Name: production of human crispr-engineered car-t cells
Uploaded: 2021-03-15T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells at JoVE.com

Мы признаем ядро иммунологии человека для обеспечения нормальных донорских Т-клеток и ядро проточной цитометрии в Университете Пенсильвании.

Человеческие Т-клетки были закуплены через Университет Пенсильвании Human Immunology Core, который работает в соответствии с принципами надлежащей лабораторной практики с установленными стандартными операционными процедурами и / или протоколами для получения, обработки, замораживания и анал?...

<ol>
	<li>Kowolik, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+provided+through+a+CD19-specific+chimeric+antigen+receptor+enhances+in+vivo+persistence+and+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+T+cells.">CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).</li><li>Krause, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-dependent+CD28+signaling+selectively+enhances+survival+and+proliferation+in+genetically+modified+activated+human+primary+T+lymphocytes.">Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).</li><li>Kuwana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+chimeric+receptor+composed+of+immunoglobulin-derived+V+resions+and+T-cell+receptor-derived+C+regions.">Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions.</a> Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).</li><li>Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivi&#232;re, I., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-lymphocyte+cytotoxicity+and+proliferation+directed+by+a+single+chimeric+TCR&#950;/CD28+receptor.">Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCR&#950;/CD28 receptor.</a> Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).</li><li>Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+manufacturing+of+CAR-T+cell+therapy.">Global manufacturing of CAR-T cell therapy.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 4, 92-101 (2017).</li><li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axicabtagene+ciloleucel+CAR-T-cell+therapy+in+refractory+large+B-cell+lymphoma.">Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+and+NK-cell+infiltration+into+solid+tumors:+a+key+limiting+factor+for+efficacious+cancer+immunotherapy.">T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy.</a> Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).</li><li>Mohammed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cell+function+by+reversing+the+immunosuppressive+tumor+microenvironment+of+pancreatic+cancer.">Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer.</a> Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).</li><li>Moon, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifactorial+T-cell+hypofunction+that+is+reversible+can+limit+the+efficacy+of+chimeric+antigen+receptor-transduced+human+T+cells+in+solid+tumors.">Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors.</a> Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).</li><li>Beatty, G. L., O'Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+the+treatment+of+solid+tumors:+defining+the+challenges+and+next+steps.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 166, 30-39 (2016).</li><li>Stadtmauer, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-engineered+T+cells+in+patients+with+refractory+cancer.">CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer.</a> Science. 367 (6481), (2020).</li><li>MacLeod, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+a+CD19+CAR+into+the+TCR+alpha+chain+locus+streamlines+production+of+allogeneic+gene-edited+CAR-T+cells.">Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells.</a> Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+editing+to+generate+universal+CAR-T+cells+resistant+to+PD1+inhibition.">Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition.</a> Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).</li><li>Ure&#241;a-Bail&#233;n, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+technology:+towards+a+new+generation+of+improved+CAR-T+cells+for+anticancer+therapies.">CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies.</a> Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).</li><li>Li, C., Mei, H., Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+explorations+of+CRISPR/Cas9+in+CAR-T-cell+therapy.">Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy.</a> Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells.">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> Elife. 2, 00471 (2013).</li><li>Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefran&#231;ois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+mediates+the+homeostasis+of+naive+and+memory+CD8+T+cells+in+vivo.">Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo.</a> Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).</li><li>Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+choices:+regulation+of+memory+CD8+T+cell+generation+and+homeostasis+by+interleukin+(IL)-7+and+IL-15.">Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15.</a> The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+(CAR-T)+cells+expanded+with+IL-7/IL-15+mediate+superior+antitumor+effects.">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein &amp; Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li><li>Hultquist, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+genome+engineering+of+primary+CD4++T+cells+for+the+interrogation+of+HIV-host+factor+interactions.">CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions.</a> Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).</li></ol>

Здесь мы описываем подходы к редактированию генов CAR-T-клеток с использованием технологии CRISPR Cas9 и производству продуктов для дальнейшего тестирования функции и эффективности. Вышеуказанный протокол был оптимизирован для выполнения редактирования генов CRIPSR в первичных Т-клетках чело...

Терапия химерными антигенными рецепторами (CAR)-Т-клетками произвела революцию в области приемной клеточной терапии и иммунотерапии рака. CAR-T-клетки представляют собой инженерные Т-клетки, экспрессирующие синтетический иммунный рецептор, который сочетает антиген-специфический фрагмент одноцепочечного антитела с сигнальными доменами, полученными из цепи TCRzeta, и костимуляторными доменами, необходимыми и достаточными для активации Т-клеток и костимуляции1,2,3,4 . Производство CAR-T-клеток начинается с извлечения собственных Т-клеток пациента, за которыми следует вирусная трансдукция ex vivo модуля CAR и расширение продукта CAR-T-клеток магнитными шариками, которые функционируют как искусственные антиген-презентационные клетки5. Расширенные CAR-T-клетки повторно вводятся пациенту, где они могут приживляться, устранять опухолевые клетки-мишени и даже сохраняться в течение нескольких лет после инфузии6,7,8. Хотя терапия CAR-T-клетками привела к замечательным показателям ответа при злокачественных новообразованиях В-клеток, клинический успех солидных опухолей был поставлен под сомнение несколькими факторами, включая плохую инфильтрацию Т-клеток9,иммуносупрессивную микроокружение опухоли10,охват и специфичность антигена и дисфункцию CAR-T-клеток11,12 . Другое ограничение современной терапии CAR-T-клетками включает использование аутологицных Т-клеток. После нескольких раундов химиотерапии и высокой опухолевой нагрузки CAR-T-клетки могут быть низкого качества по сравнению с аллогенными продуктами CAR-T от здоровых доноров в дополнение ко времени и затратам, связанным с производством аутологичных CAR-T-клеток. Генное редактирование продукта CAR-T-клеток с помощью CRISPR/Cas9 представляет собой новую стратегию преодоления существующих ограничений CAR-T-клеток13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 представляет собой двухкомпонентную систему, которая может быть использована для целенаправленного редактирования генома в клетках млекопитающих18,19. CRISPR-ассоциированная эндонуклеаза Cas9 может индуцировать сайт-специфические двухцепочечные разрывы, управляемые небольшими РНК, путем спаривания оснований с целевой последовательностью ДНК20. При отсутствии шаблона восстановления двухцепочечные разрывы восстанавливаются по подверженному ошибкам пути негомологичных конечных соединений (NHEJ), что приводит к мутациям сдвига кадра или преждевременным стоп-кодонам через мутации вставки и делеции (INDL)19,20,21. Эффективность, простота использования, экономичность и возможность мультиплексного редактирования генома делают CRISPR/Cas9 мощным инструментом для повышения эффективности и безопасности аутологичных и аллогенных CAR-T-клеток. Этот подход также может быть использован для редактирования TCR-направленных Т-клеток путем замены конструкции CAR на TCR. Кроме того, аллогенные CAR-T-клетки, которые имеют ограниченный потенциал вызывать болезнь трансплантата по сравнению с болезнью хозяина, также могут быть сгенерированы путем редактирования генов локуса TCR, b2m и HLA.
В этом протоколе мы показываем, как CRISPR-инженерия Т-клеток может быть объединена с вирусной векторной доставкой CAR-Transgene для генерации отредактированных геномом продуктов CAR-T-клеток с повышенной эффективностью и безопасностью. Принципиальная схема всего процесса показана на рисунке 1. Используя этот подход, мы продемонстрировали высокоэффективный нокаут гена в первичных клетках CAR-T человека. На рисунке 2A подробно описана временная шкала каждого этапа редактирования и изготовления Т-клеток. Также обсуждаются стратегии проектирования направляющей РНК и нокаутной валидации для применения этого подхода к различным генам-мишеням.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4D-Nucleofactor Core Unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4D-Nucleofactor X-Unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accuprime Pfx Supermix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12344040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima XPN ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317322</td>
			<td>Clone OKT3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 Anti-human PD1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td></td>
			<td>Clone EH12.2H7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9-Electroporation enhancers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1075915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 Dynabeads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell isolation Kit</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>15062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8+ T cell isolation Kit</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>15063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning T150 cell culture flask</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAeasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag Magnet</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>huIL-15</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>huIL-7</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin Gel and PCR cleanup</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTRPE expression Plasmid</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE</td>
			<td>CytoArt</td>
			<td>200105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spy Fi Cas9</td>
			<td>Aldevron</td>
			<td>9214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral packaging mix</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Vivo-15 Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02-060F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of human crispr-engineered car-t cells

Приемная клеточная терапия с использованием Т-клеток рецептора химерного антигена (CAR-T-клетки) продемонстрировала замечательную клиническую эффективность у пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями и в настоящее время исследуется на предмет различных солидных опухолей. CAR-T-клетки генерируются путем удаления Т-клеток из крови пациента и их разработки для экспрессии синтетического иммунного рецептора, который перенаправляет Т-клетки для распознавания и устранения опухолевых клеток-мишеней. Редактирование генов CAR-T-клеток имеет потенциал для повышения безопасности современных CAR-T-клеточных терапий и дальнейшего повышения эффективности CAR-T-клеток. Здесь мы описываем методы активации, расширения и характеристики CD19-направленных CAR-T-клеток человека, спроектированных CRISPR. Это включает в себя трансдукцию лентивирусного вектора CAR и использование однонаправленной РНК (sgRNA) и эндонуклеазы Cas9 для нацеливания генов, представляющих интерес в Т-клетках. Методы, описанные в этом протоколе, могут быть универсально применены к другим конструкциям CAR и генам-мишеням, помимо тех, которые используются для этого исследования. Кроме того, в этом протоколе обсуждаются стратегии проектирования гРНК, отбора свинцовой гРНК и валидации нокаута генов-мишеней для воспроизводимого достижения высокоэффективной мультиплексной инженерии CRISPR-Cas9 Т-клеток человека клинического класса.

Мы описываем здесь протокол генетической инженерии Т-клеток, который может быть использован для генерации как аутологичных, так и аллогенных CAR-T-клеток, а также TCR-перенаправленных Т-клеток.
На рисунке 1 приведено подробное описание этапов, участвующих в п...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells at JoVE.com

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Здесь мы представляем протокол редактирования генов в первичных Т-клетках человека с использованием технологии CRISPR Cas для модификации CAR-T-клеток.

Производство человеческих CRISPR-инженерных CAR-T-клеток

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

Наш лабораторный протокол позволяет сочетать редактирование генома человека с CAR T-клеточной терапией. Лабораторная процедура представляет подход с ПОМОЩЬЮ CRISPR-Cas9 к нацеливаниям до трех генов с высокой эффективностью. И, наконец, наш подход может быть переведен в клинические испытания на людях.Описанные методы могут быть применены к другим конструкциям CAR и генам-мишеням. Основа методов достаточно надежна, чтобы быть переведенной в более широкий масштаб и академическим и отраслевым сотрудникам для дальнейшего развития. При первой попытке применения этого протокола ограничьте количество групп на экране направляющей РНК, чтобы обеспечить точное время инкубации.Соблюдение условий культуры и плотности посева, как описано, оказалось критически важным в нашем опыте. Для начала получите аутологичные мононуклеарные клетки периферической крови, или PBMCs, от здоровых доноров-добровольцев и выделите CD4 и CD8 положительные Т-клетки, используя коммерчески доступные наборы для селекции CD4 и CD8. Объедините CD4-положительные и CD8-положительные Т-клетки в соотношении один к одному и инкубируйте 3 миллиона клеток на миллилитр в R10, дополненные 5 нанограммами на миллилитр каждого человеческого IL7 и человеческого IL15 в течение ночи при 37 градусах Цельсия.На следующий день подсчитайте Т-клетки и центрифугу от 5 до 10 миллионов клеток в 300 раз G в течение пяти минут. Откажитесь от всего супернатанта и промыть гранулы клеток в восстановленной сыворотке минимально необходимой среды. Повторно суспензируйте гранулу в 100 микролитрах раствора для ядерного поражения в соответствии с инструкциями производителя.Во время промывания клеток готовят рибонуклеопротеин, или комплекс RNP, путем инкубации 10 мкг нуклеазы Cas9 с 5 мкг одноповодной РНК в течение 10 минут при комнатной температуре. Включите макет управления без единой направляющей РНК. Объедините повторно взвешенные ячейки с комплексом RNP и добавьте 4,2 микролитра четырех микромолярных усилителей электропорации.Хорошо перемешать и переложить в электропорационные кюветы. Электропорировать клетки, используя импульсный код EH111, затем инкубировать 5 миллионов клеток на миллилитр в R10, дополненных 5 нанограммами на миллилитр человеческого IL7 и человеческим IL15 при 30 градусах Цельсия в течение 48 часов в 12 пластинах скважины. После инкубации приступайте к активации и расширению Т-клеток.Разработайте секвенирование грунтовок, введя последовательность ампликона ПЦР в стандартное программное обеспечение для проектирования грунтовок. Программное обеспечение для проектирования предложит несколько последовательностей праймеров, которые подходят для секвенирования Сэнгера. Выбирайте прямую и обратную праймеры, которые связывают с ампликоном не менее 150 пар оснований вверх или вниз по течению от участка разреза гРНК, чтобы обеспечить хорошее качество секвенирования вокруг инделей.Используйте анализ TIDE для определения эффективности нокаута на геномном уровне. Алгоритм точно реконструирует спектр инделей из трассировок последовательности и вычисляет значения квадрата R. После активации Т-клетки расширяют в культуре и криоконсервируют для будущих исследований.Во время расширения удвоение популяции и изменения объема отслеживаются по всему протоколу как для имитации, так и для отредактированных Т-клеток CAR. Никаких существенных изменений в распространении и активации во время расширения обнаружено не было. После того, как клетки были криоконсервированы, уровни экспрессии CAR были определены для дальнейших функциональных исследований как для макета отредактированных, так и для нокаутированных Т-клеток CAR.Существенных изменений не наблюдалось. Эффективность нокаута может быть определена с помощью нескольких методов. На этих репрезентативных участках проточной цитометрии локусы PDCD1 и TRAC были нацелены с использованием одной направляющей РНК, показав эффективность 90% для одноводной РНК PDCD1 и 98% для одноводной РНК TRAC у нескольких здоровых доноров.Важно убедиться, что молярные соотношения Cas9 и направляющих РНК являются точными. Во время процедуры клетки всегда должны храниться при четырех градусах Цельсия и не должны оставаться в растворе электропорации в течение длительных периодов времени. После сохранения CAR Сконструированные CRISPR Т-клетки CAR могут использоваться для функциональных анализов in vitro и in vivo, таких как анализы цитотоксичности, производство цитокинов и сингенетические или ксенографические модели опухолей мышей.Наш подход с использованием технологии CRISPR Cas9 в настоящее время применяется в клинических испытаниях. Подход может быть использован как при раке, так и при нераковых генетических нарушениях, таких как гемоглобинофии, которые затрагивают миллионы детей и взрослых во всем мире.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Рекомбинантный Ретровирусные Производство и Заражение В-клетки

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Вторжение клеток человека от бактериальных патогенов

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

Генерация индуцированного регуляторных Т клеток из первичной человека наивного и Т-клеток памяти

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

PiggyBac транспозонов модификации системы первичной Т-клетках человека

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Изоляция миелоидных дендритных клеток и эпителиальных клеток из человеческого тимуса

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Оценка Врожденная зондирование инфицированных ВИЧ-1 CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток плазмоцитов дендритных клеток с помощью<em&gt; Экс естественных</em&gt; Совместное культивирование системы.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Генерация человека Аллоантиген-специфических Т-клеток из периферической крови

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Генерация CAR Т-клеток в усыновители терапии в контексте глиобластомы стандарт медицинской помощи

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Роман фидер бесплатная система для массового производства мышиных естественных клеток-киллеров в пробирке

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Разработка и валидация сверхчувствительная одной молекулы массив цифровых энзим соединенный Assay иммуносорбента для человеческий интерферон α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...