تهدف هذه الدراسات إلى توفير أنظمة نموذج قوية وقابلة للاستنساخ لإجراء دراسات توجيهية محددة للظهارة المعوية. يمكن أن تولد الأجهزة العضوية Apical بأعداد كبيرة وعقد الوعد لفحص الإنتاجية العالية. من الأسهل التلاعب بالطواهر الأحادية وتوفر الوصول إلى كل من الإشارات القاعدية والبازلية.
تأكد من أن حجم organoids هو 150 إلى 250 ميكرومتر في القطر قبل بدء بروتوكول الانعكاس. إزالة بعناية والتخلص من المتوسطة من كل بئر تحتوي على organoids دون تعطيل قبة ECM. إضافة ملليلتر واحد من الجليد الباردة حل الانفصال إلى كل بئر واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.
إزاحة القباب بعناية عن طريق الأنابيب ببطء مع طرف المغلفة، مع الحرص على عدم تعطيل وتفتيت organoids. نقل تعليق organoid إلى لوحة تعامل مع حل مكافحة الالتزام ووضع لوحة على شاكر في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة إزالة لوحة وماصة بلطف الحل صعودا وهبوطا باستخدام طرف ماصة ملليلتر واحد المغلفة مع حل مكافحة الالتزام.
ضع الطبق على شاكر في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى. إزالة لوحة والسماح لل organoids تسوية بالجاذبية لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. بعد تسوية organoids، وإزالة أكبر قدر ممكن من محلول الانفصال وغسلها عن طريق إضافة 1.5 ملليلتر من DMEM F-12.
السماح لل organoids إلى الرواسب وإزالة supernatant. ثم كرر الغسيل. إزالة أكبر قدر من DMEM F-12 ممكن وإضافة 0.5 ملليلتر من الأمعاء الجهازية توسيع المتوسطة.
احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي إجراء تغيير متوسط جزئي عن طريق إمالة لوحة في زاوية 25 إلى 30 درجة وإزالة المتوسطة على طول جدار البئر مع الحرص على عدم إزالة organoids المعلقة. إضافة 0.4 ملليلتر من الأمعاء الجهازية توسيع المتوسطة واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام.
إذا شكلت المجاميع استخدام طرف ماصة ملليلتر واحد المغلفة مع حل مكافحة أتباع لقص المجاميع عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 20 مرة أثناء الضغط على نهاية الطرف إلى أسفل لوحة. إضافة ملليلتر واحد من 0.05٪ تريبسين-EDTA قبل الحارة إلى organoids resuspend. وتخلط جيدا لضمان تعليق حتى.
إضافة ما يصل إلى ملليلتر واحد إضافية من تريبسين-EDTA لعدد كبير من الخلايا، أو إذا كان لا يزال كمية كبيرة من ECM. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى 10 دقائق، ثم تخلط جيدا مع ماصة ملليلتر واحد لتعطيل organoids بحيث انهم فصل تماما في خلايا واحدة أو شظايا صغيرة. نأي الشظايا تماما أو الأجهزة العضوية الكاملة مواصلة الحضانة مع تريبسين-EDTA في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق أخرى.
مرة واحدة يتم فصل الأجهزة بما فيه الكفاية إضافة حجم متساو من DMEM F-12 وماصة صعودا وهبوطا لخلط جيدا. تعطيل تريبسين-EDTA بإضافة 10٪ FBS إلى الخلايا. شظايا الطرد المركزي في 200 مرة G لمدة خمس دقائق في درجتين إلى ثماني درجات مئوية.
إذا فشلت الأجهزة العضوية المفككة في خلط الخلايا بدقة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا والطرد المركزي لهم مرة أخرى. إزالة بعناية أكبر قدر ممكن من supernatant. ترك فقط بيليه الخلية.
Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من التمايز الجهازي المعوي المتوسطة لكل بئر لتكون البذور. ضبط مستوى الصوت بشكل مناسب لأحجام الآبار الكبيرة أو الأصغر. إزالة لوحات المغلفة من الحاضنة وإزالة محلول مصفوفة غشاء الطابق السفلي الزائدة من كل بئر.
إضافة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى البئر العلوي من كل إدراج ثقافة الخلية و 500 ميكرولتر من التمايز الجهازي المعوي المتوسطة إلى أسفل البئر. ثم تحتضن في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. استبدل الوسط في كل من الآبار العليا والسفلى كل يومين إلى ثلاثة أيام.
لإنشاء ثقافة ALI إزالة المتوسطة من الآبار العليا والسفلى، وإضافة التمايز العضوي المعوي الطازجة المتوسطة إلى البئر السفلي ترك البئر العلوي فارغة. أظهرت الأجهزة العضوية المعوية المستزرعة مع متوسط التوسع العضوي المعوي مورفولوجيا كيسية. عندما تتم إزالة ECM بعض organoids تميل إلى تجميع خلال الأيام الثلاثة الأولى وتحتاج إلى أن تكون محض في زيادة عدد organoid.
واصلت الأجهزة العضوية المعوية المستزرعة في ECM التوسع وإظهار التكوين التلقائي للهياكل الناشئة الثانوية. الأجهزة العضوية التي تم الحفاظ عليها لمدة خمسة أيام في غياب مصفوفة خارج الخلية أظهرت أشكال ممدودة وكيسية وغير منتظمة. تم الكشف عن التعبير عن علامات غير نمطية، مثل فيرلين وZO-1 الجانب الخارجي من الظهارة التي تعرضت للوسط.
ECM جزءا لا يتجزأ من organoids ملطخة النوى، فيلين، وZO-1 مما يدل على قطبية القاعدية apical حيث كان الجانب apical تواجه التجويف من organoid. مرة واحدة تم تأسيس monolayer الخلايا شكلت تقاطعات ضيقة وطبقة التقاء. طبقة التقاء توجه أيضا فيلين التي تحتوي على الحدود فرشاة نحو الجانب apical من الظهارة، وتشكيل مجمعات البروتين متعددة ZO-1 بين الخلايا.
أدى الانتقال إلى ثقافة ALI إلى مزيد من التمايز مع خلايا الكؤوس الأكثر بروزا التي تم تصورها عن طريق تلطيخ بروتين الموسين المفرز MUC2 للحث على انقلاب القطبية ، فمن الأهمية بمكان إزالة جميع ECM دون تعطيل أو تجزئة الأعضاء العضوية. وينبغي أيضا أن يتم إجراء تغييرات وسائل الإعلام بعناية وذلك لتجنب إزالة أي من organoids المعلقة. ضمان وجود خلايا واحدة كافية لإنشاء ثقافة أحادية الطبقة هو محدد رئيسي لجودتها.
وظائف apical محددة مثل امتصاص المواد الغذائية أو التفاعلات مسببات الأمراض المضيفة يمكن الآن درس في النظم ذات الصلة التي تناسب احتياجات الباحثين.
