क्रायो-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपिक डेटा संग्रह क्रायोजेनिक रूप से संरक्षित कोशिकाओं से

यह विधि सेलुलर संरचनाओं की ठीक पहचान करने के लिए पूरे जैविक कोशिकाओं पर सुपर रिज़ॉल्यूशन क्रायो इमेजिंग संभव बनाती है। इसका उपयोग सहसंबद्ध इमेजिंग वर्कफ्लो के हिस्से के रूप में अन्य तौर-तरीकों के साथ भी किया जा सकता है। इस तकनीक के मुख्य फायदे यह हैं कि सुपर रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग पारंपरिक फ्लोरोफोरस और अपेक्षाकृत कम प्रकाश खुराक का उपयोग करके क्रायोजेनिक स्थितियों में तेजी से किया जा सकता है।

साइरोसिम एक शक्तिशाली उपकरण है जो आंतरिक या बाहरी संकेतों के जवाब में सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर गतिशीलता को समझने की दिशा में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। इसके आवेदन में वैक्सीन उत्पादन और रोल आउट, गुणवत्ता नियंत्रण, बाजार के बाद निगरानी, एंटीबॉडी इंजीनियरिंग और अनुकूलन, साथ ही नैनो कण लक्षण शामिल हैं । क्रायो-स्टेज के भीतर नमूनों को युद्धाभ्यास ग्रिड की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए अभ्यास लेता है।

डेटा संग्रह से पहले कॉकपिट विंडो में नियंत्रण से खुद को परिचित कराना भी सबसे अच्छा है। शुरू करने के लिए, क्रायो-स्टेज के बाहरी देवर से ढक्कन हटा दें और फ़िल्टर तरल नाइट्रोजन डालें जब तक कि यह लगभग एक चौथाई भरा न हो जाए। अधिक डालने से पहले प्रारंभिक उबलते कम होने तक प्रतीक्षा करें और पोत को लगभग दो तिहाई पूर्ण तक भरें।

ढक्कन को ध्यान से बदलें, नोजल को हैंडलर से दूर की ओर इशारा करते हुए क्योंकि तरल नाइट्रोजन उबलता है। एक बार लिक्विड नाइट्रोजन आउटलेट से बाहर आना बंद कर दिया है, तो दुकान के पाइप को क्रायो-स्टेज पर स्टेज देवर के ऊपर रखें । पावर सोर्स में प्लग करें, यूएसबी केबल को कनेक्ट करें और बाहरी देवर में प्लग को स्टेज से जोड़ें।

तरल नाइट्रोजन के वितरण के बाद, क्रायो-स्टेज पर रिलीज बटन दबाएं ताकि यह नमूना कक्ष में प्रवेश कर सके और छवि अधिग्रहण के साथ शुरू होने से पहले सिस्टम को ठंडा और स्थिर करने के लिए 30 से 45 मिनट तक प्रतीक्षा करें। नमूना हस्तांतरण कैसेट की दो प्लेटों को खोलने के लिए कैसेट उपकरण पर हेक्स कुंजी का उपयोग करें। प्लेटों को खोलें जो दो प्लेटों के बीच ग्रिड को छोड़ने के लिए पर्याप्त है, लेकिन अधिकतम स्थिति के लिए खुला नहीं है।

तरल नाइट्रोजन से बाहर नमूना ग्रिड बॉक्स उठाने के लिए लंबे संदंश का प्रयोग करें। इसे चालू करें ताकि पायदान मंच के अंदर भंडारण की स्थिति के साथ संरेखित हो और इसे मंच पर रखें। सही नमूना स्थिति के लिए भंडारण बॉक्स ढक्कन खोलने के लिए उपयुक्त डिवाइस का उपयोग करें।

उल्टे संदंश का उपयोग करना, नमूना धारक से TEM ग्रिड को हटा दें, यह सुनिश्चित करना है कि कार्बन फिल्म पक्ष इतना है कि यह अंततः नमूना पुल पर उद्देश्य का सामना करना पड़ रहा है और यह नमूना हस्तांतरण कैसेट में स्थिति में छोड़ दिया जाएगा रखा है तरल नाइट्रोजन के अंदर विसर्जित कर दिया । कैसेट उपकरण पर हेक्स कुंजी का उपयोग कर नमूना कारतूस बंद करें। कैसेट उपकरण पर चुंबक बिंदु का उपयोग करने के लिए उठाने और नमूना पुल पर ग्रिड युक्त कारतूस माउंट।

इसे डूबे हुए या तरल नाइट्रोजन के करीब रखें और उचित अभिविन्यास में रखें। पुल के पोजिशनिंग पिन के भीतर कैसेट फ्लैट रखें और धीरे से यह सुनिश्चित करने के लिए नज यह तय है । किसी भी शेष नमूनों के साथ भंडारण बॉक्स को बंद करें और हटा दें।

क्रायो-स्टेज ढक्कन खोलने को इमेजिंग स्थिति में ले जाएं और नमूना कक्ष प्रकाश को बंद कर दें। उद्देश्य लेंस के तहत संरेखित करने के लिए प्रकाशिकी की ओर मंच स्लाइड करें, फिर धीरे-धीरे लीवर का उपयोग करके उद्देश्य को स्थिति में छोड़ दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि यह क्रायो-चरण के ढक्कन के भीतर टिकी हुई है, लेकिन इसे छूती नहीं है। एक अपारदर्शी काले पर्दे के साथ मंच और प्रकाशिकी को कवर करें, फिर क्रायोसिम पीसी पर नियंत्रण सॉफ्टवेयर कॉकपिट शुरू करें। प्रत्येक कैमरे के लिए रीडआउट मोड बटन पर क्लिक करें और इसे CONV3 मेगाहर्ट्ज में सेट करें।

जांच करें कि प्रत्येक कैमरे का तापमान 80 डिग्री सेल्सियस है और कैमरा प्रशंसक बंद है। परावर्तित कैमरे को चालू करें, प्रकाश के तहत, परिवेश चुनें और लिंकम के तहत, कंडेनसर पर जांच करें, फिर वीडियो मोड बटन पर क्लिक करें। मोज़ेक दृश्य खिड़की में, ग्रिड की रूपरेखा देखने के लिए ज़ूम आउट करें।

खोजें चरण पर क्लिक करें यदि इसे देखा नहीं जा सकता है और सर्कल के बीच में डबल लेफ्ट क्लिक करके ग्रिड को केंद्र में रखें। ग्रिड समर्थन फिल्म या किसी अन्य प्रासंगिक सुविधा ध्यान में है जब तक नमूना ध्यान केंद्रित करने के लिए ऊपर और नीचे कुंजी का उपयोग करें। जेड स्टेप बदलने के लिए न्यूमेरिकल पैड पर नौ और तीन चाबियों का इस्तेमाल करें।

एक बार मंच केंद्रित होने के बाद, वीडियो मोड बंद कर दें। केंद्र से बाहर की ओर सर्पिल दृश्यमान प्रकाश छवियों की टाइल्स का उत्पादन करने के लिए मोज़ेक दृश्य में रन मोज़ेक पर क्लिक करके एक दृश्यमान प्रकाश पच्चीकारी लीजिए। सेव मोज़ेक पर क्लिक करके देखें बचाओ।

परिवेश प्रकाश और कंडेनसर के साथ-साथ वीडियो मोड को बंद करके किसी भी पिछले फ्लोरेसेंस मानचित्र छवियों के साथ उज्ज्वल क्षेत्र मोज़ेक का निरीक्षण करें, फिर आवश्यक उत्तेजन लेजर चालू करें और संबंधित कैमरा और फ़िल्टर चुनें, शुरू में 50 मिलीसेकंड एक्सपोजर समय के लिए 50 मिलीवाट पर। ऑटो विपरीत करने के लिए एक छवि और स्टार तस्वीर के लिए शून्य प्रेस। वैकल्पिक रूप से, छवि के नीचे स्लाइडर का उपयोग करके इसके विपरीत को मैन्युअल रूप से समायोजित करें।

एक बार जब उपयुक्त फ्लोरेसेंस वाली जैविक रूप से दिलचस्प कोशिकाएं पाई गई हैं, तो मोज़ेक दृश्य में मार्क साइट बटन का उपयोग करके उनकी स्थिति को चिह्नित करें। छवि अधिग्रहण शुरू करने से पहले सभी संभावित साइटों को चिह्नित करना जारी रखें। फ़ाइल करने के लिए सेव साइटों पर क्लिक करके चिह्नित साइटों के साथ पच्चीकारी को फिर से सहेजें।

स्टिकरेम सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मोज़ेक छवि को सिलाई करने के लिए, टेक्स्ट मोज़ेक फ़ाइल को एक्सटेंशन बैट के साथ स्टिचेम फाइल में खींचें और छोड़ दें और एक ही फ़ोल्डर में मोज़ेक टाइल्स की संयुक्त टीआईएफ छवि को बचाएं। चिह्नित साइटों के साथ एक छवि को बचाने के लिए, मोज़ेक टेक्स्ट फ़ाइल को खींचें और छोड़ दें और मार्कर टेक्स्ट फ़ाइल को एक ही समय में आइकन में रखें। कैमरा व्यू विंडो के नीचे फ्लोरेसेंस इमेज में मायने रखता है और गतिशील रेंज के आधार पर लेजर एक्सपोजर समय सेट करें।

चुनें कि कौन सा फ़िल्टर लागू करने के लिए और उमंग प्रकाश की प्रत्येक तरंगदैर्ध्य के लिए सेटिंग्स का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए, अलग से प्रत्येक लेजर मोड़। उन्हें चालू करने के लिए दोनों कैमरों पर क्लिक करें। चिह्नित साइटों में से एक पर लौटें और फिर से वांछित गहराई पर ध्यान केंद्रित करें।

एक बार ब्याज के क्षेत्र में ध्यान केंद्रित करने में, मैक्रो स्टेज पर XY खिड़की में ऊपर तीर कुंजी का उपयोग कर ध्यान से बाहर जाने के लिए प्राप्त करने के लिए जेड की ऊंचाई का चयन करने के लिए ढेर और शीर्ष बचाओ पर क्लिक करें । डाउन एरो कुंजी का उपयोग करके फोकस से बाहर निकलें, सेव बॉटम पर क्लिक करें, फिर केंद्र पर जाएं, सत्यापित करें कि छवि अभी भी फोकस में है। कॉकपिट विंडो में एकल साइट प्रयोग का चयन करें।

ड्रॉप-डाउन सूची से संरचित रोशनी का चयन करें। स्टैक ऊंचाई को बदलें ताकि यह जेड ऊंचाई प्लस एक माइक्रो मीटर के बराबर हो। परिलक्षित कैमरे के लिए ऊपरी पंक्ति में 405 और 488 नैनोमीटर लेजर के लिए मिलीसेकंड में एक्सपोजर समय दर्ज करें और प्रेषित कैमरे के लिए निचली पंक्ति में 561 और 647 नैनोमीटर लेजर के लिए एक्सपोजर समय।

एक फ़ाइल नाम इनपुट करें और पिछली फ़ाइलों को अधिभावी किए बिना तारीख और समय वाली एक नई फ़ाइल का उत्पादन करने के लिए अपडेट पर क्लिक करें, फिर स्टार्ट पर क्लिक करें। यदि तरल नाइट्रोजन देवर छवि अधिग्रहण के दौरान क्रायो-चरण को फिर से भर देता है, तो कॉकपिट सॉफ्टवेयर में गर्भपात बटन पर क्लिक करके प्रक्रिया को निरस्त करें। प्रत्येक स्थिति में, लेजर बंद करने और परिवेश प्रकाश और कंडेनसर पर स्विच करके दृश्य प्रकाश का उपयोग करके एक जेड-स्टैक इकट्ठा करें।

एकल साइट प्रयोग के तहत, जेड-स्टैक का चयन करें और जेड ऊंचाई को बनाए रखते हुए परिवेश प्रकाश को 20 मिलीसेकंड एक्सपोजर में सेट करें। सभी चिह्नित साइटों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। इमेजिंग के बाद मंच अनडॉक समाप्त हो गया है और सभी नमूनों को हटा दें।

नमूना चैंबर लाइट बंद कर दें। बाहरी देवर को अनप्लग करें और किसी भी शेष तरल नाइट्रोजन को एक और क्रायो संगत कंटेनर में डिकंट करें, जिससे देवर को सामान्य तापमान पर सुरक्षित रूप से लौटने की अनुमति मिलती है। जब तक क्रायो-स्टेज डिस्प्ले को बेक करने का विकल्प उपलब्ध नहीं हो जाता तब तक प्रतीक्षा करें, जब तक कि कोई और तरल नाइट्रोजन चरण देवर में रहता है।

हीटिंग मोड में प्रवेश करने के लिए बेक आउट बटन दबाएं। क्रायो-स्टेज पर ढक्कन प्लग रखो। क्रायोसिम में संकल्प मानक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी की तुलना में काफी अधिक है।

एक पारंपरिक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप से फ्लोरेसेंस मानचित्र का उपयोग इमेजिंग के लिए ब्याज के क्षेत्रों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है और ग्रिड पर एक स्थान से संबंधित क्रायोसिम छवि प्राप्त की जा सकती है। यू2ओएस कोशिकाओं वाले एक नमूने को हरे माइक्रोट्यूबुले साइटोस्केलेटन डाई और लाल माइटोकॉन्ड्रिया डाई के मिश्रण से दाग दिया गया था जिसके परिणामस्वरूप साइटोस्केलेटन और माइटोकॉन्ड्रिया के माइक्रोटुबुल घटक का धुंधला हो गया था। बाद में इमेजिंग ने कोशिका के भीतर माइटोकॉन्ड्रिया के स्थानीयकरण के साथ-साथ माइक्रोट्यूबुल्स की व्यवस्था को दिखाया, जो संरचनात्मक ढांचे को उजागर करता है जो वे ऑर्गेनेल्स के आसपास साइटोस्केलेटन के सेल और असेंबली को प्रदान करते हैं।

सिम पुनर्निर्माण प्रक्रिया कलाकृतियों का उत्पादन कर सकती है जिसे सिमचेक, एक मुफ्त इमेजजे प्लगइन का उपयोग करके पहचाना जा सकता है। सिमचेक का उपयोग करके उत्पन्न यह मॉड्यूलेशन कंट्रास्ट मानचित्र नाभिक क्षेत्र के भीतर कम मॉड्यूलेशन विपरीत क्षेत्रों को दर्शाता है, यह दर्शाता है कि यह क्षेत्र पुनर्निर्माण कलाकृतियों के लिए अधिक संवेदनशील होने जा रहा है। सफेद तीर एक पुनर्निर्माण विरूपण साक्ष्य इंगित करता है।

इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय यह सुनिश्चित करें कि नमूना डी-विट्रीफिकेशन से बचने के लिए हर समय जलमग्न या तरल नाइट्रोजन के करीब रहता है। इसके अलावा जोखिम समय पर ध्यान देना और गतिशील रेंज में गिना जाता है, क्योंकि यह डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित करता है और नमूना करने के लिए लेजर क्षति से बचा जाता है। क्रायो इमेजिंग के बाद, उन्हीं नमूनों को क्रायो-सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राफी जैसे अन्य तौर-तरीकों से इमेज किया जा सकता है, जो हमारे यहां B24 बीमलाइन पर हैं ।

सेल के बारे में संरचनात्मक जानकारी वाली छवियों के साथ क्रायोसिम छवियों के संयोजन से, हम सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर और कार्य पर प्रमुख अतिरिक्त सवालों के जवाब दे सकते हैं।