا المنعكسة، تحت الضوء، واختيار المحيطة وتحت linkam، والتحقق من المكثف، ثم انقر على زر وضع الفيديو. في إطار عرض الفسيفساء، قم بالتصغير لرؤية مخطط الشبكة.انقر على البحث عن المرحلة إذا كان لا يمكن أن ينظر إليها ووسط الشبكة عن طريق النقر المزدوج الأيسر في منتصف الدائرة. استخدم المفاتيح لأعلى ولأعلى لتركيز العينة حتى يتم التركيز على فيلم دعم الشبكة أو أي ميزة أخرى ذات صلة. استخدم المفاتيح التسعة والثلاثة الموجودة على اللوحة الرقمية لتغيير الخطوة Z.بمجرد أن يتم توسيط المرحلة، قم بإيقاف تشغيل وضع الفيديو. جمع فسيفساء الضوء المرئي من خلال النقر على تشغيل الفسيفساء في عرض الفسيفساء لإنتاج البلاط من الصور الضوئية المرئية التي دوامة إلى الخارج من المركز. حفظ طريقة العرض عن طريق النقر على حفظ الفسيفساء.تفقد فسيفساء Bright-field إلى جانب أي صور خريطة مضان سابقة عن طريق إيقاف تشغيل الضوء المحيط والمكثف وكذلك وضع الفيديو ، ثم قم بتشغيل ليزر الإثارة المطلوب واختر الكاميرا والتصفية المقابلة ، في البداية بسرعة 50 ملليواط لمدة 50 مللي ثانية. اضغط على صفر لالتقاط صورة ونجمة على تباين تلقائي. بدلا من ذلك، قم بضبط التباين يدويا باستخدام شريط التمرير في أسفل الصورة.مرة واحدة تم العثور على خلايا مثيرة للاهتمام بيولوجيا مع مضان مناسبة، ووضع علامة على مواقعها باستخدام زر موقع علامة في عرض الفسيفساء. استمر في وضع علامة على جميع المواقع المحتملة قبل بدء اكتساب الصورة. إعادة حفظ الفسيفساء مع المواقع التي تم وضع علامة عليها عن طريق النقر على حفظ المواقع لملف.لغرز صورة الفسيفساء باستخدام برنامج stitchEm، اسحب وأسقط ملف الفسيفساء النصي في ملف stitchEm مع BAT التمديد وحفظ صورة TIF المدمجة من البلاط الفسيفساء في نفس المجلد. لحفظ صورة مع المواقع التي تم وضع علامة عليها، اسحب ملف الفسيفساء النصي وملف العلامات النصي وأسقطه في الرمز في نفس الوقت. تعيين وقت التعرض بالليزر استنادا إلى التهم والنطاق الديناميكي في صورة مضان في الجزء السفلي من إطار عرض الكاميرا.اختر أي مرشح لتطبيق وتحسين إعدادات كل طول موجي من ضوء الإثارة لاستخدامها، وتحول كل ليزر على حدة. انقر على كل من الكاميرات لتشغيلها. العودة إلى أحد المواقع ملحوظ والتركيز على العمق المطلوب مرة أخرى.مرة واحدة في التركيز في مجال الاهتمام، انتقل من التركيز باستخدام مفتاح السهم لأعلى في إطار XY على مرحلة الماكرو لاختيار ارتفاع المكدس Z للحصول على وانقر على حفظ أعلى. الخروج من التركيز باستخدام مفتاح السهم لأسفل، انقر على حفظ أسفل، ثم على الذهاب إلى المركز، والتحقق من أن الصورة لا تزال في التركيز. في إطار Cockpit حدد تجربة الموقع الواحد.من القائمة المنسدلة حدد إضاءة منظمة. تغيير ارتفاع المكدس بحيث يساوي ارتفاع Z بالإضافة إلى متر واحد صغير. أدخل أوقات التعرض بالمللي ثانية لأجهزة الليزر 405 و488 نانومتر في الصف العلوي للكاميرا المنعكسة وأوقات التعرض لأشعة الليزر 561 و647 نانومتر في الصف السفلي للكاميرا المرسلة.إدخال اسم ملف وانقر على التحديث لإنتاج ملف جديد يحتوي على التاريخ والوقت دون تجاوز الملفات السابقة، ثم انقر على ابدأ. إذا كان النيتروجين السائل ديوار يعيد تعبئة مرحلة التبريد أثناء الحصول على الصورة، قم بإجهاض العملية عن طريق النقر على زر ABORT في برنامج Cockpit. في كل موقف، وجمع Z-كومة باستخدام الضوء المرئي عن طريق إيقاف أشعة الليزر والتبديل على الضوء المحيط والمكثف.ضمن تجربة الموقع الواحد، حدد Z-stack وحدد الضوء المحيط إلى 20 مللي ثانية من التعرض، مع الحفاظ على ارتفاع Z. كرر هذه العملية لكافة المواقع التي تم وضع علامة عليها. بعد الانتهاء من التصوير إلغاء إرساء المرحلة وإزالة جميع العينات.إيقاف ضوء غرفة العينة. افصل ديوار الخارجي وتخلص من أي نيتروجين سائل متبقي في حاوية أخرى متوافقة مع التبريد، مما يسمح للديوار بالعودة بأمان إلى درجة حرارة طبيعية. انتظر حتى يصبح خيار خبز عرض مرحلة التبريد متاحا بعد عدم بقاء النيتروجين السائل في مرحلة Dewar.اضغط على زر الخبز للدخول في وضع التدفئة. وضع غطاء المكونات على مرحلة التبريد. القرار في cryoSIM أعلى بكثير من ذلك في المجهر epifluorescence القياسية.يمكن استخدام خريطة الفلورسينس من مجهر الفلوروريسينسي التقليدي لتحديد المناطق ذات الأهمية للتصوير ويمكن الحصول على صورة cryoSIM المقابلة من موقع على الشبكة. كانت عينة تحتوي على خلايا U2OS ملطخة بمزيج من صبغ الهيكل الخلوي microtubule الأخضر وصبغة الميتوكوندريا الحمراء مما أدى إلى تلطيخ مكون microtubule من الهيكل الخلوي والميتوكوندريا. أظهر التصوير اللاحق توطين الميتوكوندريا داخل الخلية ، وكذلك ترتيب الخلايا الدقيقة ، مما يسلط الضوء على الإطار الهيكلي الذي توفره للخلية وتجميع الهيكل الخلوي حول العضيات.يمكن لعملية إعادة بناء SIM إنتاج القطع الأثرية التي يمكن تحديدها باستخدام SIMCheck ، وهو مكون إضافي مجاني imageJ. تظهر خريطة تباين التشكيل هذه التي تم إنشاؤها باستخدام SIMCheck مناطق تباين التشكيل المنخفض داخل منطقة النواة ، مما يشير إلى أن هذه المنطقة ستكون أكثر عرضة لقطع إعادة الإعمار. يشير السهم الأبيض إلى قطعة أثرية لإعادة البناء.عند محاولة هذا البروتوكول تأكد من أن العينة لا تزال مغمورة أو قريبة من النيتروجين السائل في جميع الأوقات لتجنب إزالة التزجيج. كما انتبه إلى أوقات التعرض والتعول في النطاق الديناميكي ، لأن هذا يؤثر على جودة البيانات ويتجنب تلف الليزر للعينة. بعد التصوير بالتبريد، يمكن تصوير نفس العينات مع طرائق أخرى مثل التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة، والتي لدينا هنا في B24 Beamline.من خلال الجمع بين صور cryoSIM والصور التي تحتوي على معلومات هيكلية حول الخلية ، يمكننا الإجابة على الأسئلة الإضافية الرئيسية حول البنية الفوقية الخلوية والوظيفة.

Research

JoVE Journal

Biology

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

كوكتيل من الدم والسرطان حدوة الحصان الأميركي ، الليمول Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

إعداد الكبار ذبابة الفاكهة لعيون Sectioning رقيقة والتحليل المجهري

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

جمع السائل المنوي إنفلونزا الطيور بالتدليك المذرق وعزل الحمض النووي من الحيوانات المنوية

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

طريقة CryoAPEX لتحليل المجهر الإلكتروني لتوطين بروتين الغشاء داخل الخلايا المحفوظة فائقة الهيكلية

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

عزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية عالية الجودة للقياسات المتزامنة لتيار الكالسيوم2+ العابر وتيار الكالسيوم من النوع L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

جمع وتحديد حبوب اللقاح من مستعمرات نحل العسل

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

جمع الأنسجة واستخراج الحمض النووي الريبي من مفصل الركبة هشاشة العظام البشرية

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

تصوير المجالات التكرارية في الكروماتين المحفوظ بالبنية الفائقة بواسطة التصوير المقطعي الإلكتروني

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

التصوير المقطعي بالتبريد الإلكتروني جمع البيانات عن بعد ومتوسط التصوير المقطعي الفرعي

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...