Name: cryo-structured illumination microscopic data collection from cryogenically preserved cells
Uploaded: 2021-05-28T15:00:00
Duration: 11 min 55 s
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このプロジェクトは、欧州委員会ホライズン2020 iNEXT-ディスカバリープロジェクトから資金を受け取りました。私.Mドビーはウェルカムトラスト(107457/Z/15/Z)からの資金援助を認めています。この作業は、ダイヤモンド光源、計器B24(提案BI25512)の支援を受けて行われました。Micronのスタッフと、クライオSIMとその相関性を確立するのを助けてくれたすべての優れたユーザーと協力者に感謝します。

<ol>
	<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Ball, G., Demmerle, J., Kaufmann, R., Davis, I., Dobbie, I. M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+A+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: A toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).</li><li>Kounatidis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Correlative+cryo-structured+illumination+fluorescence+and+soft+X-ray+microscopy+elucidates+reovirus+intracellular+release+pathway.">3D Correlative cryo-structured illumination fluorescence and soft X-ray microscopy elucidates reovirus intracellular release pathway.</a> Cell. 182 (2), 515-530 (2020).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Rego, E. H., Shao, L., Rego, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+structured+illumination+microscopy.">Practical structured illumination microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1251 (2015).</li><li>Phillips, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoSIM:+super-resolution+3D+structured+illumination+cryogenic+fluorescence+microscopy+for+correlated+ultrastructural+imaging.">CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging.</a> Optica. 7 (7), 802 (2020).</li><li>Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+fiducial-marker-free+correction+for+three-dimensional+chromatic+shift+in+biological+fluorescence+microscopy.">Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 8, 7583 (2018).</li><li>Kaufmann, R., Hagen, C., Gr&#252;newald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+cryo-microscopy:+current+challenges+and+prospects.">Fluorescence cryo-microscopy: current challenges and prospects.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20, 86-91 (2014).</li><li>Phillips, M. A., Pinto, D. M. S., Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPEKcheck-fluorescence+microscopy+spectral+visualisation+and+optimisation:+a+web+application,+javascript+library,+and+data+resource.">SPEKcheck-fluorescence microscopy spectral visualisation and optimisation: a web application, javascript library, and data resource.</a> Wellcome Open Research. 3, 92 (2018).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li></ol>

著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。

極低温での3D SIMは、ガラス化された生物学的材料をイメージングするための他のSRイメージング技術よりも多くの利点を有する。他のSR法と比較してzスライスあたりの画像が大幅に少なく、その結果、ガラス化サンプルの照射が少なく、氷晶形成の可能性が低くなります。また、全細胞を画像化することができ、X線断層撮影と相関して、構造と機能を一致させることができます。興味深いことに、市販の蛍光体と蛍光タグの大部分は、室温よりも極低温条件下で漂白が少ない。しかし、室温で最も一般的な蛍光体の量子収率が高い(場合によっては80%以上)を考えると、光子で検出される絶対利得は量子収量の変化によるものではなく、複雑な漂白プロセスの減少によるものです。極低温におけるフルオロフォアの収量の詳細については 、8.
cryoSIMに到着したサンプルは、より多くのイメージングのための潜在的なAOIのハイライトを含むグリッド「マップ」を生成するために、明視野能力を備えた従来の凍結発光顕微鏡を使用して事前にマッピングされたことが重要です(図5)。cryoSIMでのアクセス時間は、提案の提出を伴う競争プロセスを介して割り当てられ、その後、技術の実現可能性と生物医学的影響について評価される。したがって、機器の時間は常に「プレミアム」であり、事前にマッピングされたグリッドは、割り当ての最も効率的な使用を可能にします。また、特にサンプルホルダーからイメージングプラットフォームへのサンプル転送中に、氷の結晶の形成とその後のサンプル損傷を最小限に抑えるために、サンプルをガラス化しておくことも不可欠です。サンプルは、最高のSIM画像を生成するために良質でなければなりません。十分に準備されたサンプルは、次の特徴によって特徴付けられる:(a)氷結晶汚染がない、(b)使用されるグリッドはファインダーグリッド、(c)キャリアは平らになり、(d)グリッドメッシュと基板表面は自動蛍光を伴わないし、(e)支持膜に断裂はない。これらの前提条件は、慎重なサンプル処理とサンプルが常にガラス化を維持することによって達成できます。
提案されたサンプル蛍光体がcryoSIM顕微鏡で十分な信号を与えるかどうかを事前に確認することが重要です。SPEKCheck9 などのツールは、最適な蛍光素とフィルタの組み合わせを選択するのに役立ちます。生データ収集や再構築プロセスに問題がある場合、再構築後に画像にアーティファクトが表示される可能性があります。さまざまなアーティファクトの例は、Demmerleららによって文書化されており、 再構成の要約ファイルを開くことによって再構成が最適でない場合、画像再構成パラメータをSoftWoRxログファイルで確認することができる。特定のチャネルの角度をまたいで行間隔が一貫しており、振幅は比較的一貫している必要があります。30%を超える変動と1を大幅に上回る値(ビーズサイズ補正が適用される場合)は、より綿密に調査する必要があり、再構築の失敗を示す可能性があります。さらに、フィジーのSIMcheck2 ソフトウェアは、生データや再構成されたデータに対してさまざまなチェックを実行して、イメージングまたは再構成パラメータ設定のエラーの原因を診断するためにも使用できます。SIMチェックとその変調コントラストマップは、画像のどの領域が実際の構造である可能性が高いのか、アーティファクトに対して、再構築されたデータの品質の評価にも役立ちます。
核領域内の低変調コントラスト(濃い色で示す 、図5E)は、この領域が再建アーティファクトの影響を受けやすいことを意味し、したがって核に示されたハッシュパターンをアーティファクトとして分類できることを意味する。強い蛍光シグナル領域は、処理されたデータにネイティブ構造を正確に反映する可能性が高い。小胞の全面など、蛍光体がより広い領域に分布する弱い信号の領域では、実際の信号がアーティファクトの処理と共存し、そのデータの解釈に注意を払う必要がある可能性があります。全範囲の再構築されたデータを検査して、奇妙なアーティファクトがないことを確認し、背景が一般的にガウスでゼロ付近に中央揃えであることを確認した後、データは一般的にゼロにクリップされるか、モーダル値-バックグラウンド信号のピークがゼロに非常に近いはずです。これにより、表示されるイメージのダイナミック レンジが、負のバックグラウンド アーティファクトによって支配されることがなくなります。弱いシグナルが予想される場合は、機能を分析し、それらが再構築アーティファクトではなく実際の構造であることを確認する際に特別な注意を払う必要があります。
イメージングシステムには、いくつかの制限があります。サンプルステージは平坦であるため、厚さが可変のサンプルや平坦でないグリッドは、イメージングに理想的な対象ではありません。また、相関画像が軟X線断層撮影を使用して行われる場合、チルトシリーズ取得中にX線顕微鏡では見えないため、グリッド境界付近の細胞は画像化すべきではありません。最後に、プランジ凍結前のサンプルのブロッティング量は、イメージング品質に大きな影響を与えます。あまりにも少ないブロットは、あまりにも少ないサンプルが厚く、高いバックグラウンドノイズを持つ最適でないSIM画像を与え、あまりにも多くのブロットは、細胞が誤った形状になり、したがって、入射レーザービームからの熱損傷の影響を受けやすくなります。要約すると、cryoSIMは、ほぼネイティブの段階で3Dで生物学的サンプルをイメージングするための強力な蛍光顕微鏡ツールであり、多くの分野で幅広い用途を有しています。

SRイメージング技術は、過去10年間で生物学者に広くアクセス可能になってきました。これらは、回折限界を超えて蛍光タグ付きサンプルの高解像度イメージングを可能にします。しかし、極低温でのサンプルを扱うSR顕微鏡法を適応させることは困難であった2.これは、電子またはX線断層撮影と組み合わせた相関イメージングに有利であろう。近年、SIMは極低温サンプルの使用に適応され、ダイヤモンド光源シンクロトロン(https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html)のコリンコのクライオイメージングビームラインB24で、軟X線断層撮影(SXT)3と組み合わせて生体細胞の相関研究を可能にすることに成功しています。SIMは、3つの角度と5つの段階で光の縞模様(Moiréフリンジ)でサンプルを照らすことによって、従来の広視野顕微鏡の分解能を倍増させることができます。これらの光パターンとサンプル蛍光との間の干渉は、サブ回折構造4,5に関する追加情報を計算上発見するために使用することができる。
極低温アプリケーションの他のSR技術よりもSIMのいくつかの利点があります。まず、特別に設計された点滅蛍光ホルで動作します。従来の蛍光性蛍光性は、使用することができ、潜在的な蛍光タグ付け剤6の広い範囲へのアクセスを与える。さらに、zスライスあたり15枚の画像(3D、2Dの場合は9つの画像)しか必要としませんが、他のSR法ではスライスあたり約1000枚の画像を撮影し、サンプルが加熱される可能性が高まり、氷結晶形成のリスクが高まり、アーティファクトを引き起こす可能性があります。最後に、この技術は、10 μmを超えるより厚い生物学的サンプルを画像化することができ、細胞全体をほぼネイティブ状態で画像化することができます6.cryoSIMは、標準的な光学部品を使用して、イメージング用のオープンアクセスソフトウェアを使用して構築されており、必要に応じて文書化し、複製することが容易になります 6.cryoSIMは100x/0.9の開口の目的を有 する(材料表を参照)。光学部品、設計パラメータ、性能に関する詳細は、フィリップスら 6によって説明されている、このプロトコルは、極低温段階でサンプルをロードおよびアンロードする方法、顕微鏡上のデータを収集する方法、およびSIM画像を再構築する方法を含むクライオSIM顕微鏡を使用する方法を示しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Auto grids</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCT142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cockpit Software</td>
			<td>Oxford University</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/MicronOxford/cockpit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo compatible polyurethane container</td>
			<td>Jena bioscience</td>
			<td>CC-FD-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo TEM grid storage box</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Model#AutoGrid</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-SIM microscope</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made, see following reference for the design:&#160; Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, &#34;CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging,&#34; Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostage system</td>
			<td>Linkam Scientific Instruments</td>
			<td>CMS196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip surgical forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red FM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python Microscope Software</td>
			<td>Oxford University</td>
			<td></td>
			<td>https://www.python-microscope.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific dry paper wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark 7551</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIM Reconstruction Software</td>
			<td>softWoRx, GE Healthcare</td>
			<td>Version&#160; 6.5.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StitchM Software</td>
			<td>Diamond Light Source</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/DiamondLightSource/StitchM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids for samples</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools</td>
			<td>G200F1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-structured illumination microscopic data collection from cryogenically preserved cells

3次元(3D)構造化照明顕微鏡(SIM)により、従来の蛍光顕微鏡よりも高い分解能で蛍光標識された細胞構造のイメージングが可能です。この超分解能(SR)技術は、細胞全体の分子プロセスの可視化を可能にし、電子顕微鏡法およびX線断層撮影と組み合わせて使用して構造情報と機能情報を関連付ける可能性を秘めています。最近、英国シンクロトロンのコリンコ・クライオイメージングビームラインB24で、極低温保存サンプル(cryoSIM)用SIM顕微鏡が委託されました。 
これは、クライオソフトX線断層撮影などのX線顕微鏡法による同じサンプルのその後のイメージングと互換性のある方法で、極低温での生物学的サンプルの3Dイメージング用に特別に設計されました。このビデオ記事では、cryoSIM を使用したイメージングを成功させるための詳細な方法とプロトコルについて説明します。cryoSIM顕微鏡の操作に関する指示に加えて、サンプル、蛍光ホル、およびパラメータ設定の選択に関する推奨事項が含まれています。このプロトコルは、ミトコンドリアとチューブリンが蛍光標識されているU2OS細胞サンプルで実証されています。

U2OS細胞を含む試料を、緑色の微小管細胞骨格色素と赤ミトコンドリア色素の混合物で染色し、細胞骨格の微小管成分(緑色)とミトコンドリア(赤色)を染色した。その後のイメージングは、細胞内のミトコンドリアの局在化と微小管の配置を示し、核などの小器官の周りの細胞および細胞骨格のアセンブリに提供する構造的枠組みを強調した。クライオSIMの解像度は、標準的な蛍光顕微鏡の解像度よりも有意に高い(図5)。図6は、従来の蛍光顕微鏡からの蛍光「マップ」を使用して、グリッド上の場所からイメージングの対象領域と対応するcryoSIM再構成画像を見つけることができる方法を示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig01.jpg"> 図1: cryoSIMイメージングプロトコルの段階を示すフローチャート。 略語: クライオSIM = クライオ構造の照明顕微鏡。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig02.jpg"> 図2: クライオステージ( A) クライオステージのセットアップ(B) 逆鉗子によって保持されているサンプルグリッド。(C)クライオステージの構成要素接続ポートはオレンジ色に対応する色でラベル付けされています:電源、黄色:加熱ステージ蓋、青:外部デュワー、緑:PCへの接続。略語: パソコン = パソコン;LN2 = 液体窒素。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig03.jpg"> 図3: コックピットソフトウェアパネルのビュー( A)メインパネル、 (B) マクロステージ XY, (C) モザイクビュー, (D) カメラビュー略語: SLM = 空間光変調器。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig04.jpg"> 図4: コックピットソフトウェアパネルのビュー( A)Zスタック単一サイト実験(B) SI 単一サイト実験。(C) 画像取得中に使用されるコックピットソフトウェアのキーボードショートカット。(D)クライオSIM顕微鏡は、ダイヤモンド光源シンクロトロンのビームラインB24で現場に設置されています。略語: クライオSIM = クライオ構造の照明顕微鏡。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig05.jpg"> 図5: cryoSIMの分解能(A)検査中のグリッドのモザイク図(B) 関心領域のブライトフィールド画像 (AOI)。(C) 解像度の増加を示す(D)SIM画像と比較した擬似ワイドフィールド画像。白い矢印はSIMの再建アーティファクトを示しています。(E)再構成画像の画素強度情報とSIMCheck2で生成された生データのそれぞれの変調対雑音比(MCNR)値の色情報を組み合わせた変調コントラストマップ。明るい領域と暗い領域はそれぞれコントラストが高く、低い。スケールバー= 10 μmCryoSIMイメージング設定:励起/発光波長:488/525nm、50mWレーザーパワー、50ms露光時間、647/655nm、20mWレーザーパワー、5ms露光時間。略語: クライオSIM =クライオ構造の照明顕微鏡。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig06.jpg"> 図6:従来の蛍光マップから蛍光マップのグリッド上の位置からのクライオシムにおける画像再構成。(A,B)従来の蛍光顕微鏡で生成された明視野および蛍光画像マップのオーバーレイ。このマップは、関心のある領域を、その後の cryoSIM 内の画像に位置付けるために使用されます。(C)で示した場所で得られる再構築されたクライオSIM画像(B)略語: クライオSIM =クライオ構造の照明顕微鏡。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

このプロトコルは、クライオ構造の照明顕微鏡を用いて、生物学的に凍結保存されたサンプルを画像化する方法を示す。U2OS細胞の細胞骨格をイメージングして方法論を実証する。

極低温保存細胞からの微視的データ収集

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

この方法により、生物学的細胞全体で超分解能のクライオイメージングが可能になり、細胞構造を正確に同定することができます。また、相関イメージングワークフローの一部として、他のモダリティと組み合わせて使用することもできます。この技術の主な利点は、超分解能イメージングは、従来のフルオロフォアおよび比較的低い光用量を使用して極低温条件で迅速に行うことができるということです。CyroSIMは、内部または外部の手がかりに応答して細胞の超構造ダイナミクスを理解するための洞察を提供する強力なツールです。そのアプリケーションには、ワクチンの生産とロールアウト、品質管理、市場後の監視、抗体工学と最適化、ならびにナノ粒子の特性評価が含まれます。クライオステージ内の操縦サンプルは、グリッドの安全性を確保するために練習を行います。また、データ収集の前に「コックピット」ウィンドウのコントロールに慣れるのも最適です。まず、クライオステージの外的なデュワーから蓋を取り出し、約4分の1がいっぱいになるまで濾過した液体窒素を注ぎます。最初の沸騰が沈静化するまで待ってから、より多くを注ぎ、容器を約3分の2に満たします。液体窒素が沸騰する場合は、ノズルをハンドラから離して慎重に交換します。液体窒素が出口から出て停止したら、出口パイプをステージデュワーの上にクライオステージに置きます。電源を接続し、USBケーブルを接続し、外部デュワーをステージに接続します。液体窒素の送達後、クライオステージのリリースボタンを押してサンプルチャンバーに入り、システムが冷却して安定するまで30~45分待ってから画像取得を開始します。カセットツールの16進数キーを使用して、サンプル転写カセットの2枚のプレートを開きます。プレートを 2 つのプレートの間にグリッドをドロップするのに十分な幅を開きますが、最大位置には開かないでください。長い鉗子を使用して、サンプルグリッドボックスを液体窒素から持ち上げます。ノッチがステージ内の保管位置に合うように回し、ステージに配置します。適切なデバイスを使用して、適切なサンプル位置まで保管ボックスの蓋を開きます。逆鉗子を使用して、サンプルホルダーからTEMグリッドを取り出し、液体窒素の中に浸し、最終的にサンプルブリッジの目的に向き合い、サンプル移送カセットの位置に落とすようにカーボンフィルム側が配置されるようにします。カセットツールの 16 進キーを使用してサンプルカートリッジを閉じます。カセットツールのマグネットポイントを使用して、グリッドを含むカートリッジを持ち上げてサンプルブリッジに取り付けます。液体窒素に浸すか、または適切な向きに浸してください。カセットをブリッジの位置ピンの内側に平らにして、静かに動かして固定されていることを確認します。残りのサンプルと一緒に保管ボックスを閉じて取り外します。クライオステージの蓋開口部をイメージング位置に移動し、サンプルチャンバーライトをオフにします。光学系に向かってステージをスライドさせて対物レンズの下に合わせ、レバーを使用して目的をそっと位置に落とし、クライオステージの蓋内に収まるが触れないようにします。不透明な黒いカーテンでステージと光学を覆い、クライオSIM PC上でコントロールソフトウェアコックピットを起動します。各カメラの読み出しモードボタンをクリックし、CONV3メガヘルツに設定します。各カメラの温度が80°Cであり、カメラファンがオフになっているか確認します。反射したカメラをオンにし、光の下でアンビエントとアンダーリンカムを選択し、コンデンサーをチェックしてからビデオモードボタンをクリックします。[モザイク ビュー] ウィンドウで、グリッドのアウトラインを表示するために縮小表示します。見ることができない場合は[ステージを見る]をクリックし、円の中央をダブルクリックしてグリッドを中央に配置します。グリッドサポートフィルムまたはその他の関連する機能がフォーカスされるまで、上下キーを使用してサンプルをフォーカスします。Z ステップを変更するには、数値パッドの 9 キーと 3 つのキーを使用します。ステージが中央揃えになったら、ビデオモードをオフにします。モザイクビューの「実行モザイク」をクリックして可視光モザイクを収集し、中心から外側に向かって渦巻く可視光画像のタイルを生成します。[モザイクを保存]をクリックしてビューを保存します。周囲光とコンデンサー、ビデオモードをオフにして、以前の蛍光マップ画像と一緒に明るいフィールドモザイクを検査し、必要な励起レーザーをオンにして、対応するカメラとフィルタを選択します。イメージをスナップし、自動コントラストに星を合わせるには、ゼロを押します。または、画像の下部にあるスライダーを使用して、コントラストを手動で調整します。適切な蛍光を有する生物学的に興味深い細胞が見つかったら、モザイクビューのマークサイトボタンを使用して、その位置をマークします。画像取得を開始する前に、すべての候補サイトのマーキングを続行します。[サイトをファイルに保存] をクリックして、マークされたサイトでモザイクを再保存します。stitchEm ソフトウェアを使用してモザイク画像をステッチするには、テキストモザイクファイルを、BAT という拡張子を持つ stitchEm ファイルにドラッグアンドドロップし、モザイクタイルの組み合わせ TIF 画像を同じフォルダーに保存します。マークされたサイトと一緒に画像を保存するには、モザイクテキストファイルとマーカーテキストファイルを同時にアイコンにドラッグアンドドロップします。カメラビューウィンドウの下部にある蛍光画像の数とダイナミックレンジに基づいて、レーザー露光時間を設定します。使用する励起光の各波長の設定を適用し、最適化するフィルターを選択し、各レーザーを個別にオンにします。両方のカメラをクリックしてオンにします。マークされたサイトのいずれかに戻り、再び目的の深さに焦点を当てます。対象領域にフォーカスが置いたら、マクロステージの XY ウィンドウの上矢印キーを使用してフォーカスを外し、取得する Z スタックの高さを選択し、[上に保存] をクリックします。下矢印キーを使用してフォーカスから移動し、[保存] をクリックし、[中央に移動] で、イメージがフォーカスされていることを確認します。[コックピット] ウィンドウで、[単一サイト実験] を選択します。ドロップダウン リストから[構造化照明]を選択します。Z 高さと 1 マイクロメートルに等しくなるように、スタックの高さを変更します。反射カメラの上列の405および488ナノメートルレーザーの露光時間をミリ秒単位で入力し、送信カメラの下段に561および647ナノメートルのレーザーの露光時間を入力します。ファイル名を入力し、更新をクリックして、以前のファイルを上書きせずに日時を含む新しいファイルを生成し、[Start]をクリックします。液体窒素デュワーが画像取得中にクライオステージを補充する場合は、コックピットソフトウェアのABORTボタンをクリックしてプロセスを中止します。各位置で、可視光を使用してZスタックを収集し、レーザーのスイッチを切り、周囲光とコンデンサーをオンにします。[単一サイト実験] で[Z スタック]を選択し、周囲光を 20 ミリ秒の露出に設定し、Z 高さを維持します。マークされたすべてのサイトに対してこの手順を繰り返します。イメージングが終了したら、ステージをアンドッキングし、すべてのサンプルを削除します。サンプルチャンバーライトをオフにします。外部のデュワーを抜き、残りの液体窒素を別のcryo互換容器にデカン化し、デュワーが安全に正常な温度に戻ることができるようにします。ステージデュワーに液体窒素が残っていない後、クライオステージディスプレイを焼くオプションが利用可能になるまで待ちます。ベイクアウトボタンを押して、加熱モードに入ります。蓋プラグをクライオステージに置きます。cryoSIMの分解能は、標準的な蛍光顕微鏡の解像度よりも有意に高い。従来の蛍光顕微鏡から蛍光マップを使用して、画像撮影の対象領域を見つけることができ、対応するcryoSIM画像は、グリッド上の位置から得ることができます。U2OS細胞を含む試料を、緑色の微小管細胞骨格色素と赤ミトコンドリア色素の混合物で染色し、細胞骨格とミトコンドリアの微小管成分を染色した。その後のイメージングは、細胞内のミトコンドリアの局在化と微小管の配置を示し、細胞およびオルガネラ周囲の細胞骨格の組み立てに提供する構造的枠組みを強調した。SIM再構築プロセスは、SIMCheck、無料のimageJプラグインを使用して識別することができるアーティファクトを生成することができます。この変調コントラストマップは、SIMCheckを用いて生成された、核領域内の低変調コントラストの領域を示し、この領域が再構築アーティファクトの影響を受けやすいことを示している。白い矢印は、再構築アーティファクトを示します。このプロトコルを試みるとき、サンプルが水没するか、または液体窒素に常に近いままであることを確認して、脱ガラス化を避けてください。また、データの品質に影響を与え、サンプルへのレーザー損傷を回避するため、ダイナミックレンジでの露出時間とカウントにも注意してください。クライオイメージングの後、同じサンプルを、B24ビームラインで行っているクライオソフトX線断層撮影などの他のモダリティと共に画像化することができます。細胞の構造情報を含む画像とcryoSIM画像を組み合わせることで、細胞の超構造と機能に関する重要な追加の質問に答えることができます。

Research

JoVE Journal

Biology

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

アメリカカブトガニ、カブトガニポリフェムスから採血

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

大人の準備ショウジョウバエ</emシンセクショニングおよび顕微鏡分析のための>アイズ

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

排せつマッサージと精子から DNA の隔離による鳥の精液採取

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

超構造保存細胞における膜蛋白質局在化の電子顕微鏡分析のためのクライオAPEX法

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

ミツバチのコロニーからの花粉の収集と同定

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

ヒト変形性膝関節からの組織採取とRNA抽出

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

電子断層撮影による超構造保存クロマチン中の複製ドメインのイメージング

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

クライオ電子線トモグラフィー遠隔データ収集とサブトモグラム平均化

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...