Name: production of human crispr-engineered car-t cells
Uploaded: 2021-03-15T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells at JoVE.com

우리는 펜실베니아 대학의 정상적인 기증자 T 세포와 흐름 세포 측정 코어를 제공하는 인간 면역학 코어를 인정합니다.

인간 T 세포는 펜실베니아 대학 인간 면역학 코어를 통해 조달되었으며, 이는 MIATA 및 펜실베니아 대학 윤리 지침에 부합하는 샘플 수령, 처리, 동결 및 분석을 위한 확립된 표준 운영 절차 및/또는 프로토콜을 갖춘 우수 실험실 실습의 원칙에 따라 운영됩니다.
1. 렌티바이러스 벡터 생산
참고: 바이러스 성 제품은 4 개의 별도 플라스미드로 포장 구조 (Rev, gag...

<ol>
	<li>Kowolik, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+provided+through+a+CD19-specific+chimeric+antigen+receptor+enhances+in+vivo+persistence+and+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+T+cells.">CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).</li><li>Krause, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-dependent+CD28+signaling+selectively+enhances+survival+and+proliferation+in+genetically+modified+activated+human+primary+T+lymphocytes.">Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).</li><li>Kuwana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+chimeric+receptor+composed+of+immunoglobulin-derived+V+resions+and+T-cell+receptor-derived+C+regions.">Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions.</a> Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).</li><li>Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivi&#232;re, I., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-lymphocyte+cytotoxicity+and+proliferation+directed+by+a+single+chimeric+TCR&#950;/CD28+receptor.">Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCR&#950;/CD28 receptor.</a> Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).</li><li>Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+manufacturing+of+CAR-T+cell+therapy.">Global manufacturing of CAR-T cell therapy.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 4, 92-101 (2017).</li><li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axicabtagene+ciloleucel+CAR-T-cell+therapy+in+refractory+large+B-cell+lymphoma.">Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+and+NK-cell+infiltration+into+solid+tumors:+a+key+limiting+factor+for+efficacious+cancer+immunotherapy.">T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy.</a> Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).</li><li>Mohammed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cell+function+by+reversing+the+immunosuppressive+tumor+microenvironment+of+pancreatic+cancer.">Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer.</a> Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).</li><li>Moon, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifactorial+T-cell+hypofunction+that+is+reversible+can+limit+the+efficacy+of+chimeric+antigen+receptor-transduced+human+T+cells+in+solid+tumors.">Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors.</a> Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).</li><li>Beatty, G. L., O'Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+the+treatment+of+solid+tumors:+defining+the+challenges+and+next+steps.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 166, 30-39 (2016).</li><li>Stadtmauer, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-engineered+T+cells+in+patients+with+refractory+cancer.">CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer.</a> Science. 367 (6481), (2020).</li><li>MacLeod, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+a+CD19+CAR+into+the+TCR+alpha+chain+locus+streamlines+production+of+allogeneic+gene-edited+CAR-T+cells.">Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells.</a> Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+editing+to+generate+universal+CAR-T+cells+resistant+to+PD1+inhibition.">Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition.</a> Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).</li><li>Ure&#241;a-Bail&#233;n, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+technology:+towards+a+new+generation+of+improved+CAR-T+cells+for+anticancer+therapies.">CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies.</a> Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).</li><li>Li, C., Mei, H., Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+explorations+of+CRISPR/Cas9+in+CAR-T-cell+therapy.">Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy.</a> Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells.">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> Elife. 2, 00471 (2013).</li><li>Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefran&#231;ois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+mediates+the+homeostasis+of+naive+and+memory+CD8+T+cells+in+vivo.">Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo.</a> Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).</li><li>Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+choices:+regulation+of+memory+CD8+T+cell+generation+and+homeostasis+by+interleukin+(IL)-7+and+IL-15.">Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15.</a> The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+(CAR-T)+cells+expanded+with+IL-7/IL-15+mediate+superior+antitumor+effects.">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein &amp; Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li><li>Hultquist, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+genome+engineering+of+primary+CD4++T+cells+for+the+interrogation+of+HIV-host+factor+interactions.">CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions.</a> Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).</li></ol>

여기에서 우리는 CRISPR Cas9 기술을 사용하여 CAR-T 세포를 유전자 편집하고 기능과 효능을 더 테스트하기 위해 제품을 제조하는 접근법을 설명합니다. 상기 프로토콜은 키메라 항원 수용체를 가진 엔지니어링 T 세포와 결합된 1차 인간 T 세포에서 CRIPSR 유전자 편집을 수행하기 위해 최적화되었습니다. 이 프로토콜은 최소한의 기증자- 기증자- 기증자 가변성으로 높은 녹아웃 효율성을 허용합니다. CRI...

키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포 치료제는 입양세포 치료 및 암 면역요법 분야에 혁명을 일으켰습니다. CAR-T 세포는 T-세포 활성화 및 공동 자극1,2,3,4에 필요한 TCRzeta 사슬 및 비용 발생 도메인에서 파생된 신호 도메인과 항원 특이적 단일 사슬 항체 단편을 결합하는 합성 면역 수용체를 발현하는 T-세포설계 . CAR-T 세포의 제조는 환자의 T 세포를 추출하는 것으로 시작하여 CAR 모듈의 전 생체 바이러스 성 트랜스포 변환 및 인공 항원 제시 세포로 작동하는 자기 구슬로 CAR-T 셀 제품의 확장에 선행된다5. 확장된 CAR-T 세포는 이식할 수 있는 환자로 재주입되어 표적 종양 세포를 제거하고 주입6,7,8까지다년간 지속된다. CAR-T 세포 치료는 B 세포 악성 종양에서 놀라운 반응률을 초래했지만, 고형 종양에 대한 임상 성공은 가난한 T 세포 침투9,면역 억제 종양 미세 환경10,항원 커버리지 및 특이성 및 CAR-T 세포 기능 장애11,12를 포함한 여러 요인에 의해 도전되었습니다. . 현재 CAR-T 세포 치료의 또 다른 제한은 자가 T 세포의 사용을 포함한다. 화학요법과 높은 종양 부담의 다발 후에, CAR-T 세포는 자가 CAR-T 세포의 제조와 관련되었던 시간 및 비용 이외에 건강한 기증자에서 동종 CAR-T 제품에 비해 나쁜 질일 수 있습니다. CRISPR/Cas9에 의한 CAR-T 세포 제품의 유전자편집은 CAR-T 세포13,14,15,16,17의현재 한계를 극복하기 위한 새로운 전략을 나타낸다.
CRISPR/Cas9는 포유류세포(18,19)에서표적 게놈 편집에 사용될 수 있는 2개의 성분 시스템이다. CRISPR-관련 엔도누블레스 Cas9은 표적 DNA서열(20)과염기 페어링을 통해 작은 RNA에 의해 유도된 사이트 별 이중 가닥 브레이크를 유도할 수 있다. 수리 템플릿이 없는 경우, 이중 가닥 파손은 오차경향이 있는 비homologous end 결합(NHEJ) 경로에 의해 수리되며, 삽입 및 삭제 돌연변이(INDELs)19,20,21을통해 프레임 시프트 돌연변이 또는 조기 정지 코돈의 결과로 된다. 효율성, 사용 용이성, 비용 효율성 및 멀티플렉스 게놈 편집 능력은 CRISPR/Cas9를 자가 및 동종 CAR-T 세포의 효능과 안전성을 향상시키는 강력한 도구입니다. 이 방법은 CAR 구조를 TCR로 대체하여 TCR 지시 T 셀을 편집하는 데도 사용할 수 있습니다. 또한, 숙주 질병 대 접목을 일으킬 수 있는 잠재력이 제한된 동종 CAR-T 세포는 또한 TCR, b2m 및 HLA 궤적을 편집하는 유전자에 의해 생성될 수 있다.
이 프로토콜에서, 우리는 T 세포의 CRISPR 공학이 향상된 효험과 안전성을 가진 게놈 편집 CAR-T 세포 제품을 생성하기 위하여 CAR-Transgene의 바이러스 벡터 매개 납품과 결합될 수 있는 방법을 보여줍니다. 전체 프로세스의 회로도도는 그림 1에표시됩니다. 이 접근을 사용하여, 우리는 1 차적인 인간 CAR-T 세포에 있는 고효율 유전자 녹아웃을 보여주었습니다. 그림 2A는 T 셀 편집 및 제조를 위한 각 단계의 타임라인을 자세히 설명합니다. 가이드 RNA 설계 및 녹아웃 검증을 위한 전략은 또한 각종 표적 유전자에 이 접근을 적용하기 위하여 토론됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4D-Nucleofactor Core Unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4D-Nucleofactor X-Unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accuprime Pfx Supermix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12344040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima XPN ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317322</td>
			<td>Clone OKT3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 Anti-human PD1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td></td>
			<td>Clone EH12.2H7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9-Electroporation enhancers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1075915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 Dynabeads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell isolation Kit</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>15062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8+ T cell isolation Kit</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>15063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning T150 cell culture flask</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAeasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag Magnet</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>huIL-15</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>huIL-7</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin Gel and PCR cleanup</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTRPE expression Plasmid</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE</td>
			<td>CytoArt</td>
			<td>200105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spy Fi Cas9</td>
			<td>Aldevron</td>
			<td>9214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral packaging mix</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Vivo-15 Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02-060F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of human crispr-engineered car-t cells

키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T 세포)를 이용한 입양 세포 치료는 혈액학적 악성 종양 환자에서 놀라운 임상 효능을 입증했으며 현재 다양한 고형 종양에 대한 조사를 받고 있습니다. CAR-T 세포는 환자의 혈액에서 T 세포를 제거하고 표적 종양 세포를 인식하고 제거하기 위해 T 세포를 리디렉션합성 면역 수용체를 발현하도록 엔지니어링하여 생성됩니다. CAR-T 세포의 유전자 편집은 현재 CAR-T 세포 치료의 안전성을 개선하고 CAR-T 세포의 효능을 더욱 증가시킬 가능성이 있습니다. 여기에서는 인간 CRISPR 에서 설계한 CD19 지향 CAR-T 세포의 활성화, 확장 및 특성화에 대한 방법을 설명합니다. 이는 CAR 렌티바이러스 벡터의 트랜스듀션및 단일 가이드 RNA(sgRNA) 및 Cas9 엔도누셀의 사용을 T 세포에 대한 관심있는 유전자를 표적으로 하는 것으로 구성된다. 이 프로토콜에 기술된 방법은 이 연구를 위해 사용된 것 이외에 그밖 CAR 구조 및 표적 유전자에 보편적으로 적용될 수 있습니다. 더욱이, 이 프로토콜은 gRNA 설계를 위한 전략을, 리드 gRNA 선택 및 임상급 인간 T 세포의 고효율, 멀티플렉스 CRISPR-Cas9 공학을 재현가능하게 달성하기 위한 표적 유전자 녹아웃 검증에 대해 설명합니다.

우리는 여기에서 TCR 리디렉션T 세포뿐 아니라 자가 및 동종 CAR-T 세포를 둘 다 생성하는 데 사용할 수 있는 T 세포를 유전적으로 설계하는 프로토콜을 기술합니다.
도 1은 CRISPR 편집T 셀 제조 과정에 관련된 단계에 대한 자세한 설명을 제공한다. 이 과정은 관심 있는 유전자에 sgRNA를 설계하여 시작합니다. SgRNA가 설계되고 합성되면 적절한 Cas 단백질로 RNP ?...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells at JoVE.com

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

여기서, 우리는 CAR-T 세포를 수정하기 위하여 CRISPR Cas 기술을 사용하여 1 차적인 인간 T 세포에 있는 유전자 편집을 위한 프로토콜을 제시합니다.

인간 CRISPR-엔지니어링 CAR-T 셀 생산

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

우리의 실험실 프로토콜은 CAR T 세포 치료와 인간 게놈 편집의 조합을 가능하게 합니다. 실험실 절차는 높은 효율을 가진 최대 3개의 유전자를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9를 가진 접근입니다. 그리고 마지막으로, 우리의 접근 방식은 인간 적인 임상 시험으로 번역될 수 있습니다.설명된 방법은 다른 CAR 구조 및 표적 유전자에 적용될 수 있다. 기술의 기초는 더 큰 규모로 번역 될 정도로 강력하고 추가 개발을위한 학술 및 산업 협력자. 이 프로토콜을 처음으로 시도할 때, 정확한 잠복기를 가능하게 하기 위하여 가이드 RNA 스크린에 있는 단의 수를 제한합니다.설명된 바와 같이 문화 조건과 파종 밀도를 준수하는 것은 우리의 경험에 매우 중요한 것으로 입증되었습니다. 우선, 건강한 자원 봉사 기증자로부터 자가 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMC를 얻고 시판적으로 이용 가능한 CD4 및 CD8 선택 키트를 사용하여 CD4 및 CD8 양성 T 세포를 분리하십시오. CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포를 1대 1 비율로 결합하고 R10의 밀리리터당 3백만 개의 세포를 배양하고, 각 인간 IL7 및 인간 IL15의 밀리리터 당 5 나노그램으로 보충하여 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 보충합니다.다음 날, T 세포와 원심분리기를 5~1,000만 개의 세포에 5분 동안 300배 G로 계산합니다. 모든 상류제를 버리고 셀 펠릿을 최소한의 필수 매체로 씻어 내십시오. 제조업체의 지시에 따라 100 마이크로리터의 핵 애정 솔루션에서 펠릿을 다시 중단합니다.세포를 세척하는 동안, 실온에서 10 분 동안 5 마이크로 그램의 단일 가이드 RNA와 Cas9 뉴클레아제 10 마이크로 그램을 배양하여 리보뉴클레오단백질 또는 RNP 복합체를 준비합니다. 단일 가이드 RNA 없이 모의 제어를 포함한다. 다시 중단된 세포를 RNP 복합체와 결합하고 4개의 마이크로몰러 전기화 증강기의 4.2 마이크로리터를 추가합니다.잘 섞어서 전기기공 큐벳으로 옮춥니까. 펄스 코드 EH111을 사용하여 세포를 전기화한 다음 R10에서 밀리리터 당 5백만 개의 세포를 배양한 다음 밀리리터 인간 IL7 당 5 나노그램과 12 개의 우물 판에서 48 시간 동안 섭씨 30도의 인간 IL15로 보충합니다. 인큐베이션 후 T 세포 활성화 및 확장을 진행합니다.표준 프라이머 설계 소프트웨어에 PCR 앰플리코의 시퀀스를 입력하여 시퀀싱 프라이머를 설계합니다. 설계 소프트웨어는 Sanger 시퀀싱에 적합한 여러 프라이머 시퀀스를 제안합니다. gRNA 절단 부위의 상류 또는 하류에 적어도 150개의 베이스 쌍을 결합하는 전방 및 역프라이머를 선택하여 인델 주위의 좋은 시퀀싱 품질을 보장합니다.TIDE 분석을 사용하여 유전체 수준에서 녹아웃 효율을 감지합니다. 알고리즘은 시퀀스 추적에서 인델스펙트럼을 정확하게 재구성하고 R 정사각형 값을 계산합니다. 활성화 후, T 세포는 문화권으로 확장되고 향후 연구를 위해 냉동 보존됩니다.확장 하는 동안, 인구 두 배로 및 볼륨 변경 모의 및 편집 된 CAR T 셀에 대 한 프로토콜에 걸쳐 추적 됩니다. 확장 기간 동안 증식 및 활성화에서 큰 변화가 감지되지 않았습니다. 세포가 극저온 보존되면, CAR 발현의 수준은 모의 편집 및 녹아웃 CAR T 세포 모두에 대한 추가 기능 적 연구를 위해 결정되었다.중요한 변화는 관찰되지 않았습니다. 녹아웃 효율성은 여러 기술을 사용하여 결정할 수 있습니다. 이러한 대표적인 유동 세포측정플롯에서, PDCD1 및 TRAC loci는 단일 가이드 RNA를 사용하여 표적으로 삼았으며, PDCD1 단일 가이드 RNA에 대한 90%의 효율과 여러 명의 건강한 기증자에 걸쳐 TRAC 단일 가이드 RNA에 대해 98%의 효율을 나타냈다.Cas9 및 가이드 RNA의 어금니 비율이 정확한지 확인하는 것이 중요합니다. 시술 중에 세포는 항상 섭씨 4도에서 유지되어야하며 장기간 전기 기화 용액에 남아 있지 않아야합니다. CAR 보존 후, CRISPR 엔지니어링 CAR T 세포는 세포 독성 분석, 사이토카인 생성 및 신유전학 또는 제노그래프 종양 마우스 모델과 같은 생체 내 기능적 분석에 사용될 수 있다.CRISPR Cas9 기술을 사용하는 우리의 접근 방식은 이제 임상 시험에 적용되고 있습니다. 접근은 암, 뿐만 아니라 전 세계 아이들과 성인의 수백만에 영향을 미치는 헤모글로빈노피와 같은 비 악성 유전 무질서를 위해 둘 다 이용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

B 세포의 재조합 생산 및 Retroviral 감염

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

연구

면역학 및 감염병학

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

세균성 병원체에 의해 인간의 세포의 침략

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

배려의 아교 모세포종 표준의 맥락에서 입양 치료에 대한 자동차 T 세포의 생성

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

인간 중간 엽 줄기 세포의 면역 속성 (MSCS)의 평가

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

소설 급지대 무료 시스템 대량 생산을 위한 생체 외에서 Murine 자연 킬러 세포의

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...