Name: cryo-structured illumination microscopic data collection from cryogenically preserved cells
Uploaded: 2021-05-28T15:00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells at JoVE.com

Этот проект получил финансирование от проекта Европейской комиссии Horizon 2020 iNEXT-Discovery. И.M. Добби признает финансирование от Wellcome Trust (107457/Z/15/Z). Эта работа проводилась при поддержке Diamond Light Source, прибора B24 (предложение BI25512). Мы благодарим сотрудников Micron и всех наших превосходных пользователей и сотрудников за помощь в создании cryoSIM и его коррелятивного потенциала.

<ol>
	<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Ball, G., Demmerle, J., Kaufmann, R., Davis, I., Dobbie, I. M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+A+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: A toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).</li><li>Kounatidis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Correlative+cryo-structured+illumination+fluorescence+and+soft+X-ray+microscopy+elucidates+reovirus+intracellular+release+pathway.">3D Correlative cryo-structured illumination fluorescence and soft X-ray microscopy elucidates reovirus intracellular release pathway.</a> Cell. 182 (2), 515-530 (2020).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Rego, E. H., Shao, L., Rego, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+structured+illumination+microscopy.">Practical structured illumination microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1251 (2015).</li><li>Phillips, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoSIM:+super-resolution+3D+structured+illumination+cryogenic+fluorescence+microscopy+for+correlated+ultrastructural+imaging.">CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging.</a> Optica. 7 (7), 802 (2020).</li><li>Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+fiducial-marker-free+correction+for+three-dimensional+chromatic+shift+in+biological+fluorescence+microscopy.">Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 8, 7583 (2018).</li><li>Kaufmann, R., Hagen, C., Gr&#252;newald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+cryo-microscopy:+current+challenges+and+prospects.">Fluorescence cryo-microscopy: current challenges and prospects.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20, 86-91 (2014).</li><li>Phillips, M. A., Pinto, D. M. S., Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPEKcheck-fluorescence+microscopy+spectral+visualisation+and+optimisation:+a+web+application,+javascript+library,+and+data+resource.">SPEKcheck-fluorescence microscopy spectral visualisation and optimisation: a web application, javascript library, and data resource.</a> Wellcome Open Research. 3, 92 (2018).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li></ol>

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

3D SIM при криогенных температурах имеет много преимуществ перед другими методами визуализации SR для визуализации остеклованного биологического материала. Это требует значительно меньше изображений на z-срез по сравнению с другими методами SR, что приводит к меньшему облучению и более низкой вероятности образования кристаллов льда для остеклованных образцов. Он также способен визуать целые клетки и может быть коррелирован с рентгеновской томографией, чтобы сопоставить структуру с функцией. Интересно, что большинство коммерчески доступных флуорофоров и флуоресцентных меток отбеливают меньше при криогенных условиях, чем при комнатной температуре. Однако, учитывая высокий квантовый выход наиболее распространенных флуорофоров при комнатной температуре (более 80% в некоторых случаях), абсолютный прирост, обнаруженный в фотонах, обусловлен не изменениями квантового выхода, а снижением сложных процессов отбеливания. Более подробную информацию об урожайности флуорофоров при криогенных температурах можно найти в 8.
Крайне важно, чтобы образцы, поступающие на криоСИМ, были предварительно отображены с использованием обычного криофлуоресцентного микроскопа с возможностью яркого поля для создания «карты» сетки, которая включает в себя выделение всех потенциальных АОИ для дальнейшей визуализации(рисунок 5). Время доступа к cryoSIM распределяется через конкурсный процесс, который включает в себя подачу предложения, которое впоследствии оценивается на осуществимость техники и биомедицинский эффект. Таким образом, время на оборудование всегда «на высоте», а предварительно нанесенные на карту сетки позволяют наиболее эффективно использовать распределение. Также важно, чтобы образец поддерживался остеклованным, особенно во время передачи образца от держателя образца к платформе визуализации, чтобы свести к минимуму образование кристаллов льда и последующее повреждение образца. Образец должен быть хорошего качества, чтобы получить лучшие изображения SIM-карты. Хорошо подготовленный образец будет характеризоваться следующими признаками: а) он не будет загрязнен кристаллами льда, b) используемая сетка будет представлять собой сетку искателя, в) носитель будет плоским, г) сетка сетки и поверхность подложки не будут автофлуоресцентными и е) не будет разрывов в опорной мембране. Эти предпосылки могут быть достигнуты путем тщательного обращения с образцами и обеспечения того, чтобы образцы всегда оставались остеклованными.
Важно заранее проверить, будет ли предлагаемый образец флуорофоров давать достаточный сигнал в микроскопе cryoSIM. Такие инструменты, как SPEKCheck9, могут помочь в выборе оптимальных комбинаций флуорофоров и фильтров. Если есть проблемы со сбором необработанных данных или процессом реконструкции, артефакты могут появиться на изображениях после реконструкции. Примеры различных артефактов были задокументированы Demmerle et al.10 Параметры реконструкции изображения можно просмотреть в файле журнала SoftWoRx, если реконструкция не является оптимальной, открыв файл сводки реконструкции. В данном канале должно быть последовательное расстояние между линиями между углами и относительно постоянная амплитуда. Вариация более 30% и значения значительно выше 1 (если применяется компенсация размера бусины) должны быть более тщательно изучены и, вероятно, будут указывать на неудачные реконструкции. Кроме того, программное обеспечение SIMcheck2 на Фиджи также может использоваться для выполнения различных проверок необработанных и реконструированных данных для диагностики причин ошибок в настройках параметров визуализации или реконструкции. SIM-проверка и ее контрастная карта модуляции также могут помочь в оценке качества реконструированных данных, интерпретируя, какие области изображения могут быть реальными структурами по сравнению с артефактами.
Низкий контраст модуляции (показанный темным цветом на рисунке 5E)в ядерной области означает, что эта область будет более восприимчива к артефактам реконструкции, что подразумевает, что хэш-паттерны, показанные в ядре, могут быть классифицированы(рисунок 5D)как артефакт. Сильные области флуоресцентного сигнала с большей вероятностью точно отражают собственные структуры в обрабатываемых данных. В областях слабого сигнала, где флуорофоры распределены по более широким областям, таким как общая поверхность везикулы, вполне вероятно, что реальный сигнал сосуществует с артефактами обработки, и следует проявлять осторожность при интерпретации этих данных. После проверки полнодиагнальных реконструированных данных, чтобы убедиться, что нет странных артефактов, и что фон, как правило, гауссов и центрирован около нуля, данные обычно обрезаются при нуле, или модальное значение - пик фонового сигнала - должно быть очень близко к нулю. Это гарантирует, что в динамическом диапазоне отображаемого изображения не будут доминировать артефакты отрицательного фона. Когда ожидается более слабый сигнал, следует проявлять особую осторожность при анализе признаков и обеспечении того, чтобы они были реальными структурами, а не артефактами реконструкции.
Существуют некоторые ограничения системы визуализации. Поскольку стадия выборки плоская, образцы с переменной толщиной или сетками, которые не являются плоскими, не являются идеальными объектами для визуализации. Кроме того, если коррелятивная визуализация будет выполнена с использованием мягкой рентгеновской томографии, клетки вблизи границ сетки не должны быть изображены, поскольку они не будут видны в рентгеновском микроскопе во время получения серии наклона. Наконец, количество промокания образца перед погружением замерзания оказывает значительное влияние на качество изображения; слишком малое пятно приводит к слишком толстым образцам, дающим неоптимальные SIM-изображения с высоким фоновым шумом, в то время как слишком большое пятно может привести к деформированию клеток и, следовательно, более восприимчивы к тепловому повреждению от падающего лазерного луча. Таким образом, cryoSIM является мощным инструментом флуоресцентной микроскопии для визуализации биологических образцов в 3D на почти нативной стадии и имеет широкий спектр применения во многих областях.

Методы визуализации SR стали широко доступными для биологов за последнее десятилетие1. Они позволяют визуализы с высоким разрешением флуоресцентно помеченных образцов за пределами дифракционного предела. Тем не менее, было сложно адаптировать методы SR-микроскопии для работы с образцами при криогенных температурах2. Это было бы выгодно для коррелятивной визуализации в сочетании с электронной или рентгеновской томографией. Недавно SIM-карта была адаптирована для использования с криогенными образцами и успешно показала, что позволяет проводить корреляционные исследования биологических клеток в сочетании с мягкой рентгеновской томографией (SXT)3 на коррелятивной криовизующей лучевой линии B24 на синхротроне с алмазным источником света (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html). SIM-карта может удвоить разрешение обычной широкоугольной микроскопии, освещая образец полосатыми узорами света (муаровые бахромы) под тремя углами и в пять фаз. Интерференция между этими световыми паттернами и флуоресценцией образца может быть использована для вычислительного раскрытия дополнительной информации о субдифракционных структурах4,5.
Существует несколько преимуществ SIM-карты перед другими методами SR для криогенных приложений. Во-первых, он может работать без специально разработанных мигающих флуорофоров; можно использовать обычные флуорофоры, дающие доступ к более широкому спектру потенциальных флуоресцентных меток6. Кроме того, требуется только 15 изображений на z-срез (в 3D; 9 изображений для 2D), тогда как другие методы SR принимают около 1000 изображений на срез, увеличивая вероятность нагрева образца и, следовательно, увеличивая риск образования кристаллов льда, что может вызвать артефакты. Наконец, этот метод может визуалить более толстые биологические образцы более 10 мкм, что позволяет визуалить целые клетки в их почти родном состоянии6. CryoSIM был построен с использованием стандартных оптических компонентов и программного обеспечения открытого доступа для визуализации, что позволяет легко документировать и дублировать при желании6. КриоСИМ имеет объектив с числовой диафрагмой 100x/0.9 (см. Таблицу материалов); Дополнительная информация о его оптических компонентах, конструктивных параметрах и производительности была описана Phillips et al.6 Здесь этот протокол демонстрирует, как использовать микроскоп cryoSIM, включая как загружать и выгружать образцы на криогенной стадии, как собирать данные на микроскопе и как реконструировать изображения SIM-карты.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Auto grids</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCT142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cockpit Software</td>
			<td>Oxford University</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/MicronOxford/cockpit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo compatible polyurethane container</td>
			<td>Jena bioscience</td>
			<td>CC-FD-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo TEM grid storage box</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Model#AutoGrid</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-SIM microscope</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made, see following reference for the design:&#160; Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, &#34;CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging,&#34; Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostage system</td>
			<td>Linkam Scientific Instruments</td>
			<td>CMS196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip surgical forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red FM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python Microscope Software</td>
			<td>Oxford University</td>
			<td></td>
			<td>https://www.python-microscope.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific dry paper wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark 7551</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIM Reconstruction Software</td>
			<td>softWoRx, GE Healthcare</td>
			<td>Version&#160; 6.5.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StitchM Software</td>
			<td>Diamond Light Source</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/DiamondLightSource/StitchM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids for samples</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools</td>
			<td>G200F1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-structured illumination microscopic data collection from cryogenically preserved cells

Трехмерная (3D) структурированная микроскопия освещения (SIM) позволяет визуализировать флуоресцентно меченые клеточные структуры с более высоким разрешением, чем обычная флуоресцентная микроскопия. Этот метод сверхвысокого разрешения (SR) позволяет визуализировать молекулярные процессы в целых клетках и может использоваться в сочетании с электронной микроскопией и рентгеновской томографией для корреляции структурной и функциональной информации. Sim-микроскоп для криогенно сохраненных образцов (cryoSIM) недавно был введен в эксплуатацию на коррелятивной криовизующей лучевой линии B24 в синхротроне Великобритании. 
Он был разработан специально для 3D-визуализации биологических образцов при криогенных температурах способом, совместимым с последующей визуализацией тех же образцов методами рентгеновской микроскопии, такими как криомягмягкая рентгеновская томография. В этой видеостатье представлены подробные методы и протоколы для успешной визуализации с использованием cryoSIM. В дополнение к инструкциям по эксплуатации микроскопа cryoSIM были включены рекомендации относительно выбора образцов, флуорофоров и настроек параметров. Протокол продемонстрирован в образцах клеток U2OS, чьи митохондрии и тубулин были флуоресцентно помечены.

Образец, содержащий клетки U2OS, окрашивали смесью зеленого микротрубочного цитоскелетного красителя и красного красителя митохондрий, в результате чего окрашивался компонент микротрубочек цитоскелета (зеленый) и митохондрий (красный). Последующая визуализация показала локализацию митохондрий внутри клетки, а также расположение микротрубочек, подчеркнув структурный каркас, который они обеспечивают клетке, и сборку цитоскелета вокруг органелл, таких как ядро. Разрешение в cryoSIM значительно выше, чем в стандартной эпифлуоресцентной микроскопии(рисунок 5). На рисунке 6 показано, как флуоресцентная «карта» из обычного эпифлуоресцентного микроскопа может быть использована для определения местоположения областей, представляющих интерес для визуализации, и соответствующего криоСИМ-реконструированного изображения из места на сетке.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig01.jpg"> Рисунок 1:Блок-схема, показывающая этапы протокола визуализации cryoSIM. Аббревиатура: cryoSIM = Криоструктурированная микроскопия освещения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig02.jpg"> Рисунок 2:Криоступенчатая установка. (A) Установка крио-ступени. (B)Сетка образцов, показанная на перевернутых щипцах. (C)Компоненты криоступенчатой. Порты подключения маркированы цветами, соответствующими оранжевому: блок питания, желтый: нагретая крышка сцены, синий: внешний дьюар, зеленый: подключение к ПК. Сокращения: ПК = персональный компьютер; LN2 = жидкий азот. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig03.jpg"> Рисунок 3:Виды программных панелей кабины пилотов. (A) Основная панель, (B) макроступенчата XY, (C) мозаичный вид, (D) вид камеры. Аббревиатура: SLM = пространственный модулятор света. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig04.jpg"> Рисунок 4:Виды программных панелей Cockpit. (A) Z стек один сайт эксперимент. (B) Эксперимент с одним сайтом СИ. (C) Сочетания клавиш для программного обеспечения кабины, используемого во время получения изображения. (D)Микроскоп cryoSIM находится на месте на линии луча B24 на синхротроне Diamond Light Source. Аббревиатура: cryoSIM = Криоструктурированная микроскопия освещения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig05.jpg"> Рисунок 5:Разрешение криоСИМ. (А) Мозаичный вид рассматриваемой сетки. (B)Брайтфилд изображение области интересов (AOI). (C) Псевдоширокополевое изображение по сравнению с его(D)SIM-изображением, показывающим увеличение разрешения. Белая стрелка указывает на артефакты реконструкции SIM-карты. (E) Контрастная карта модуляции, объединяющая информацию об интенсивности пикселей реконструированного изображения с цветовой информацией соответствующих значений коэффициента контрастности модуляции к шуму (MCNR) необработанных данных, генерируемых SIMCheck2. Светлые и темные области показывают высокую и низкую контрастность соответственно. Шкала шкалы = 10 мкм. Настройки визуализации CryoSIM: длины волн возбуждения/излучения: 488/525 нм, мощность лазера 50 мВт, время экспозиции 50 мс и 647/655 нм, мощность лазера 20 мВт, время экспозиции 5 мс. Аббревиатура: cryoSIM = Криоструктурированная микроскопия освещения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig06.jpg"> Рисунок 6:Реконструкция изображения в криоСИМ из места на сетке в флуоресцентной карте из обычной карты эпифлуоресценции. (A,B) Наложение карт изображений яркого поля и флуоресценции, сгенерированных с помощью обычного эпифлуоресцентного микроскопа. Эта карта используется для определения местоположения областей, представляющих интерес для последующего изображения в cryoSIM. (C) Реконструированное изображение cryoSIM, полученное в месте, указанном в (B). Аббревиатура: cryoSIM = Криоструктурированная микроскопия освещения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells at JoVE.com

Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

Этот протокол демонстрирует, как получить изображения биологических криоконсервированных образцов с помощью криоструктурированной микроскопии освещения. Мы демонстрируем методологию путем визуализации цитоскелета клеток U2OS.

Криоструктурированное освещение Микроскопический сбор данных из криогенно сохраненных клеток

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

Этот метод делает криовизуализацию сверхвысокого разрешения возможной на целых биологических клетках для точной идентификации клеточных структур. Он также может использоваться в сочетании с другими модальностями как часть коррелятивного рабочего процесса визуализации. Основными преимуществами этого метода является то, что визуализация сверхвысокого разрешения может быть быстро выполнена в криогенных условиях с использованием обычных флуорофоров и относительно низких доз света.CyroSIM является мощным инструментом, который дает представление о понимании динамики клеточной ультраструктуры в ответ на внутренние или внешние сигналы. Его применение включает в себя производство и развертывание вакцин, контроль качества, послепродажный надзор, разработку и оптимизацию антител, а также характеристику наночастиц. Маневрирование образцов в пределах криоступенчатой требует практики для обеспечения безопасности сети.Также лучше всего ознакомиться с элементами управления в окне Cockpit перед сбором данных. Для начала снимите крышку с внешнего Дьюара криоступенчаты и залейте отфильтрованным жидким азотом до тех пор, пока он не заполнится примерно на четверть. Подождите, пока первоначальное кипение не спадет, прежде чем заливать больше и наполните сосуд примерно на две трети.Осторожно замените крышку, отведя сопло в сторону от обработчика, когда жидкий азот выкипает. Как только жидкий азот перестанет выходить из выхода, поместите выходную трубу над ступенью Дьюара на криоступенчатую. Подключите источник питания, подключите USB-кабель и подключите внешний Dewar к рабочей области.После подачи жидкого азота нажмите кнопку разблокировки на криоступенчатой ступени, чтобы он вошел в камеру для отбора проб, и подождите от 30 до 45 минут, пока система остынет и стабилизируется, прежде чем приступать к сбору изображения. Используйте шестигранную клавишу на кассетном инструменте, чтобы открыть две пластины кассеты для передачи образцов. Открывайте пластины достаточно широко, чтобы опустить сетку между двумя пластинами, но не открывайте в максимальное положение.Используйте длинные щипцы, чтобы поднять коробку сетки образца из жидкого азота. Поверните его так, чтобы выемка выровняла с позицией хранения внутри сцены, и поместите ее на сцену. Используйте соответствующее устройство, чтобы открыть крышку ящика для хранения в правильном положении образца.Используя перевернутые щипцы, снимите сетку ТЕА с держателя образца, погрузите ее в жидкий азот, обеспечив, чтобы сторона углеродной пленки была размещена таким образом, чтобы она в конечном итоге была обращена к цели на мосту для отбора проб, и опустили ее в положение в кассете для передачи проб. Закройте картридж для образцов с помощью шестигранного ключа на кассетном инструменте. Используйте магнитную точку на кассетном инструменте, чтобы поднять и установить картридж, содержащий сетку, на мостик образца.Держите его погруженным или близко к жидкому азоту и в правильной ориентации. Поместите кассету плоско в позиционирующие штифты моста и осторожно подтолкните ее, чтобы убедиться, что она закреплена. Закройте и извлеките ящик для хранения вместе со оставшимися образцами.Переместите отверстие крышки криоступенчаты в положение визуализации и выключите свет камеры образца. Сдвиньте сцену к оптике, чтобы выровнять ее под объективом, затем осторожно опустите объектив в нужное положение с помощью рычага, убедив, что он лежит внутри крышки крио-сцены, но не касается ее. Накройте сцену и оптику непрозрачным черным занавесом, затем запустите программное обеспечение управления Cockpit на ПК cryoSIM. Нажмите кнопку режима считывания для каждой камеры и установите ее на CONV3 мегагерц.Убедитесь, что температура каждой камеры составляет 80 градусов по Цельсию и что вентилятор камеры выключен. Включите отраженную камеру, при свете выберите окружающую среду и под linkam, проверьте конденсатор, затем нажмите кнопку видеорежима. В окне Представление мозаики уменьшите масштаб, чтобы увидеть контур сетки.Нажмите «Найти сцену», если она не видна, и центрируете сетку, дважды щелкнув левой кнопкой мыши в середине круга. Используйте клавиши вверх и вниз, чтобы сфокусировать образец до тех пор, пока в фокусе не будет сфокусирована пленка поддержки сетки или любая другая соответствующая функция. Используйте девять и три клавиши на цифровой панели, чтобы изменить шаг Z.Как только сцена будет центрирована, отключите режим видео. Соберите мозаику видимого света, щелкнув Run Mosaic в представлении мозаики, чтобы создать плитки изображений видимого света, которые спирально выходят наружу от центра. Сохраните представление, нажав кнопку Сохранить мозаику.Осмотрите мозаику Bright-field вместе с любыми предыдущими изображениями флуоресцентной карты, отключив окружающий свет и конденсатор, а также видеорежим, затем включите необходимый лазер возбуждения и выберите соответствующую камеру и фильтр, первоначально со скоростью 50 милливатт в течение 50 миллисекунд экспозиции. Нажмите ноль, чтобы прикрепить изображение, и звездочку для автоматической контрастности. Кроме того, можно вручную настроить контрастность с помощью ползунка в нижней части изображения.После того, как биологически интересные клетки с подходящей флуоресценцией были найдены, отметьте их положение с помощью кнопки «Пометить сайт» в представлении Mosaic. Продолжайте отмечать все потенциальные сайты перед началом получения изображений. Повторно сохраните мозаику с отмеченными сайтами, нажав на Кнопку Сохранить сайты в файл.Чтобы сшить мозаичное изображение с помощью программного обеспечения stitchEm, перетащите файл текстовой мозаики в файл stitchEm с расширением BAT и сохраните объединенное TIF-изображение мозаичных плиток в той же папке. Чтобы сохранить изображение с отмеченными сайтами, перетащите текстовый файл мозаики и текстовый файл маркеров на значок одновременно. Установите время лазерной экспозиции на основе счетчиков и динамического диапазона в флуоресцентном изображении в нижней части окна обзора камеры.Выберите, какой фильтр применять, и оптимизируйте настройки для каждой длины волны используемого света возбуждения, включив каждый лазер отдельно. Нажмите на обе камеры, чтобы включить их. Вернитесь на один из отмеченных участков и снова сосредоточьтесь на нужной глубине.Оказавшись в фокусе в интересуемой области, выйдите из фокуса с помощью клавиши со стрелкой вверх в окне XY на макросхеме, чтобы выбрать высоту Z-стека для получения, и нажмите кнопку Сохранить сверху. Выйдите из фокуса с помощью клавиши со стрелкой вниз, нажмите «Сохранить внизу», затем на «Перейти к центру» убедитесь, что изображение все еще находится в фокусе. В окне Кабина выберите Эксперимент с одним сайтом.В раскрывающемся списке выберите Структурированное освещение. Измените высоту стека так, чтобы она равняется высоте Z плюс один микрометр. Введите время экспозиции в миллисекундах для 405 и 488 нанометровых лазеров в верхнем ряду для отраженной камеры и время экспозиции для 561 и 647 нанометровых лазеров в нижнем ряду для передаваемой камеры.Введите имя файла и нажмите «Обновить», чтобы создать новый файл, содержащий дату и время, не переопределяя предыдущие файлы, затем нажмите «Пуск». Если жидкий азот Дьюара заправляет криоступенчатую стадию во время получения изображения, прервайте процесс, нажав на кнопку ABORT в программном обеспечении Cockpit. В каждом положении соберите Z-стек, используя видимый свет, выключив лазеры и включив окружающий свет и конденсатор.В разделе Эксперимент с одним сайтом выберите Z-стек и установите экспозицию окружающего света на 20 миллисекунд, сохраняя высоту Z. Повторите этот процесс для всех помеченных сайтов. После завершения визуализации отстыкуйте этап и удалите все образцы.Выключите свет камеры для отбора проб. Отключите внешний Дьюар и декантируем оставшийся жидкий азот в другой криосовместимый контейнер, что позволит Дьюаку безопасно вернуться к нормальной температуре. Подождите, пока опция выпекания крио-сценического дисплея станет доступной после того, как на стадии Дьюара больше не останется жидкого азота.Нажмите кнопку выпекания, чтобы принять режим нагрева. Поместите заглушку крышки на крио-сцену. Разрешение в криоСИМ значительно выше, чем в стандартной эпифлуоресцентной микроскопии.Флуоресцентная карта с помощью обычного эпифлуоресцентного микроскопа может быть использована для определения местоположения областей, представляющих интерес для визуализации, а соответствующее изображение cryoSIM может быть получено из места на сетке. Образец, содержащий клетки U2OS, окрашивали смесью зеленого микротрубочка цитоскелетного красителя и красного красителя митохондрий, что приводило к окрашиванию компонента микротрубочек цитоскелета и митохондрий. Последующая визуализация показала локализацию митохондрий внутри клетки, а также расположение микротрубочек, подчеркнув структурный каркас, который они обеспечивают клетке, и сборку цитоскелета вокруг органелл.Процесс реконструкции SIM-карты может создавать артефакты, которые могут быть идентифицированы с помощью SIMCheck, бесплатного плагина imageJ. Эта контрастная карта модуляции, сгенерированная с помощью SIMCheck, показывает области с низкой контрастностью модуляции в области ядра, что указывает на то, что эта область будет более восприимчива к артефактам реконструкции. Белая стрелка указывает на артефакт реконструкции.При попытке этого протокола убедитесь, что образец всегда остается погруженным или близким к жидкому азоту, чтобы избежать девиттрификации. Также обратите внимание на время экспозиции и количество в динамическом диапазоне, так как это влияет на качество данных и позволяет избежать лазерного повреждения образца. После криовизуализации те же образцы могут быть визуализированы с помощью других методов, таких как криомягтерная рентгеновская томография, которую мы имеем здесь, в B24 Beamline.Комбинируя изображения cryoSIM с изображениями, содержащими структурную информацию о клетке, мы можем ответить на ключевые дополнительные вопросы о клеточной ультраструктуре и функции.

Research

JoVE Journal

Biology

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

Забор крови из американского Подкова Краб, Limulus Полифема

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Подготовка взрослых Drosophila Глаза для тонких Секционирование и микроскопический анализ

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

Птичий Семен коллекции клоаки массаж и изоляции ДНК из спермы

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Метод CryoAPEX для анализа электронной микроскопии мембранного белка в ультраструктурно-заповедных клетках

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Выделение высококачественных предсердных и желудочковых миоцитов мышей для одновременного измерения переходных процессов Ca2+ и кальциевого тока L-типа

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

Сбор и идентификация пыльцы из пчелиных семей

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Сбор тканей и извлечение РНК из остеоартритного коленного сустава человека

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Визуализация репликативных доменов в ультраструктурно сохраненном хроматине с помощью электронной томографии

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Удаленный сбор данных криоэлектронной томографии и усреднение субтомограмм

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...