Name: cryo-structured illumination microscopic data collection from cryogenically preserved cells
Uploaded: 2021-05-28T15:00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells at JoVE.com

פרויקט זה קיבל מימון מפרויקט iNEXT-Discovery של הנציבות האירופית Horizon 2020. אני.M דובי מודה במימון מקרן Wellcome (107457/Z/15/Z). עבודה זו בוצעה בתמיכת מקור אור היהלום, מכשיר B24 (הצעה BI25512). תודתנו לצוות במיקרון ולכל המשתמשים ומשתפי הפעולה המצוינים שלנו שעזרו לנו לבסס את cryoSIM ואת הפוטנציאל המתאם שלו.

<ol>
	<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Ball, G., Demmerle, J., Kaufmann, R., Davis, I., Dobbie, I. M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+A+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: A toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).</li><li>Kounatidis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Correlative+cryo-structured+illumination+fluorescence+and+soft+X-ray+microscopy+elucidates+reovirus+intracellular+release+pathway.">3D Correlative cryo-structured illumination fluorescence and soft X-ray microscopy elucidates reovirus intracellular release pathway.</a> Cell. 182 (2), 515-530 (2020).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Rego, E. H., Shao, L., Rego, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+structured+illumination+microscopy.">Practical structured illumination microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1251 (2015).</li><li>Phillips, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoSIM:+super-resolution+3D+structured+illumination+cryogenic+fluorescence+microscopy+for+correlated+ultrastructural+imaging.">CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging.</a> Optica. 7 (7), 802 (2020).</li><li>Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+fiducial-marker-free+correction+for+three-dimensional+chromatic+shift+in+biological+fluorescence+microscopy.">Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 8, 7583 (2018).</li><li>Kaufmann, R., Hagen, C., Gr&#252;newald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+cryo-microscopy:+current+challenges+and+prospects.">Fluorescence cryo-microscopy: current challenges and prospects.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20, 86-91 (2014).</li><li>Phillips, M. A., Pinto, D. M. S., Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPEKcheck-fluorescence+microscopy+spectral+visualisation+and+optimisation:+a+web+application,+javascript+library,+and+data+resource.">SPEKcheck-fluorescence microscopy spectral visualisation and optimisation: a web application, javascript library, and data resource.</a> Wellcome Open Research. 3, 92 (2018).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

3D SIM בטמפרטורות קריוגניות יש יתרונות רבים על פני טכניקות הדמיה SR אחרות עבור הדמיה חומר ביולוגי מנוצל. זה דורש באופן משמעותי פחות תמונות לכל פרוסת z בהשוואה לשיטות SR אחרות, וכתוצאה מכך פחות הקרנה וסיכוי נמוך יותר של היווצרות גבישי קרח עבור דגימות מרוסנות. הוא גם מסוגל לדמיין תאים שלמים וניתן לתאם אותו עם טומוגרפיה של קרני רנטגן כדי להתאים את המבנה לתפקוד. מעניין, רוב פלואורופור זמין מסחרית ותגי פלואורסצנטיות להלבין פחות בתנאים קריוגניים מאשר בטמפרטורת החדר. עם זאת, בהתחשב בתשואה הקוונטית הגבוהה של הפלורופורים הנפוצים ביותר בטמפרטורת החדר (יותר מ -80% במקרים מסוימים), הרווח המוחלט שזוהה בפוטונים אינו נובע משינויים בתפוקה הקוונטית, אלא מירידה בתהליכי ההלבנה המורכבים. מידע נוסף על התשואה של פלואורופור בטמפרטורות קריוגניות ניתן למצוא ב 8.
זה קריטי כי דגימות המגיעות cryoSIM כבר ממופה מראש באמצעות מיקרוסקופ cryofluorescence קונבנציונאלי עם יכולת brightfield לייצר רשת "מפה" הכוללת הדגשת כל AOIs פוטנציאליים להדמיה נוספת (איור 5). זמן הגישה ב cryoSIM מוקצה באמצעות הליך תחרותי הכולל הגשת הצעה, אשר לאחר מכן מוערך עבור היתכנות טכניקה והשפעה ביו-רפואית. הזמן בציוד, אם כן, הוא תמיד "בפרמיה", ורשתות ממופות מראש מאפשרות את השימוש היעיל ביותר בהקצאה. זה גם חיוני כי המדגם נשמר vitrified, במיוחד במהלך העברת מדגם מבעל המדגם לפלטפורמת ההדמיה, כדי למזער את היווצרות גבישי קרח ונזק מדגם לאחר מכן. המדגם צריך להיות באיכות טובה כדי לייצר את תמונות ה- SIM הטובות ביותר. מדגם מוכן היטב יתאפיין בתכונות הבאות: (א) לא יהיה לה זיהום בגביש קרח, (ב) הרשת המשמשת תהיה רשת איתור, (ג) המוביל יהיה שטוח, (ד) רשת הרשת ומשטח המצע לא יהיו פלואורסצנטיים אוטומטיים, ו- (ה) לא יהיו שברים בקרום התמיכה. תנאים מוקדמים אלה יכולים להיות מושגים על ידי טיפול מדגם זהיר ולהבטיח כי דגימות תמיד להישאר vitrified.
חשוב לבדוק מראש אם פלואורופורים מדגם מוצע ייתן מספיק אות במיקרוסקופ cryoSIM. כלים כגון SPEKCheck9 יכולים לסייע בבחירת שילובי הפלורופור והסינון האופטימליים. אם יש בעיות באיסוף הנתונים הגולמיים או בתהליך השחזור, חפצים יכולים להופיע בתמונות לאחר השחזור. דוגמאות לחפצים שונים תועדו על ידי Demmerle et al.10 ניתן לסקור את הפרמטרים של שחזור התמונה בקובץ יומן הרישום SoftWoRx אם השחזור אינו אופטימלי על ידי פתיחת קובץ סיכום השחזור. צריך להיות מרווח קו עקבי על פני זוויות בערוץ נתון ומשכולת עקבית יחסית. וריאציה של יותר מ-30% וערכים מעל 1 (אם יוחל פיצוי גודל חרוז) צריכה להיחקר מקרוב יותר וסביר להניח שהיא תצביע על שחזורים כושלים. בנוסף, תוכנת SIMcheck2 בפיג'י יכולה לשמש גם לביצוע בדיקות שונות על הנתונים הגולמיים והמשוחזרים כדי לאבחן את הגורם לשגיאות בהגדרות פרמטר ההדמיה או השחזור. בדיקת SIM ומפת הניגודיות של האפנון שלה יכולות גם לסייע בהערכת איכות הנתונים המשוחזרים על ידי פרשנות אילו אזורים בתמונה צפויים להיות מבנים אמיתיים לעומת חפצים.
ניגודיות אפנון נמוכה (המוצגת על ידי צבע כהה, באיור 5E) בתוך האזור הגרעיני פירושה שאזור זה יהיה רגיש יותר לשחזור חפצים, ולכן מרמז על כך שניתן לסווג את דפוסי החשיש המוצגים בגרעין (איור 5D) כחפץ. אזורי איתות פלואורסצנטיות חזקים נוטים יותר לשקף במדויק מבנים מקומיים בנתונים המעובדים. באזורים של אות חלש שבו פלואורופורים מופצים על פני אזורים רחבים יותר, כגון פני השטח הכוללים של נצנצים, סביר להניח כי איתות אמיתי מתקיימים עם חפצי עיבוד, ויש לנקוט בפרשנות של נתונים אלה. לאחר בדיקה של הנתונים המשוחזרים לטווח מלא כדי להבטיח שאין ממצאים מוזרים, וכי הרקע הוא בדרך כלל גאוסי ומרוכז קרוב לאפס, הנתונים נחתכים בדרך כלל באפס, או הערך המודאלי - שיא אות הרקע - צריך להיות קרוב מאוד לאפס. פעולה זו מבטיחה שהטווח הדינאמי של התמונה המוצגת לא ישלוט בממצאי רקע שליליים. כאשר אות חלש יותר צפוי, יש לנקוט משנה זהירות בניתוח התכונות ולהבטיח שהם מבנים אמיתיים ולא חפצים שחזור.
ישנן כמה מגבלות של מערכת ההדמיה. מכיוון שהשלב לדוגמה שטוח, דגימות עם עובי משתנה או רשתות שאינן שטוחות אינן נושאים אידיאליים להדמיה. בנוסף, אם הדמיה קורלטיבית תיעשה באמצעות טומוגרפיה רנטגן רכה, אין לדמיין תאים ליד גבולות הרשת מכיוון שאלה לא יהיו גלויים במיקרוסקופ קרני הרנטגן במהלך רכישת סדרת הטיה. לבסוף, כמות הנפיחות של המדגם לפני הקפאת הצלילה יש השפעה משמעותית על איכות ההדמיה; סופג קטן מדי גורם לדגימות עבות מדי, המעניקות תמונות SIM תת-אופטימליות עם רעשי רקע גבוהים, בעוד שיותר מדי כתמים עלולים לגרום לתאים להיות מעוותים ולכן רגישים יותר לנזקי חום מקרן הלייזר של האירוע. לסיכום, cryoSIM הוא כלי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי רב עוצמה להדמיית דגימות ביולוגיות בתלת-ממד בשלב כמעט מקורי ויש לו יישומים רחבים בתחומים רבים.

טכניקות הדמיה SR הפכו נגישות באופן נרחב לביולוגים בעשור האחרון1. הם מאפשרים הדמיה ברזולוציה גבוהה של דגימות מתויגות פלואורסצנטיות מעבר למגבלת עקיפה. עם זאת, זה כבר מאתגר להתאים שיטות מיקרוסקופיה SR לעבוד עם דגימות בטמפרטורות קריוגניות2. זה יהיה יתרון עבור הדמיה מתאם בשילוב עם אלקטרון או טומוגרפיה רנטגן. לאחרונה, SIM הותאם לשימוש עם דגימות קריוגניות והוכח בהצלחה כדי לאפשר מחקרים מתאם של תאים ביולוגיים בשילוב עם טומוגרפיהרנטגן רכה (SXT) 3 בקו הקרן קריו-הדמיה קורלטיבי B24 ב סינכרוטרון מקור אור היהלום (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html). SIM יכול להכפיל את הרזולוציה של מיקרוסקופיה רחבת שדה קונבנציונלית על ידי הארת המדגם עם דפוסי אור מפוספסים (שולי Moiré) בשלוש זוויות ובחמשה שלבים. ההפרעה בין דפוסי אור אלה לבין פלואורסצנטיות מדגם ניתן להשתמש כדי לחשוף באופן חישובי מידע נוסף על מבנים תת עקיפה4,5.
ישנם מספר יתרונות של SIM על פני טכניקות SR אחרות עבור יישומים קריוגניים. ראשית, זה יכול לעבוד ללא פלואורופורים מהבהבים שתוכננו במיוחד; פלואורופורים קונבנציונליים ניתן להשתמש, נותן גישה למגוון רחב יותר של סוכני תיוג פלואורסצנטי פוטנציאלי6. בנוסף, הוא דורש רק 15 תמונות לכל פרוסת z (בתלת-ממד; 9 תמונות ל-2D), בעוד ששיטות SR אחרות לוקחות כ-1,000 תמונות לפרוסה, מה שמגדיל את הסיכוי שהדגימה תחומם ולכן מגביר את הסיכון להיווצרות גבישי קרח, מה שעלול לגרום לחפצים. לבסוף, טכניקה זו יכולה לדמיין דגימות ביולוגיות עבות יותר של מעל 10 מיקרומטר, ומאפשרת לתאים שלמים להיקרא במצבם הכמעט ילידי6. CryoSIM נבנה באמצעות רכיבים אופטיים סטנדרטיים ועם תוכנה לגישה פתוחה להדמיה, מה שמקל על תיעוד ושכפול אם תרצה6. CryoSIM יש 100x/ 0.9 מטרה צמצם מספרי (ראה טבלת החומרים); מידע נוסף על הרכיבים האופטיים, פרמטרי העיצוב והביצועים שלו תואר על ידי פיליפס ואח'. 6 הנה, פרוטוקול זה מדגים כיצד להשתמש במיקרוסקופ cryoSIM כולל כיצד לטעון ולפרוק דגימות בשלב הקריוגני, כיצד לאסוף נתונים על המיקרוסקופ וכיצד לשחזר את תמונות ה- SIM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Auto grids</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCT142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cockpit Software</td>
			<td>Oxford University</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/MicronOxford/cockpit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo compatible polyurethane container</td>
			<td>Jena bioscience</td>
			<td>CC-FD-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo TEM grid storage box</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Model#AutoGrid</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-SIM microscope</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made, see following reference for the design:&#160; Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, &#34;CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging,&#34; Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostage system</td>
			<td>Linkam Scientific Instruments</td>
			<td>CMS196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip surgical forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red FM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python Microscope Software</td>
			<td>Oxford University</td>
			<td></td>
			<td>https://www.python-microscope.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific dry paper wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark 7551</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIM Reconstruction Software</td>
			<td>softWoRx, GE Healthcare</td>
			<td>Version&#160; 6.5.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StitchM Software</td>
			<td>Diamond Light Source</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/DiamondLightSource/StitchM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids for samples</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools</td>
			<td>G200F1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-structured illumination microscopic data collection from cryogenically preserved cells

מיקרוסקופיית תאורה מובנית תלת מימדית (SIM) מאפשרת הדמיה של מבנים תאיים מתויגים פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה יותר ממיקרוסקופיית פלואורסצנטיות קונבנציונלית. טכניקה זו של רזולוציית-על (SR) מאפשרת הדמיה של תהליכים מולקולריים בתאים שלמים ויש לה פוטנציאל לשמש בשילוב עם מיקרוסקופיה אלקטרונית וטומוגרפיה של קרני רנטגן כדי לתאם מידע מבני ותפקודי. מיקרוסקופ SIM עבור דגימות שהשתמרו קריוגנית (cryoSIM) הוזמן לאחרונה בקו הקרן המתאם להדמיית קריו B24 בסינכרוטרון בבריטניה. 
הוא תוכנן במיוחד עבור הדמיה תלת ממדית של דגימות ביולוגיות בטמפרטורות קריוגניות באופן התואם להדמיה עוקבת של אותן דגימות בשיטות מיקרוסקופיה של קרני רנטגן כגון טומוגרפיה של קרני רנטגן רכות. מאמר וידאו זה מספק שיטות ופרוטוקולים מפורטים להדמיה מוצלחת באמצעות cryoSIM. בנוסף להוראות על פעולת המיקרוסקופ cryoSIM, נכללו המלצות לגבי בחירת דגימות, פלואורופורים והגדרות פרמטר. הפרוטוקול מוצג בדגימות תא U2OS שהמיטוכונדריה והטובולין שלהם תויגו באופן פלואורסצנטי.

מדגם המכיל תאי U2OS היה מוכתם בתערובת של צבע ציטוסקופי מיקרוטובול ירוק וצבע מיטוכונדריה אדום, וכתוצאה מכך הכתים את רכיב המיקרוטובול של הציטוסקלטון (ירוק) והמיטוכונדריה (אדום). ההדמיה שלאחר מכן הראתה לוקליזציה של המיטוכונדריה בתוך התא, כמו גם את הסידור של microtubules, הדגשת המסגרת המבנית שהם מספקים לתא ואת ההרכבה של ציטוסקלטון סביב אברונים כגון הגרעין. הרזולוציה ב-cryoSIM גבוהה משמעותית מזו שבמיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית סטנדרטית (איור 5). איור 6 מדגים כיצד ניתן להשתמש ב"מפה" הפלואורסצנטית ממיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי קונבנציונלי כדי לאתר אזורי עניין להדמיה ולתמונה המשוחזרת של cryoSIM ממיקום ברשת.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig01.jpg"> איור 1: תרשים זרימה המציג את שלבי פרוטוקול ההדמיה cryoSIM. קיצור: cryoSIM = מיקרוסקופיית תאורה מובנית קריו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig02.jpg"> איור 2:שלב ההקפאה. (B)רשת מדגם המוצגת המוחזקת על-ידי מלקחיים הפוכים. (ג)מרכיבי שלב ההקפאה. יציאות החיבור מסומנות, עם הצבעים המתאימים לכתום: ספק כוח, צהוב: מכסה במה מחומם, כחול: dewar חיצוני, ירוק: חיבור למחשב. קיצורים: מחשב = מחשב אישי; LN2 = חנקן נוזלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig03.jpg"> איור 3: תצוגות של לוחות התוכנה של תא הטייס. (A) החלונית הראשית, (B) תצוגת פסיפס של שלב המאקרו XY (C) (D). קיצור: SLM = אפנון אור מרחבי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig04.jpg"> איור 4: תצוגות של לוחות התוכנה של תא הטייס. (A) Z מחסנית ניסוי באתר יחיד. (B)ניסוי אתר יחיד SI. (C)קיצורי מקשים עבור תוכנת תא הטייס המשמשת במהלך רכישת תמונה. (D)מיקרוסקופ cryoSIM נמצא באתר ב- B24 ב- Synchrotron מקור אור היהלום. קיצור: cryoSIM = מיקרוסקופיית תאורה מובנית קריו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig05.jpg"> איור 5: רזולוציית קריו-אסים. (א)מבט פסיפס על רשת הנבדקת. (B)תמונת ברייטפילד של אזור עניין (AOI). (C)תמונת שדה מדומה בהשוואה לתמונת ה- SIM(D)שלה המציגה את העלייה ברזולוציה. החץ הלבן מציין חפצים לשחזור SIM. (E)מפת ניגודיות אפנון המשלבת את מידע עוצמת הפיקסלים של התמונה המשוחזרת עם מידע הצבע של ערכי יחס הניגודיות לרעש (MCNR) של הנתונים הגולמיים שנוצרו על-ידי SIMCheck2. האזורים הבהירים והכהים מראים ניגודיות גבוהה ונמוכה, בהתאמה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. הגדרות הדמיית CryoSIM: אורכי גל עירור/פליטה: 488/525 ננומטר, כוח לייזר של 50 מגה-ואט, זמן חשיפה של 50 ms ו-647/655 ננומטר, כוח לייזר של 20 מגה-ואט, זמן חשיפה של 5 מילישניות. קיצור: cryoSIM = מיקרוסקופיית תאורה מובנית קריו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig06.jpg"> איור 6: שחזור תמונה בקריו-אסים ממיקום על הרשת במפת פלואורסצנטיות ממפת אפיפלואורסצנטיות קונבנציונלית. (A,B)שכבת-על של מפות תמונה של ברייטפילד ופלואורסצנטיות שנוצרו באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי קונבנציונלי. מפה זו משמשת לאיתור אזורים מעניינים לתמונה לאחר מכן ב- cryoSIM. (C)תמונת cryoSIM המשוחזרת המתקבלת במיקום המוצג ב- (B). קיצור: cryoSIM = מיקרוסקופיית תאורה מובנית קריו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells at JoVE.com

Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

פרוטוקול זה מדגים כיצד לדמיין דגימות ביולוגיות שנשמרו על ידי קריו באמצעות מיקרוסקופיית תאורה מובנית קריו. אנו מדגימים את המתודולוגיה על ידי הדמיית הציטוסקלטון של תאי U2OS.

איסוף נתונים מיקרוסקופי תאורה מובנה קריו מתאים שהשתמרו בהקפאה

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

שיטה זו מאפשרת הדמיית הקפאה ברזולוציית-על על תאים ביולוגיים שלמים כדי לזהות במדויק מבנים תאיים. ניתן להשתמש בו גם בשילוב עם שיטות אחרות כחלק מזרימת הדמיה מתאמת. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם כי הדמיה ברזולוציית סופר יכול להיעשות במהירות בתנאים קריוגניים באמצעות פלואורופורים קונבנציונליים ומנות אור נמוכות יחסית.CyroSIM הוא כלי רב עוצמה המספק תובנה להבנת דינמיקת האולטרה-מבנה התאי בתגובה לרמזים פנימיים או חיצוניים. היישום שלה כולל ייצור חיסון והתגלגלות, בקרת איכות, מעקב לאחר השוק, הנדסת נוגדנים ואופטימיזציה, כמו גם אפיון חלקיקים ננו. דגימות תמרון בתוך שלב ההקפאה לוקח בפועל כדי להבטיח את הבטיחות של הרשת.מומלץ גם להכיר את הפקדים בחלון תא הטייס לפני איסוף הנתונים. כדי להתחיל, להסיר את המכסה מן Dewar החיצוני של שלב ההקפאה ויוצקים חנקן נוזלי מסונן עד שהוא כרבע מלא. המתן עד שהרתיחה הראשונית שוככת לפני השופכים יותר וממלאים את הכלי כשני שליש מלאים.החלף את המכסה בזהירות, הצבעה על הזרבובית מן המטפל כמו חנקן נוזלי רותח החוצה. לאחר שהחנקן הנוזלי יפסיק לצאת מהשקע, הנח את צינור השקע מעל הבמה דיואר על במת הקריו. חבר את מקור החשמל, חבר את כבל ה- USB וחבר את Dewar החיצוני לשלב.לאחר מסירת חנקן נוזלי, לחץ על כפתור השחרור בשלב הקריו כדי לאפשר לו להיכנס לתא המדגם ולחכות 30 עד 45 דקות עד שהמערכת תתקרר ותתייצב לפני תחילת רכישת התמונה. השתמש במקש ההקס בכלי הקלטת כדי לפתוח את שתי הלוחות של קלטת ההעברה לדוגמה. פתח את הלוחות רחבים מספיק כדי להפיל את הרשת בין שתי הצלחות, אך אל תפתחו למיקום המרבי.השתמש במלקחיים ארוכים כדי להרים את תיבת הרשת לדוגמה מתוך החנקן הנוזלי. סובבו אותו כך שהחרוך יתיישר עם מיקום האחסון בתוך הבמה והנחו אותו על הבמה. השתמש בהתקן המתאים כדי לפתוח את מכסה תיבת האחסון למיקום הדגימה הנכון.באמצעות מלקחיים הפוכים, הסר את רשת TEM ממחזיק המדגם, טבול אותה בתוך החנקן הנוזלי והבטיח שצד סרט הפחמן יוצב כך שבסופו של דבר הוא יעמוד מול המטרה על גשר המדגם ויפיל אותה למיקום בקלטת ההעברה לדוגמה. סגור את המחסנית לדוגמה באמצעות מקש הכיוה בכלי הקלטת. השתמש בנקודת המגנט בכלי הקלטת כדי להרים ולהרכיב את המחסנית המכילה את הרשת על הגשר לדוגמה.שמור אותו שקוע או קרוב לחנקן הנוזלי ובכיוון הנכון. מניחים את הקלטת שטוחה בתוך סיכות המיקום של הגשר ודחוף אותה בעדינות כדי להבטיח שהיא תתוקן. סגור והסר את תיבת האחסון יחד עם כל הדוגמאות הנותרות.הזז את פתח המכסה בשלב ההקפאה לתנוחת ההדמיה וכבה את אור תא הדגימה. החלק את הבמה לכיוון האופטיקה כדי ליישר אותה מתחת לעדשה האובייקטיבית, ולאחר מכן שחרר בעדינות את המטרה למיקום באמצעות הידית, והבטח שהיא נחה בתוך המכסה של שלב ההקפאה, אך אינה נוגעת בה. לכסות את הבמה ואת אופטיקה עם וילון שחור אטום, ולאחר מכן להפעיל את תוכנת הבקרה קוקפיט על מחשב cryoSIM. לחץ על לחצן מצב הקריאה עבור כל מצלמה והגדר אותו ל- CONV3 מגה-הרץ.בדוק כי הטמפרטורה של כל מצלמה היא 80 מעלות צלזיוס וכי מאוורר המצלמה כבוי. הפעל את המצלמה המוחזרת, תחת אור, בחר סביבה ותחת linkam, בדוק את המחזק ולאחר מכן לחץ על לחצן מצב הווידאו. בחלון התצוגה Mosaic, הקטן את התצוגה כדי לראות את מיתאר הרשת.לחץ על חפש שלב אם לא ניתן לראות אותו ומרכז את הרשת על ידי לחיצה כפולה שמאלה באמצע העיגול. השתמש במקשים למעלה ולמטה כדי למקד את המדגם עד שסרט התמיכה ברשת או כל תכונה רלוונטית אחרת נמצאת במוקד. השתמש בתשעה ובשלושת המקשים בלוח המספרי כדי לשנות את שלב Z.לאחר שהבמה ממורכזת, בטל את מצב הווידאו. אסוף פסיפס אור גלוי על ידי לחיצה על Run Mosaic בתצוגת הפסיפס כדי לייצר אריחים של תמונות אור נראות לעין המסתובבות כלפי חוץ מהמרכז. שמור את התצוגה על-ידי לחיצה על שמור פסיפס.בדוק את פסיפס שדה בהיר לצד כל תמונות מפת פלואורסצנטיות קודמות על ידי כיבוי אור הסביבה ואת המרוכז, כמו גם את מצב הווידאו, ולאחר מכן הפעל את לייזר העירור הנדרש ובחר את המצלמה והמסנן המתאימים, בתחילה ב 50 מילי וואט לזמן חשיפה של 50 אלפיות השנייה. הקש אפס כדי להצמיד תמונה וכוכב כדי ליצור ניגודיות אוטומטית. לחלופין, כווננו ידנית את הניגודיות באמצעות המחוון בתחתית התמונה.לאחר שנמצאו תאים מעניינים ביולוגית עם פלואורסצנטיות מתאימה, סמנו את מיקומם באמצעות לחצן אתר הסימן בתצוגת Mosaic. המשך לסמן את כל האתרים הפוטנציאליים לפני שתתחיל ברכישת תמונה. שמור מחדש את הפסיפס עם האתרים המסומנים על-ידי לחיצה על שמור אתרים בקובץ.כדי לתפור את תמונת הפסיפס באמצעות תוכנת stitchEm, גרור ושחרר את קובץ פסיפס הטקסט לתוך קובץ stitchEm עם הסיומת BAT ולשמור את תמונת TIF המשולבת של אריחי הפסיפס באותה תיקיה. לשמירת תמונה עם האתרים המסומנים, גרור ושחרר את קובץ טקסט הפסיפס ואת קובץ הטקסט של הסמנים לתוך הסמל בו-זמנית. הגדר את זמן החשיפה ללייזר בהתבסס על הספירות ועל הטווח הדינמי בתמונת הפלואורסצנטיות בתחתית חלון תצוגת המצלמה.בחר באיזה מסנן להחיל ולמטב את ההגדרות עבור כל אורך גל של נורית עירור לשימוש, הפעלת כל לייזר בנפרד. לחץ על שתי המצלמות כדי להפעיל אותן. חזור לאחד האתרים המסומנים והתמקד שוב בעומק הרצוי.לאחר התמקדות באזור עניין, צא מהמוקד באמצעות מקש החץ למעלה בחלון XY בשלב המאקרו כדי לבחור את הגובה של מחסנית Z לרכישה ולחיצה על שמור למעלה. צא מהמוקד באמצעות מקש החץ למטה, לחץ על שמור למטה ולאחר מכן עבור למרכז, ודא שהתמונה עדיין במוקד. בחלון תא הטייס בחר ניסוי באתר יחיד.מהרשימה הנפתחת בחר תאורה מובנית. שנה את גובה הערימה כך שיהיה שווה לגובה Z בתוספת מיקרומטר אחד. הזן את זמני החשיפה באלפיות שניה עבור לייזרי 405 ו- 488 ננומטר בשורה העליונה עבור המצלמה המוחזרת ואת זמני החשיפה ללייזרים 561 ו - 647 ננומטר בשורה התחתונה עבור המצלמה המשודרת.הזן שם קובץ ולחץ על עדכון כדי להפיק קובץ חדש המכיל את התאריך והשעה מבלי לעקוף את הקבצים הקודמים, ולאחר מכן לחץ על התחל. אם החנקן הנוזלי Dewar ממלא מחדש את שלב ההקפאה במהלך רכישת התמונה, בטל את התהליך על ידי לחיצה על לחצן ABORT בתוכנת תא הטייס. בכל תנוחה, לאסוף Z-מחסנית באמצעות אור גלוי על ידי כיבוי הלייזרים והפעלת אור הסביבה ואת המעיבות.תחת ניסוי של אתר יחיד, בחר Z-stack והגדר את אור הסביבה לחשיפה של 20 אלפיות השנייה, תוך שמירה על גובה Z. חזור על תהליך זה עבור כל האתרים המסומנים. לאחר סיום ההדמיה, בטל את עגינה של הבמה והסר את כל הדגימות.כבה את האור של תא הדגימה. נתק את Dewar החיצוני decant כל חנקן נוזלי שנותר לתוך מיכל אחר קריו תואם, המאפשר Dewar לחזור בבטחה לטמפרטורה נורמלית. המתינו עד שהאפשרות לאפות את תצוגת קריו-בימת הופכת לזמינה לאחר שלא נשאר עוד חנקן נוזלי בשלב Dewar.לחץ על כפתור האפייה כדי להיכנס למצב החימום. שים את תקע המכסה על במת ההקפאה. הרזולוציה ב- cryoSIM גבוהה משמעותית מזו במיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית סטנדרטית.מפת הפלואורסצנטיות ממיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי קונבנציונלי יכולה לשמש לאיתור תחומי עניין להדמיה וניתן להשיג את תמונת cryoSIM המתאימה ממיקום ברשת. מדגם המכיל תאי U2OS היה מוכתם בתערובת של צבע ציטוסקופי מיקרוטובול ירוק וצבע מיטוכונדריה אדום וכתוצאה מכך הכתים את רכיב המיקרוטובול של הציטוסקלטון והמיטוכונדריה. הדמיה מאוחרת יותר הראתה לוקליזציה של המיטוכונדריה בתוך התא, כמו גם את הסידור של microtubules, הדגשת המסגרת המבנית שהם מספקים לתא ואת ההרכבה של cytoskeleton סביב אברונים.תהליך שחזור ה- SIM יכול לייצר חפצים שניתן לזהות באמצעות SIMCheck, תוסף imageJ בחינם. מפת ניגודיות אפנון זו שנוצרה באמצעות SIMCheck מציגה אזורים של ניגודיות אפנון נמוכה בתוך אזור הגרעין, מה שמצביע על כך שאזור זה הולך להיות רגיש יותר לשחזור חפצים. החץ הלבן מציין חפץ שחזור.בעת ניסיון פרוטוקול זה להבטיח כי המדגם נשאר שקוע או קרוב חנקן נוזלי בכל עת, כדי למנוע דה-vitrification. כמו כן לשים לב זמני חשיפה וספירה בטווח הדינמי, שכן זה משפיע על איכות הנתונים ומונע נזק לייזר לדגימה. לאחר הדמיית קריו, ניתן לדמיין את אותן דגימות עם שיטות אחרות כגון טומוגרפיה של קרני רנטגן רכות, שיש לנו כאן ב- B24 Beamline.על ידי שילוב תמונות cryoSIM עם תמונות המכילות מידע מבני על התא, אנו יכולים לענות על שאלות מרכזיות נוספות על מבנה אולטרה-מבנה ותפקוד תאיים.

Research

JoVE Journal

Biology

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

דם אוסף של סרטן הפרסה האמריקאי, Limulus פוליפמוס

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

הכנת למבוגרים תסיסנית עיניים עבור חתך דק ניתוח מיקרוסקופי

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

אוסף העופות זרע על ידי עיסוי Cloacal ובידוד של ה-DNA של הזרע

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

איסוף וזיהוי אבקה ממושבות דבורי דבש

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

איסוף רקמות ומיצוי RNA ממפרק הברך האוסטאוארטכרטית האנושי

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

הדמיה תחומים משכפלים בכרומטין אולטרה מובנה על ידי טומוגרפיה אלקטרונית

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

טומוגרפיה של קריו-אלקטרונים איסוף נתונים מרחוק וממוצע תת-טומוגרמה

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...