Overvåking av protein-ligand interaksjoner i menneskelige celler ved sanntid kvantitativ in-cell NMR ved hjelp av en høy celletetthet bioreaktor

In-cell NMR spektroskopi gir en unik tilnærming til å studere proteinstruktur og funksjon direkte i levende celler og å overvåke biologisk relevante prosesser som protein-ligand interaksjoner. Denne NMR bioreaktoren kan holde et høyt antall humane celler levedyktige og metabolsk aktive i flere dager i spektrometeret, muliggjøre sanntids in-cell NMR-applikasjoner. Denne metoden kan brukes på ethvert løselig, fritt tumbling intracellulært protein som gjennomgår konformasjons- eller kjemiske endringer.

Isotopmerking utvider videre anvendelsen av metoden. For å begynne med, monter strømningsenheten ved hjelp av en annen strømningsenhet NMR-rør, som senere vil bli erstattet med den som inneholder celler. Se bruksanvisningen for strømningsenheten for riktig montering.

Sett vannbadet som er koblet til strømningsenhetens temperaturkontroll til 37 grader Celsius og plasser reservoarflasken i vannbadet. Koble reservoarflaskens FEP-slange til pumpen. Drei bioreaktorventilen for å omgå og forhåndsfylle pumpen med medium.

Drei deretter bioreaktorventilen for å strømme og forhåndsfylle bioreaktoren med mediet på 0,1 milliliter per minutt. Ta en T75-kolbe av transfekterte HEK 293 T-celler fra karbondioksidinkubatoren og fjern det brukte mediet. Tilsett to milliliter trypsin EDTA i cellene og inkuber i fem minutter ved romtemperatur for å løsne cellene.

Inaktiver trypsin med 20 milliliter komplett DMEM og re-suspender cellene grundig ved å pipettere opp og ned. Deretter overfører du dem i et 50 milliliter sentrifugerør. Sentrifuger cellene ved 800X G i fem minutter ved romtemperatur og kast supernatanten.

Overfør cellepelleten til et mikrocentrifugerør på 1,5 milliliter. For å legge inn cellene i agarosetråder, smelte en aliquot av størknet agarose ved 85 grader Celsius i en blokkvarmer, og hold den deretter i løsning ved 37 grader Celsius i blokkvarmeren. Med en Pasteur pipette, fyll bunnen av strømningsenheten NMR-rør med 60 til 70 mikroliter 1,5% agarose gel og legg den på is for å lage en fem millimeter høy bunnplugg.

Varm cellepellet i 15 til 20 sekunder i blokkvarmeren og re-suspendere cellene forsiktig i 450 mikroliter agaroseoppløsning, unngå dannelse av bobler. Aspirer cellen/agarose suspensjonen inn i en 30 centimeter lang kromatografi PEEK-rør med 0,75 millimeter indre diameter koblet til en sprøyte med en milliliter. La slangen avkjøles ved romtemperatur i to minutter.

Fyll strømningsenheten NMR-røret med 100 mikroliter PBS ved romtemperatur. Støpte tråder av celler innebygd i agarose i strømningsenheten NMR-rør ved å skyve sprøyten forsiktig. Fjern det tomme NMR-røret fra strømningsenheten og øk strømningshastigheten til to milliliter per minutt i noen minutter for å fjerne gjenværende gassbobler i innløpsslangen.

Sett strømningshastigheten på 0,2 milliliter per minutt og sett inn NMR-røret som inneholder cellene, ved å skyve det sakte, men jevnt oppover. Forsyne bioreaktormediet med en strømningshastighet på 0,1 milliliter per minutt. Still inn temperaturen i NMR-spektrometeret til 310 Kelvin og sett inn strømningsenheten i spektrometeret.

Når bioreaktoren er satt inn i NMR-spektrometeret, vent noen minutter for å tillate middels utveksling. Juster matchingen og justeringen av protonkanalen, shim magneten, og beregn proton 90-graders hard pulslengde. Juster protoneffektnivåene i hver pulssekvens i henhold til protonens harde puls.

Ta opp et første zgesgp proton NMR-spektrum for å registrere prøveinnholdet i felthomogenitet. Kopier zgesgp og p3919gp eller SOFAST-HMQC eksperimenter til ønsket nummer og legg dem i kø i oppkjøpskøen. Injiser en konsentrert løsning av det ytre molekylet til den mellomstore reservoarflasken ved å piercing silikonrørene med en steril, langnålsprøyte.

På slutten av NMR-eksperimentet erstatter du røret som inneholder cellene, med et tomt rør og skyll strømningsenheten med vann. For celler som uttrykker umerket karbonanhydrase, behandle p3919gp-spektra ved å bruke nullfyllende og eksponentiell linjeforsterkende vindusfunksjon. For celler som uttrykker nitrogen-15 merket, superoksid dismutase, behandle SOFAST-HMQC spektra ved å bruke null-fylling og kvadrert-skilt klokke vindu funksjon i begge dimensjoner.

I MATLAB importerer du spektralområdene ved hjelp av det egendefinerte skriptet Load_ascii_spectra. Kjør skriptet Load_acqus for å trekke ut tidsstemplene fra 1D-spektraet. Åpne MCR-ALS 2.0 GUI ved å kjøre mcr_main skript, og last inn spektramatrisen i kategorien Datavalg.

Kontroller dataene ved å tegne dem inn. Evaluer antall komponenter, enten ved entall verdinedbryting eller manuelt, og velg en metode for den første beregningen av det rene spektraet. Enten renest variabel deteksjon eller utviklende faktor analyse kan brukes.

Velg Fortsett i vinduet Valg av datasett. Angi begrensningene for konsentrasjonene i vinduet Begrensninger:radmodus. Bruk en ikke-negativitetsbetingelse, velg fnnls som implementering, og to som antall arter.

Deretter bruker du én lukkebetingelse, setter betingelsen til én, betingelsen for lukkingsbetingelsen er lik og gjelder for alle arter. Angi begrensningene for spektraet i vinduet Begrensninger:kolonnemodus. Bruk en ikke-negativitetsbetingelse, velg fnnls som implementering, og to som antall arter.

I det siste vinduet angir du 50 gjentakelser og et konvergensk kriterium på 0,01. Angi utdatanavnene for konsentrasjoner, spektra og standardavvik. Klikk fortsett for å kjøre MCR-ALS-armaturen.

Cellene i bioreaktoren kan opprettholdes levende i opptil 72 timer, som bekreftet av en trypan blå test. Bioreaktoren ble brukt til sanntidsovervåking av bindingen av to hemmere, acetazolamid og metazolamid til karbonanhydrase overekspressert i cytosolen til HEK 293 T-celler. Tilstedeværelsen av signaler fra det overekspresserte proteinet og felthomogeniteten ble vurdert med det første eksitasjons-sculpting protonspekteret.

Ved karbonanhydrase ble den intracellulære bindingen av de to inhibitorene overvåket ved å observere protonsignaler i regionen mellom 11 og 16 deler per million av WATERGATE-spekteret, som følge av sink-koordinerende histidiner og andre aromatiske rester. Vellykket binding ble bekreftet av utseendet på flere signaler. MCR-ALS ble brukt til å skille NMR-signalene som følge av fri og bundet karbonanhydrase, og for å gi de to artenes relative konsentrasjonsprofiler.

Bioreaktoren ble brukt til å overvåke dannelsen av sinkbundet superoksiddismutase intramolekylær disulfidbinding fremmet av ebselen, en glutathione peroksidase etterligning. MCR-ALS-analyse på utvalgte regioner i 2D-spekteret skilte signalene som oppstår fra de to artene og ga deres relative konsentrasjonsprofiler. Det er viktig å sette inn og fjerne strømningsenheten NMR-røret sakte og jevnt for å unngå trykkhopp som kan forårsake dannelse av bobler.

Utviklingen av NMR bioreaktorer har banet vei for å studere tidsavhengige prosesser for atomoppløsning, som plotting av reduxregulering og legemiddel-/målinteraksjoner i levende celler.